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UFS – UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE CCET- CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA - DEQ Semeadura em Profundidade DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL PROF (a): LUCIANA AQUINO Alunos: Tatiana Carmo Nascimento Walber Alves Cruz Lima Turma: M2 São Cristóvão – SE, 16 de Julho de 2008 INTRODUÇÃO Para realizar a contagem de colônias existentes em um alimento contaminado é necessário separar amostras de concentrações diferentes. As amostras são separadas utilizando técnicas de diluição. Estas por sua vez devem ser realizadas de forma correta, se não acarretará em resultados errados. A técnica de semeadura em profundidade é muito utilizada para analise de líquidos, pois esta é a melhor maneira de se cultivar suas colônias. A contagem das células pode ser feita em microscópio, podendo ser amostras fixadas ou analisadas a fresco utilizando câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica muito rápida, mas tem como limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas, e contagens erradas devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares. Em preparações não coradas, devem-se utilizar microscópios de contraste de fase, porém só pode ser empregados quando as células não estão muito diluídas. Existem também os contadores eletrônicos usados em hematologia, que podem ser utilizados na contagem de células microbianas. Em situações que se requer apenas um estimativa da quantidade de microorganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma analise comparativa das culturas com suspensões padrão. OBJETIVO O objetivo principal desse experimento é mostrar que através das técnicas de diluição podemos analisar o número de colônias que se encontram em um alimento contaminado. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais: 3 Tubos de Ensaio contendo água destilada Amostra contendo suco de laranja contaminado 3 Pipetas graduadas Placas de Petri Estéreis Meio PCA – Agar Padrão para Contagem Métodos: Meio PCA: - Utilizamos o meio Agar para a experiência, que já havia sido preparado anteriormente. Preparo das Diluições: - Primeiramente deve se enumerar os tubos como D1,D2 e D3 para facilitar o experimento. No tubo D1 que já contem 9 ml de água destilada adiciona-se 1 ml da solução contaminada (nesse caso o suco de laranja), este tubo será o de Diluição 10 x (Diluição 1/10 ou ainda 0,1) - Já no tubo D2 contendo também 9 ml de água destilada adiciona 1ml do conteúdo do tubo D1, sendo o tubo de Diluição 100 x (Diluição 1/100 ou 0,01) - Para finalizar no tubo D3 contendo 9 ml de água destilada adiciona agora 1 ml do conteúdo do tubo D2, esse tubo será o de Diluição 1000 x (Diluição 1/1000 ou 0,001) - Observar que todos esses procedimentos devem ser realizados próximo a chama para evitar a contaminação externa. E sempre que abrir o tubo esterilizado é importante passar a borda do tubo no fogo, depois que adicionar a amostra repassar novamente a borda no fogo antes de fechar com algodão. Preparo da Amostra: - Enumerar as placas em D0, D1 e D2 - Pipetar 1 ml da solução de suco contaminada do tubo D1 para a placa D0 - Em seguida pipetar 1ml da solução do tubo D2 para a placa D1 e transferir a mesma quantidade do tubo 3 para a placa D2. - Após todas as transferências dos tubos para as placas, coloca-se o meio de cultura em sua forma liquida, (se estiver solido precisa aquecer anteriormente para fazer a adição) nos tubos D0, D1 e D2, até preencher a borda. - Lembrar que desde a transferência dos tubos e as placas e até a adição dos meios de cultura tem que ser realizado perto da chama para evitar contaminação externa. - Depois disso, inverte as placas e coloca na estufa a temperatura média de 35 a 37ºC. - Ao passar esse tempo, já poderá ser observado os microorganismos a olho nu ou utilizando o contador de placas, e assim fazer a contagem. Resultados e discussões Ao final do experimento podemos observar o numero de colônias em cada placa: D0 – Diluição 10x - + de 250 colônias D1 – Diluição 100x - 9 colônias D2 – Diluição 1000x - 2 colônias Com isso verificamos que a experiência teve os resultados esperados já que na teoria quanto mais diluído a solução menor o numero de colônias na amostra. O ideal na contagem de colônias é que os valores encontrados devem compreender entre 25 e 250, fora desse intervalo são considerados valores estimados Através do cálculo utilizado para a contagem (Como a de 10x deu um numero de colônias maior que 250, é descartada para o cálculo: 9 x 100 = 900 2 x 1000= 2000 (900+2000)/2 = 1450 Como o resultado é expresso em: R = y x 10 ª UFC/mL ou g (UFC = Unidade Formadora de Colônias) Sendo que 1 ≥ y ≥ 9 e a ≥ 1, então o valor encontrado na nossa amostra é expresso por: R = 1,45 x 10 ³ UFC CONCLUSÃO Ao final deste trabalho podemos concluir que, o número de colônias encontrado em uma placa, depende da concentração do material a ser analisado, sendo assim é necessário realizar diluições de concentrações diferentes para se chagar a um valor médio de colônias. Também se faz necessário a realização da metodologia de modo correto, pois sendo realizada de maneira errada, acarretará em resultados não satisfatórios e errados. Bibliografia
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