PCR biologia moleculaR

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Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)
DNA
Cadeia Primária
CCGAATGGGATGC
Cadeia Complementar
GGCTTACCCTACG
DNA
Existem 2 métodos para amplificar ou fazer cópias de DNA:
Clonagem - demora um longo tempo para os clones atingirem a maturidade
PCR - trabalha em até uma única molécula rapidamente
www.ambion.com
www.bio-rad.com 
A tecnologia PCR permite que os cientistas peguem a amostra de um material genético, até mesmo de uma célula, copiem a sequência deste material genético várias vezes e gere uma amostra suficiente para detectar a presença ou ausência de um vírus específico, de uma bactéria ou qualquer sequência de um material genético
Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
http://www.google.com/imgres
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
www.gene-quantification.info
Reação de Polimerização em Cadeia
PROCEDIMENTOS
1º: Extração do material genético
 DNA ou RNA, RT-PCR
2º: Adição do pré mix (solução tampão)
3º: Termociclador (aquecimento e resfriamento)
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
HISTÓRICO:
Isolamento de enzimas de restrição (1970)
  Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978:
 Werner Arber – Suiço (1931)
 Daniel Nathans (1928-1999) – EUA Elucidação do mecanismo de ação
 Hamilton Smith (1931) – EUA
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
SINONIMIA 
Enzimas/Endonucleases de restrição
ORIGEM
Bacteriana
 
FUNÇÃO:
- Proteção Bacteriana
 - Mapeamento genético 
(vírus, bactérias etc)
↓
Avanço na Biologia Molecular
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
MODO DE FUNCIONAMENTO:
Proteção bacteriana (Sistema de restrição modificação)
 - Bactérias X Bacteriófagos (vírus)
 
As bactérias possuem mecanismos que impedem a ação das suas enzimas de restrição contra o seu próprio DNA
Centenas dessas enzimas, são purificadas e comercializadas por diversos laboratórios no mundo.
Pontas adesivas
(Podem se ligar a outras pontas de DNA)
MODO DE FUNCIONAMENTO:
 
 
Reconhece seqüências nucleotídicas específicas (sítios de restrição)
Permite cortar moléculas de DNA
Divide o DNA em segmentos (fragmentos de restrição com pontas adesivas)
 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
MODO DE FUNCIONAMENTO:
 
ENGENHARIA GENÉTICA
Fragmentos de DNA
↓
Novas moléculas DNA 
 (in vitro)
Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da seqüência GAATTC 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
TIPOS:
Mais de 100 diferentes tipos de enzimas
Sequência
 reconhecida
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Etapas do Procedimento
Desnaturação
Primeira etapa do processo
As cadeias de DNA são separadas pelo aquecimento a 95 graus
As ligações de hidrogênio se rompem
Duração 1 minuto
Etapas do Procedimento
Anelamento
Segunda etapa do processo
Ocorre a formação de pontes de hidrogênio
O anelamento da sequência alvo e o primer ocorre após resfriamento a 55 graus
Duração 45 segundos
Etapas do Procedimento
Alongamento
Taq Polimerase se liga ao DNA template e começa a adicionar nucleotídeos
Reação ocorre a 72 graus
Duração 1 a 2 minutos
Taq DNA Polymerase
Enzima capaz de suportar altas temperaturas
Taq- Thermus aquaticus, bactéria descoberta nas fontes termais da Floresta Nacional Yellow Stone
www.wikipedia.com/taqpolymerase
Reação de Polimerização em Cadeia
PROCEDIMENTOS
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
Reação de Polimerização em Cadeia
PRIMER/ INICIADOR
SELEÇÃO DE PRIMERS
Sintetizados quimicamente
15 a 25 bases 
Define limites de alvo a amplificar
Serve como ponto de início para a replicação
Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás)
Reação de Polimerização em Cadeia
PRIMER/ INICIADOR
SELEÇÃO DE PRIMERS
Banco de Dados
International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org)
GenBank (NCBI, NIH)
European Molecular Biology Laborstory (EMBL)
DNA DataBank of Japan (DDBJ)
Reação de Polimerização em Cadeia
www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
PROBLEMAS COM O PRIMER
Deve atingir sequência de interesse
Primers que coincidem com multiplas sequências podem gerar multiplos produtos
Podem se auto-complementar e fazer ligação com outro primer (hairpin)
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
Reação de Polimerização em Cadeia
VARIAÇÕES DA TÉCNICA BASICA DE PCR
 RAPD 
 PCR-RFLP
 Multiplex PCR
 Nested-PCR
 Hot start
 Inverse PCR
 Colony PCR
 Allele specific PCR
 PCR em tempo real
Reação de Polimerização em Cadeia
Amplificação do DNA mediante o PCR 
25 a 40 ciclos para cada reação
 Taxa de replicação: 2ciclos
Reação de Polimerização em Cadeia
www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
Reação de Polimerização em Cadeia
Como analisar os resultados da PCR
Eletroforese
 Separar os fragmentos por tamanho, pois a reação gera fragmentos com a mesma extensão
/www.roche-applied-science.com/techresources/index.jsp
Bandas geradas pela amplificação de 5 diferentes receptores de membrana de macrófagos de camundongo (Lanes 2 a 6)
Reação de Polimerização em Cadeia
Como analisar os resultados da PCR
PCR TRADICIONAL
(GÉIS DE AGAROSE)
Desvantagens
 Pobre precisão
 Baixa sensibilidade
 Baixa resolução
 Não automatizado
 Discriminação baseado no tamanho do fragmento
 Resultados não são expressos em números
 Colorações não são muito quantitativas
 Pós-processamento do produto da PCR
 Contaminação
SISTEMA TEMPO REAL
Sistema óptico
Termociclador
Hardware
Software
Fluoróforos
REAL TIME PCR
PCR EM TEMPO REAL
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
REAL TIME PCR
Vantagens
 Detecta e quantifica, em tempo real, ácidos nucléicos enquanto são amplificados
 Ciclos mais rápidos
 MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL
 Não é muito mais caro que a PCR convencional 
 - Exceção: preço do equipamento
Desvantagens
Requer alta habilidade técnica e suporte
 Alto custo do equipamento
PCR EM TEMPO REAL
SYBR® Green 
TaqMan®
REAL TIME PCR
PCR EM TEMPO REAL
A química utilizada na PCR em Tempo Real permite a detecção de um determinado fragmento durante a sua amplificação, já nas primeiras etapas da reação
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
REAL TIME PCR
PCR EM TEMPO REAL
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
PCR CONVENCIONAL(GÉIS DE AGAROSE) x PCR EM TEMPO REAL
www.gene-quantification.info
REAL TIME PCR
www.youtube.com/pcrrealfluor=9C98Ub4vmt0
www.youtube.com/watch?v=9C98Ub4vmt0
OBRIGADO
Limitações da PCR
Necessita de informações sobre a sequancia de DNA alvo
 Desing de primers
 As ligações nas regiões de DNA a ser amplificada deve ser conhecida
Tamanho pequeno limitando a quantidade de produtos da PCR
Até 5kb pode ser facilmente amplificada
Até 40kb pode ser amplificada com algumas modificações
Não pode amplificar genes > 100kb
Alberts et, Molecular Biology of the Cells, Garland Science, 4th ed, 2002
Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman & Co., 4th ed., 2000
Cooper et al, The Cell- A molecular Approach, Sinauer Publishers, 2nd ed., 2000
Dewar R, Goldstein D, Maldarelli F. Diagnosis of human immunodeficiency virus infection. In: Mandell GL, Bennett GE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; 2009:chap 119.
Sax PE, Walker BD. Immunopathogenesis of human immunodeficiency infection. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier; 2007:chap 408.
Guatelli JC, Gingeras
TR, Richman DD (1 April 1989). "Nucleic acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infection". Clin. Microbiol. Rev. 2 (2): 217–26.
www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html PMC 358112. PMID 2650862.
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
www.labimuno.org.br
www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
www.wikipedia.com/taqpolymerase
REFERÊNCIAS
O dna eh uma dupla fita constituida por nucleotideos
A+ T – duas pontes de hidrogênio
G+C – tres pontes de hidrogenio
cadeia pr
O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980. Em 1985 ele introduziu o PCR para a comunidae científica e a Cetus Corporation, empresa na qual ele trabalaha recompensou-o com $10.000 pela invenção.
Em 1989, a Cetus vendeu a patente para a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation por $300 milhões
Posteriormente, em 1993, foi atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
Aplicações
O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. 
O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como 
Também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc 
O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.
PCR-based tests are able to detect the presence of pathogenic agents earlier than serologically-based methods, as patients can take weeks to develop antibodies against an infectious agent. Earlier detection of infection can mean earlier treatment and an earlier return to good health
método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
É uma técnica utilizada em Biologia Molecular que permite a "amplificação" ou multiplicação exponencial de segmentos de DNA, facilitando sua análise, posteriormente realizada através de géis de agarose ou poliacrilamida ou de sistemas automatizados que geram sinais gráficos.
Os segmentos que estão sendo estudados são flanqueados através de outros segmentos menores que iniciam a reação e são chamados de iniciadores ou "primers".
-- 
ELETROFORESE
O fenômeno denominado Eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948.
Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente
Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).
Primer: segmentos menores que iniciam a reação e rodeiam os segmentos que estão sendo estudados
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC
Concentração de Mg2+ afeta:
anelamento dos primers
temperatura de desnaturação do DNA molde e dos produtos amplificados
Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).
Primer: segmentos menores que iniciam a reação e rodeiam os segmentos que estão sendo estudados
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC
Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).
Procedimentos
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de
reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC
Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2ciclos
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. 
1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a seqüência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfrimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 
5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementariendade, formando assim uma nova fita dupla.
Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/enzimasderestricao.php
http://www.saberweb.com.br/genetica/pcr.htm
 PCR
A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento da enzimas de restrição. Estas enzimas são endonucleases, ou seja, no interior (daí o prefixo endo- dentro) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos.
Além de evidenciar a existência de um novo sistema de defesa bacteriana e da complexa interação entre bactéria e vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978.
Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes.
Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano.
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
[editar] Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição.
Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
[editar] Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição.
Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de seqüências nucleotídicas específicas. 
São enzimas bacterianas
Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases
Chamadas enzimas (ou endonucleases) de restrição, elas cortam a molécula em regiões específicas e dividem o DNA em segmentos. As bactérias possuem mecanismos que impedem a ação das suas enzimas de restrição contra o seu próprio DNA. 
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das
pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defende-las de vírus invasores. 
Estas enzimas funcionam nas células bacterianas como parte de um mecanismo de protecção ao ataque de bacteriófagos chamado sistema de restrição modificação.[1] Uma molécula de DNA viral que continha sítios para uma endonuclease bacteriana, ao ser injetada na bactéria, é prontamente cortada nesses pontos e deixa de funcionar. O DNA da própria célula bacteriana é protegido por metilação. Hoje são conhecidas centenas dessas enzimas, que são purificadas e comercializadas por diversos laboratórios no mundo.
O local do “corte”, o local de uma enzima, é conhecido como sítio alvo. Você pode perguntar porque essa enzima não atua no DNA da própria bactéria? Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria
Elas são altamente específicas: cada tipo de enzima reconhece e corta apenas uma determinada seqüência de nucleotídeo, em geral constituída por 4 ou 6 pares de bases nitrogenadas.
Além de evidenciar a existência de um novo sistema de defesa bacteriana e da complexa interação entre bactéria e vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978.
Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes.
Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano.
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
[editar] Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição.
Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
[editar] Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição.
Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
Elas são, em geral constituída por 4 ou 6 pares de bases nitrogenadas. altamente específicas: cada tipo de enzima reconhece e corta apenas uma determinada seqüência de nucleotídeo
Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos, levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas, que podem se ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima. 
Moléculas idênticas de DNA tratadas com determinada endonuclease de restrição são cortadas nos mesmos pontos, originando fragmento de tamanho idênticos. Por exemplo, no primeiro estudo com endonuclease de restrição, realizado em 1971, o virologista Daniel Nathans e uma de suas estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA do vírus SV40 com a enzima Hind II e obtiveram 11 tipos de fragmentos, que diferiam em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma molécula circular, conclui-se que ela foi cortada em 11 locais; o tamanho de cada fragmento correspondia à distância entre dois sítios de corte adjacentes.
Uma endonuclease de restrição é como uma ferramenta que permite cortar moléculas de DNA de forma controlada e reprodutível. Diversos pesquisadores passaram a utilizar a nova técnica para mapear o genoma de outros vírus, depois de bactérias e de outros organismos, lançando as bases para a Engenharia Genética e, em seguida para o Projeto Genoma Humano.
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, ao invés de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.[2]
Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Puramente por acaso, qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas
localizações dos sítios de restrição.
Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
Em Engenharia Genética, a obtenção dos fragmentos de DNA serve para criar, in vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório), novas moléculas, recortando e colando vários pedaços de informações
As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre seqüências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento (ver imagem).
Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da seqüência GAATTC ao longo de toda sua extensão. Portanto ao contato com a ezima EcoRI a fita de DNA pode ser clivada "cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes. 
Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a EcoRI, produzida pela bactéria Escherichia coli. Essa enzima reconhece apenas a seqüência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A. 
Desde de sua identificação, em 1970, mais de 100 diferentes tipos de enzimas de restrição bacterianas foram identificados. A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da bactéria que a produz.Por exemplo a enzima EcoRI, veja no box.
O primer serve como ancora para a taq polimerese e ação da polimerase depende da hidroxila que está no primer se não não haveria polimerisacao dos nucleotideos. Os nucleotideos são ligados uns aos outros.
Fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da seqüência de DNA que se quer multiplicar.  Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura) 
Dna polimerase pega os nucleotideos e eh incorporado à fita
• Atividade se mantém após exposição ao calor
DNA polimerase termo estável
suporta elevadas 
encontrada em fontes termais (80 graus) 
http://ldmvet.com.br/fotos.html#
são oliginucleotideos, que é um fragmento curto da cadeia de DNA geralmente 20 beses.
Utilizados para amplificar as sequencias de DNA
método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
É uma técnica utilizada em Biologia Molecular que permite a "amplificação" ou multiplicação exponencial de segmentos de DNA, facilitando sua análise, posteriormente realizada através de géis de agarose ou poliacrilamida ou de sistemas automatizados que geram sinais gráficos.
Os segmentos que estão sendo estudados são flanqueados através de outros segmentos menores que iniciam a reação e são chamados de iniciadores ou "primers".
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ELETROFORESE
O fenômeno denominado Eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948.
Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído. Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente
1. primer q amplifica mtas coisas pai mae e filho - exame de dna
2. pcr e uma digestao: faz pcr depois digestao por enxima de restricao...gera padrao de bandas e sabe qm eh filho de qm 
fragmento ou amplicon
multiplex qdo uso dois primer entao terá duas bandas
rna so tem informacao p codificar ptn...vai verificar se a celula produz akela proteina
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC
Primeira Etapa:
As duplas fitas de DNA que estão unidas através de fracas ligações chamadas pontes de hidrogênio, são separadas por um aumento da temperatura.
  
Segunda Etapa:
Os primers se anelizam à regiões homólogas do DNA da fita mãe.
Se não houver regiões homólogas, eles não se anelizarão e não ocorrerá a formação de uma nova fita.
Portanto, não haverá amplificação de DNA, não ocorrendo o aparecimento da banda correspondente em gel de agarose e poliacrilamida ou do sinal gráfico no eletroferograma em sistemas automatizados.
Terceira Etapa:
Uma enzima termoestável chamada Taq DNA Polymerase age fixando os nucleotídeos na fita complementar que vai ser formada a partir da fita molde.
Desta maneira, no primeiro ciclo irão se formar quatro fitas a partir das duas primeiras; no segundo ciclo irão se formar oito fitas, e assim por diante. Ao final de trinta e seis ciclos, teremos uma quantidade de fitas de DNA da ordem de 2 ou 137.438.973.472 de fitas a partir das duas primeiras.
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O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento/resfriamento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de DNA.
Procedimentos
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura
(também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2ciclos
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
1. primer q amplifica mtas coisas pai mae e filho - exame de dna
2. pcr e uma digestao: faz pcr depois digestao por enxima de restricao...gera padrao de bandas e sabe qm eh filho de qm 
fragmento ou amplicon
multiplex qdo uso dois primer entao terá duas bandas
rna so tem informacao p codificar ptn...vai verificar se a celula produz akela proteina
 A lane L indica o padrão de peso molecular e a 1 indica o a banda controle, resultado da 
amplificação do gene da β-actina. Como a banda controle está nítida, o resultados 
das reações para a detecção dos receptores foram considerados positivos, pois 
além das bandas estarem presentes no gel, o controle mostra-se positivo também, 
confirmando os resultados.
Este gel mostra produtos da amplificação dos mesmos receptores da figura acima. 
O controle também está presente, o que indica a fidelidade da reação. Neste caso, 
a amostra 2 foi considerada negativa para a PCR. 
* Pobre precisão
* Baixa sensitividade
* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)
* Baixa resolução
Não automatizado
Resultados não são expressos em números
* Colorações não são muito quantitativas
* Pós-processamento do produto da PCR
* Contaminação (brometo)
Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento
http://www.publicacoesweinmann.com.br/2009/04/pcr-quantitativo-em-tempo-real.html
http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/bio33.pdf
O método determina a
quantidade inicial de um produto
(DNA/RNA) através do comportamento
da cinética de amplificação das
diferentes fases ao longo dos ciclos de
uma PCR, ou seja, detecta e quantifica, em
tempo real, ácidos nucléicos enquanto são
amplificados, sem a necessidade de realizar
purificação e análises adicionais.
Atualmente, o uso da PCR por tempo real (Real Time) incorpora a
detecção de sinais enquanto ocorre a amplificação. Para isso, utilizam-se
oligonucleotídeos e sondas específicas que emitem fluorescência a cada
hibridização e a cada passo de amplificação. Por detectar regiões
específicas, essa técnica permite uma rápida e precisa quantificação de
organismos infecciosos ou seqüências transgênicas. Este novo conceito
eliminou todas as fases de análise pós-PCR . O software associado ao
método garante precisão a partir de limiares muito baixos de detecção. Taqman é uma sonda que se liga entre os primers, que quando a taq polimerase passa quebra a sonda e tira a uniao do reporter com o quencher...
o reporter sempre transmite fluorescencia e o quencher absover, quando eles perdem esta uniao o reporter fica dissossiado na solucao emitindo a fluorescencia
O Sybr Green, ele se liga onde tiver pontes de hidrogenio..., qualquer dupla fica ele ta emitindo fluorescencia por isso e inespecifica... por que ligacao primer DNA emite fluorescencia.. entao e necessario voce fazer uma curva de melting para analisar o resultado
certo quando voce tem a temperatura de desnaturação as fitas de DNA se separam por causa do aumento da temperatura e as pontes de hidrogenio se rompem certo
quando voce amplifica algo com o SYBR voce precisa depois aumentar a temperatura e ver qual temperatura todas as pontes de hidrogenio quebram... e o SYBR fica dissossiado... "se nao tem mais ponte nao tem mais fluorescencia"
 se tiver um pico unico significa que todo produto de PCR gerado é especifico por que em um temperatura so a fluorescencia saiu
 entendeu
A masa e a porosidade do gel vai influenciar na migracao do dna para o polo positivo
Gel pouco concentrado eh muito poroso e as moleculas grandes correm mais facilemnte
Qdo o gel eh mto concentrado ele eh pouco poroso porem as menores correm muito bem
Dependendo do tamanho da banda o gel não pode ser mto nem pouco poroso
A masa e a porosidade do gel vai influenciar na migracao do dna para o polo positivo
Gel pouco concentrado eh muito poroso e as moleculas grandes correm mais facilemnte
Qdo o gel eh mto concentrado ele eh pouco poroso porem as menores correm muito bem
Dependendo do tamanho da banda o gel não pode ser mto nem pouco poroso