PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE

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PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE
HEMILLY RAYANNE F. SILVA
Universidade de Pernambuco – UPE
Laboratório de Resistência Microbiana- LRM
HISTÓRICO
1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis;
1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo;
1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.
O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE?
 
OBJETIVO DA PCR
 É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro.
COMO É FEITO?
 Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético(DNA) da célula ou outro material a ser estudado.
COMO É FEITO?
 
REAGENTES PARA A REAÇÃO
DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade; 
SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições da reação; 
REAGENTES PARA A REAÇÃO
MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima;
dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
REAGENTES PARA A REAÇÃO
COMO ESCOLHER O PRIMER?
PRIMER/INICIADOR
Sintetizados quimicamente;
15 a 25 bases ;
Define limites alvo a amplificar;
Serve como ponto de início para a replicação;
Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas direções (para frente e para trás);
Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database (www.insdc.org)
GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
COMO É FEITO?
 Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina termocicladora que possui como função fazer ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para as reações seguintes da análise.
COMO É FEITO?
 
ETAPAS DO CICLO
1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio.
92C
3’
5’
3’
5’
+
5’
3’
5’
3’
ETAPAS DO CICLO
2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.
5’
3’
5’
3’
Forward primer
Reverse primer
ETAPAS DO CICLO
3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.
PRODUTO FINAL DA PCR
DNA primeira copia
PCR
DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR
 Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.
PCR
PONTOS IMPORTANTES PARA O BOM FUNCIONAMENTO DA PCR
PONTOS IMPORTANTES:
Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado;
A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração do produto.
PONTOS IMPORTANTES:
Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conter iniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas dentro do molde;
A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para uma PCR ótima;
Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientemente amplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia no resultado da reação.
PCR
APARECIMENTO DE BANDAS INESPECÍFICAS NA PCR O QUE FAZER?
SUGESTÃO
Reduza a quantidade de DNA;
Diminuir o tempo de anelamento da reação;
Aumente a temperatura de anelamento;
Reduza a concentração da enzima;
Reduza a concentração de Mg²⁺;
Aumento do tempo de desnaturação;
Aumento da temperatura de desnaturação;
Reduza o tempo de extensão;
Reveja os desenhos dos primers.
BANDAS INESPECÍFICAS
PCR
A REAÇÃO ESTAVA FUNCIONANDO ANTES, MAS AGORA EU NÃO OBTENHO NENHUM PRODUTO. O QUE FAZER?
SUGESTÃO
Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);
 Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);
 Utilize um estoque novo de primers;
Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.
VANTAGENS DA TÉCNICA
Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA;
 Rápida;
De baixo custo;
LIMITAÇÕES
Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos;
Facilidade de contaminação da amostra;
Extensão limitada da sequência a se amplificar;
Limitada extensão da sequência;
Incorporação errônea de bases durante a replicação.
PRINCIPAIS USO DA PCR