Exames de imunodiagnóstico

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RENAN BITTENCOURT MAIA  3° PERIODO  FACULDADE DE MEDICINA ESTÁCIO DE SÁ  CAMPUS ARCOS DA LAPA 
 
 
 
 
 
 
 
EXAMES DE IMUNODIAGNÓSTICO 
INTRODUÇÃO 
 Testes Sorológicos: 
Baseados na ligação antígeno-anticorpo 
Métodos: 
Direto 
Indireto 
Buscar ANTÍGENO, ANTICORPO, IMUNOCOMPLEXOS (ou PATÓGENO e seus PRODUTOS) 
Suprem métodos PARASITOLÓGICOS, MICROBIOLÓGICOS 
Quando se busca anticorpo? 
Processos patológicos (Diferenciar patologias por apresentar sinais clínicos semelhantes) 
Diferenciar fase da doença 
Diagnóstico de doença congênita 
Selecionar doadores de sangue 
 Selecionar doadores e receptores de transplantes 
 Selecionar doadores e receptores de transplantes 
 Avaliar prognóstico de doença 
 Eficácia e suspensão terapêutica 
 Avaliar imunidade específica, adquirida por contato com patógeno ou vacina 
Vantagens: 
1-Métodos rápidos e simples na execução 
2-Relativamente baratos 
3-Alta sensibilidade (afinidade e especificidade do anticorpo) 
4-Possibilidade de automação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Disciplina: SISTEMA IMUNOLÓGICO 
Professor: ANA CRISTINA 
Resumo: EXAMES DE IMUNODIAGNÓSTICO 
Professor 
Resumo: 
 
RENAN BITTENCOURT MAIA  3° PERIODO  FACULDADE DE MEDICINA ESTÁCIO DE SÁ  CAMPUS ARCOS DA LAPA 
 Tipos de Exames Sorológicos: 
1)IMUNOFLUORESCÊNCIA: 
Permite identificar se um tecido tem o patógeno ou o anticorpo. 
Utiliza material líquido (secreção, líquor, soro) ou tecido (in situ-Biópsia) 
 A Ferramenta Imunológica dessa técnica também são anticorpos ligados a uma molécula com capacidade de 
fluorescência, o fluorócromo ou fluoróforo, substâncias que recebem excitação por feixes luminosos de 
determinado comprimento de onda e passam a emitir luz de comprimento de onda maior. 
Tipos: 
Direta ou Técnica de camada simples: Utilização de anticorpos ligados DIRETAMENTE às sondas 
fluorescentes, e esse anticorpo se ligará ao antígeno gerando fluorescência. Essa técnica é usada para 
detecção de ANTÍGENOS. 
Técnica: Produz-se uma lâmina com material coletado. Deixa o material aderir e lava-se a lâmina. 
Introduz-se o anticorpo específico marcado com o fluocromo, escolhido de acordo com a suspeita 
clínica ou de imagem, espera-se o tempo para que age ligação. Lava-se novamente a lâmina para 
retirar anticorpos que não ligaram. Leva-se para o microscópio de fluorescência, que gera um feixe 
de luz, que excita a sonda gerando a fluorescência, captando essa luz, e então a imagem é formada. 
 
 
 
 
 
 
Indireta ou Técnica de camada dupla: Utilização de ANTICORPOS LIGADOS/CONJUGADOS ÀS SONDAS e 
também ANTICORPOS LIGADOS/NÃO CONJUGADOS. De forma que o anticorpo específico (VERDE) para o 
antígeno (LARANJA) é colocado, se ligará ao antígeno fixado, aderindo-se a lâmina. A partir daí anticorpos 
contra o anticorpo específico (AZUL ESCURO), conjugados à sonda de fluorescência irão se ligar ao 
anticorpo especifico, gerando fluorescência. Essa técnica é usada geralmente para detecção de 
ANTICORPO. Usado como teste confirmatório para HIV (usa-se também o Western Blot, porém a 
imunoflorescência é mais barata e mais rápida). 
Técnica: Produz-se uma lâmina com antígeno, e esse antígeno irá ser fixado com um fixador. Lava-
se a lâmina para retirar o que não fixou. Adiciona-se o soro do paciente e espera-se um tempo para 
incubação. Lava-se novamente. Adiciona-se, então, o anticorpo contra o anticorpo do paciente (anti 
IgG ou IgM ou Ig- anticorpo contra região Fc) conjugado à sonda fluorescente. Aguarda e lava-se para 
retirar os anticorpos que não se ligaram. Leva-se para o microscópio de fluorescência, que gera um 
feixe de luz, que excita a sonda gerando a fluorescência, captando essa luz, e então a imagem é 
formada. 
 
 
 
 
 
 
 
LÂMINA COM TECIDO OU ESFRAGAÇO COM ANTÍGENO LÂMINA COM TECIDO OU ESFRAGAÇO COM ANTÍGENO 
2° camada 
1° camada 
LÂMINA COM TECIDO OU ESFRAGAÇO COM ANTÍGENO LÂMINA COM TECIDO OU ESFRAGAÇO COM ANTÍGENO LÂMINA COM TECIDO OU ESFRAGAÇO COM ANTÍGENO 
 
RENAN BITTENCOURT MAIA  3° PERIODO  FACULDADE DE MEDICINA ESTÁCIO DE SÁ  CAMPUS ARCOS DA LAPA 
2)CITOMETRIA DE FLUXO ou FACCS: 
 A Ferramenta Imunológica dessa técnica também são anticorpos ligados a uma molécula com capacidade de 
fluorescência. 
Técnica utilizada para identificar, quantificar, separar em tubos diferentes e analisar/caracterizar as células, tudo 
isso é feito através dos antígenos de membrana dessas células (Viva ou não). Podendo ser T CD4+ circulante, TCD8. 
Realizada a coleta e a centrifugação do sangue e se pega a parte CELULAR do sangue, que fica embaixo. 
 São produzidos Anticorpos para as moléculas que quiser (CD3, CD4, CD8). 
 Incuba-se a célula do paciente com o anticorpo Anti-CD3, Anti-CD4 ou Anti-CD8 que está marcado com fluorescência 
de cores diferentes. 
Essas células vão passar pelo tubo, por gotejamento, e o sensor libera 1 célula por vez. Ao passar, a célula passa 
por um laser que excita o fluoróforo, emitindo cor e um filtro irá captar essa mensagem e vai separando-as. O 
citometro vai detectar a fluorescência e vai computar o número de células que tem a molécula ligada ao anticorpo 
(Ele também detecta o tamanho e a granulosidade da célula, mas não tem nada a ver com os marcadores). 
OBS: Se não tiver a molécula expressa o equipamento não “enxerga” a célula porque ele detecta a Fluorescência 
do Anticorpo anti-molécula. Assim, no gráfico, essas moléculas vão ser os pontinhos próximos ao Zero. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3)ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): 
Técnica Imunoenzimática utilizada para detecção de ANTICORPO (no soro) ou ANTÍGENO, para verificar se o 
indivíduo está ou se já esteve infectado, identificando quanto de Antígeno (ELISA DIRETO) ou de Anticorpo (ELISA 
INDIRETO) que ele tem no sangue. 
A Ferramenta Imunológica dessa 
técnica é o Anticorpo ligado à Enzima. O 
anticorpo será marcado com uma 
enzima na porção amina (Fosfatase 
alcalina, peroxidase ou ß galactosidase) 
Essa técnica é muito usada no 
diagnóstico do HIV, mas também usada 
para outras doenças e para ver se a 
vacina deu certo. 
É uma técnica de baixo custo e para ser 
realizada são usadas placas com poços e nele são realizadas reações. 
É uma técnica colorimétrica, quanto mais corado, maior a concentração no poço 
4 
3 
2 
1 
0 
CD4 
CD8 DUPLO NEGATIVO 
DUPLO POSITIVO 
SÓ CD8 
SÓ CD4 
 
RENAN BITTENCOURT MAIA  3° PERIODO  FACULDADE DE MEDICINA ESTÁCIO DE SÁ  CAMPUS ARCOS DA LAPA 
Tipos: 
EXEMPLO: Indivíduo suspeita de HIV 
 Indireto: 
Técnica: 
Primeiro é feita a Coleta de Sangue do paciente, que é centrifugado, pegando o plasma, que é onde 
está o anticorpo, podendo ser dosada também a célula de memória. 
No poço da placa de poliestireno é colocado o antígeno, no caso foi usado GP120 que é uma proteína 
presente na estrutura do HIV, com um fixador. Depois se adiciona ao poço a amostra de plasma do 
indivíduo testado. 
É feita uma Lavagem da placa. 
OBS: Se o Indivíduo tiver o Anticorpo Específico, ele vai se ligar ao antígeno pela porção Fab e assim, 
mesmo após a lavagem o anticorpo vai ficar aderido à placa. Caso contrário, após a lavagem só 
estará aderido à placa o antígeno primeiramente colocado 
É produzido um Anticorpo Anti Porção Fc do Anticorpo Anti GP120, por exemplo, Anti-IgG. Esse 
Anticorpo é adicionado ao poço, juntamente com uma Enzima, para que se ligue ao Anticorpo Anti-
GP120. 
É feita outra Lavagem. 
OBS2: Se estiver contido no poço o Anticorpo Anti-GP120 o novo anticorpo com a enzima vai se ligar 
e ficar aderido na placa. Senão tiver Anticorpo Anti-GP120, o Anti Anticorpo não sei se ligar e vai 
sair do poço, junto com a enzima, durante a lavagem 
Adiciona-se o Substrato daquela enzima junto com um Cromógeno. 
Realiza-se a terceira lavagem. 
OBS3: Se no poço tiver Anticorpo Anti-GP120 ligado ao Anti Anticorpo com a enzima, na adição do 
substrato vai haver uma reação Alterando o Cromógeno e fazendo com que ele produza uma 
coloração. Se não tiver os anticorpos e a enzima, não vai ter reação e não vai gerar cor 
RESULTADO: Se houver reação Enzima-Substrato altera cromógeno, gera cor e o teste é considerado 
Positivo para HIV. Se não houver reação, não muda a coloração e o teste é considerado Negativo para 
HIV. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RENAN BITTENCOURT MAIA  3° PERIODO  FACULDADE DE MEDICINA ESTÁCIO DE SÁ  CAMPUS ARCOS DA LAPA 
 Direto: 
Técnica: 
 É produzido um Anticorpo Específico Anti GP120 que é adicionado no poço da placa. 
 Adiciona-se ao poço da placa sensibilizada com o anticorpo anti GP120 o plasma do Indivíduo. 
 É realizada a lavagem. 
OBS: Se tiver no plasma Antígeno GP120 ele vai ficar aderido à placa, já que vai interagir com a 
Porção Fab do Anticorpo. 
 Adiciona-se outro anticorpo para outro epítopo do antígeno, e esse anticorpo é conjugado com uma 
enzima. 
 É realizada outra lavagem. 
OBS2: Se tiver no plasma o outro epítopo, o Anticorpo vai se ligar a ele pela porção Fab e vai ficar 
juntamente com a enzima aderido à placa. 
Depois é adicionado o Substrato para a enzima e o Cromógeno. 
Realiza-se outra lavagem. 
 RESULTADO: Se tiver reação enzima-substrato, vai alterar o Cromógeno e ele vai produzir 
coloração. Se não corar é porque na lavagem o anticorpo saiu juntamente com a enzima porque não 
se ligou. 
 
Obs 1: FALSO POSITIVO pode ocorrer por UM ESQUECIMENTO DA ÚLTIMA LAVAGEM, então a enzima e 
o substrato ficarão reagindo no poço mas não vão estar aderidos à placa, ou seja, não vão ter se 
ligado ao anticorpo ou ao antígeno. 
Obs 2: FALSO NEGATIVO pode ocorrer por um ESQUECIMENTO DE SE COLOCAR O SUBSTRATO, então 
não vai haver reação mesmo a enzima com o anticorpo estando lá aderida à placa. 
Obs3: O ideal é realizar os 2 tipos de teste (ou até mais de 1 técnica) para dar um resultado. No caso 
do ELISA é bom fazer os dois porque a janela imunológica para o Anticorpo é de 20 dias e para o 
antígeno é no Máximo 5.