16 e 17_Classificacao e Identificacao Microrganismos

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Classificação e 
Identificação de microrganismos
TAXONOMIA
Ex. colónia isolada 
(amostra clínica, 
ambiental, alimentar, 
etc)
Caracterização do isolado 
Compilação de
propriedades
Morfologia
Bioquímica Fisiologia
Biologia molecular 
(ex. ácidos nucleicos, proteínas)
Ecologia
( + )
Identificação
(
-)
Descrição de 
microrganismo novo*
Comparação com propriedades 
conhecidas de microrganismos
(disponiveis em bases de dados, manuais, etc)
Classificação
Nomenclatura
*Espécie nova? - Descrição detalhada; em publicação científica internacional
– Estirpe tipo depositada em colecções de culturas nacionais e/ou internacionais
�
• Taxonomia
– É a ciência que distribiu os organismos por categorias
taxonómicas ou taxa que traduzem o seu grau de 
semelhança
– Divide-se em:
• classificação – define a forma de distribuição dos 
organismos em grupos taxonómicos (taxa; singular 
taxon)
(com base em semelhança mútua ou relação evolutiva).
• nomenclatura – atribui nomes aos grupos taxonómicos
de acordo com regras pré-estabelecidas.
• identificação – é o processo de determinar a que grupo
taxonómico pertence um determinado isolado.
Importância da taxonomia
• Permite organizar grandes quantidades de 
informação
• Permite fazer uma previsão das características
de um determinado isolado
• A criação de grupos com nomes precisos facilita
a comunicação científica
• É essencial para a identificação correcta dos 
organismos
ESPÉCIE - unidade básica da taxonomia microbiana. 
•••• conjunto de estirpes que partilham muitas características 
estáveis e diferem significativamente de outros grupos de 
estirpes (é subjectivo);
•••• conjunto de estirpes com composição G+C (genoma) 
idêntica, e em que a sequência de nucleotídeos do DNA
apresenta ≥≥≥≥ 70% de semelhança.
GÉNERO – grupo bem definido de uma ou mais espécies, claramente
separado de outros géneros.
Shigella flexneri
S. flexneri
espécieSistema binominal
para a designação da espécie
Género - Shigella
“aceae” - família “ales” - ordem
(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
Hierarquia taxonómica (exemplo)
Numero de 
grupos taxonómicos 
Conhecidos
(domínio Bacteria)
Filos - 25
Classes - 34
Ordens - 78
Familias - 230
Géneros - 1227
Espécies - 6740
Os microbiologistas usam muitas vezes nomes informais
- Por exemplo: bactérias purpúra, bactérias metanotróficas (que oxidam metano), etc
3 divisões maiores: 
domínios Bacteria, Archaea e Eukarya
ESTIRPE TIPO - primeira estirpe a ser estudada de uma espécie
- É geralmente a mais bem caracterizada
- Não é necessariamente o membro mais representativo
da espécie
• população de organismos que se distingue de outras dentro de 
uma espécie
• descende de um único organismo ou cultura pura (isolado)
• Estirpes de uma espécie podem variar ligeiramente de várias
formas
– biovar – apresentam diferenças bioquímicas e fisiológicas
– morfovar – diferem morfologicamente
– serovar – diferem nas propriedades antigénicas
ESTIRPE
Características Usadas em Taxonomia, na
classificação e identificação de microrganismos
• dois tipos:
– clássicas
– moleculares
• morfológicas
• fisiológicas e metabólicas
• ecológicas
• análise genética
Características fenotípicas
� Ácidos nucleicos
� Proteínas 
� Lípidos
Características Clássicas
Análise Genética
• Capacidade de troca de informação genética por transformação ou
conjugação
– estes processos estão geralmente confinados ao género
• Existência de plasmídeos
(embora a informação neles contida possa induzir em erro)
• Ciclo de vida
• Relações simbióticas
• Capacidade de causar doenças em hospedeiros
• Habitat preferencial
• Factores que influenciam o crescimento
Características ecológicas
Exemplo - Identificação de um isolado de bactéria entérica com base em
métodos de classificação clássica.
O esquema aqui representado usa métodos microbiológicos clássicos e requere que uma população 
da bactéria a identificar seja crescida em cultura pura.
TP. 6
Classificação fenética
• Agrupa os organismos com base em semelhanças
fenotípicas mútuas;
• As características fenotípicas testadas têm todas o 
mesmo peso;
• É necessário comparar um grande número de 
propriedades (várias dezenas ou centenas de tipos
diferentes: morfológicas; bioquímicas; fisiológicas)
de diferentes microrganismos.
Exemplo de utilização de 
taxonomia numérica em 
Bacteriologia.
O dendrograma ao lado mostra a
distribuição de 105 estirpes de bactérias
Gram-negativas e fermentativas da familia
Enterobacteriaceae. Foram comparadas 
238 característica de cada estirpe.
(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
Taxonomia Numérica
• Usada para estabelecer um sistema de classificação
(comparação de grande nº de características de diferentes
microrganismos; frequentemente > 50 características)
• Passos principais:
– Todas as propriedades testadas têm o mesmo peso:
• 1 = Presente; 0 = Ausente
– Determinação dos coeficientes de semelhança
Usa computadores para comparar organismos
– Construição de matrizes de similaridade
– Construção de dendogramas que relacionam os microrganismos
entre si
Coeficiente de semelhança
• Coeficiente “simple 
matching”
– Com base em todas as 
características, quer
estejam presentes ou
ausentes
• Coeficiente de Jaccard
– Ignora as características
ausentes nos dois
organismos.
Coeficientes variam entre 
0 (sem semelhança) e
1 (100% semelhança)
(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
• dendrograma – diagrama em árvore
matriz de
similaridade
(a)
Clustering (b) Dendrograma (c)
• um grupo de organismos com um grau de semelhança
superior a 80% = espécie bacteriana
(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
“Kits” comerciais para identificação de microrganismos
(Ex. diagnóstico de patogénicos em amostras clínicas ou em alimentos; 
em amostras ambientais (ex. análise de água))
- API e mini-API
- Vitek
- Baseados principalmente em características fisiológicas e 
bioquímicas 
- Sistemas automatizados
- Perfis de características observadas são comparadas com perfis 
disponíveis em bases de dados
- Requer cultivo dos microrganismos em cultura pura
� ability of the cell to metabolize all major 
classes of biochemicals; 
� physiological properties such as pH, salt, and lactic acid tolerance, reducing power, 
and chemical sensitivity;
� > 1900 species couverage (bacteria, yeast, filamentous fungi)
BIOLOG
Identificação de espécies bacterianas com base na 
composição das células em ácidos gordos: FAME
FAME – Fatty Acid Methyl Ester 
Mais de 200 ácidos gordos diferentes 
foram descobertos em procariotas
do domínio Bacteria.
CLASSIFICAÇÃO MOLECULAR
- Análise molecular de componentes celulares específicos
• Comparação de proteínas
• Comparação da composição dos ácidos nucleicos
- Ex. conteúdo G + C do DNA
(determina-se com base no valor da temperatura de fusão, Tm)
• Hibridação de ácidos nucleicos
• Comparação de sequências de bases de ácidos nucleicos
- Ex. do RNA ribossómico - rRNA (Filogenia ou
classificação filogenética)
Comparação de proteínas
• comparação da mobilidade electroforética
• comparação de propriedades enzimáticas
• determinação da sequência de aminoácidos, 
alinhamento de sequências
(ferramentas de Bioinformática)
Composição de bases dos ácidos nucleicos
• Conteúdo G + C 
– Mol% G + C = (G + C)/(G + C + A + T)
– Variação dentro de um género é geralmente < 20%
- % G+C só tem valor taxonómico quando aliado a outras características fenotípicas
e/ou moleculares
DNA cadeia
simples
DNA cadeia
dupla(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.) �
Mede o grau de similaridade (ou, homologia) no DNA de dois organismos –
espera-se que duas moléculas de DNA desnaturadas (em cadeia simples) 
hibridizem uma com a outra (i.e. emparelhem, estabelecendo pontes de H 
entre bases homólogas) proporcionalmente à complementaridade das 
sequências de bases nos seus genes (i.e. à similaridade dos seus genes).
É um método sensível para revelar diferenças subtis nos genes de dois 
organismos; é útil para distinguir organismos ao nível da espécie.
EXEMPLO (figuras seguintes): 
1. DNA de um dos microrganismos é marcado com isótopo de fósforo radioactivo. 
2. DNA dos 2 microrganismos é desnaturado e depois misturado. 
(Geralmente, o DNA de um dos microrganismos está fixado a uma membrana 
de Nylon ou nitrocelulose);
3. No final, é removido o DNA não ligado e medida a quantidade de radioactividade 
sobre a membrana.
HIBRIDAÇÃO DNA:DNA como ferramenta taxonómica
(T > Tm)
HIBRIDAÇÃO DNA:DNA como ferramenta taxonómica
In general, the DNA of 
organism 2 (non-radioactive) 
is attached to a membrane 
(made of Nylon or nitrocelulose)
1x1 – positive control(T < Tm)
> 70% DNA similarity
+ Probably, same species
< 5% diference in Tm (% G+C)
(in Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
EVOLUTION and 
SPECIATION
- Mutations
- Horizontal gene transfer
(conjugation, transformation, 
transduction)
- Adaptation / new ecotype
Ecotype – population of cells that 
compete for the same resource
New species – population of cells 
genetically different from the cells of the 
original ecotype. 
FILOGENIA ou CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA
É a área da taxonomia que estuda as relações evolutivas entre os organismos vivos
(é a base da classificação moderna)
Evolução – alterações numa linhagem de descendência 
ao longo do tempo conduzindo a novas 
variedades e espécies.
���� Traduz a história evolutiva de um grupo de organismos. 
���� A hierarquia taxonómica revela relações evolutivas ou filogenéticas
As relações evolutivas são mostradas em árvores filogenéticas
FILOGENIA – grego: phylon – tribo, raça; genesis - origem
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
Nós internos:
Representam organismos
ancestrais
Ramos:
O comprimento representa a distância evolutiva ou o grau
de relacionamento evolutivo entre os organismos
Nó externo:
Representam organismos
conhecidos, actuais
Árvores filogenéticas Nó = 
unidade
taxonómica
(e.g., espécie ou
um gene)
Árvore com raíz-
tem um nó que
corresponde ao
ancestral 
comum
Combinação de métodos de Biologia Molecular e
Análise Computacional, com base em Algoritmos
Matemáticos ���� Bioinformática
A Árvore filogenética universal (Carl Woese, 1977)
Universal 
ancestor(s)
(Bacteria that gave
rise to mitochondria)
(Bacteria that gave 
rise to chloroplasts)
CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA
Baseia-se na comparação directa das sequências de material genético
(genes) ou dos seus produtos (proteínas)
RIBOSSOMAS Moléculas de RNA ribossomal (rRNA) 
são excelentes ferramentas para determinar 
relações evolutivas entre organismos –
CRONÓMETROS EVOLUTIVOS
PORQUE:
- São universais (estão presentes em todos os organismos vivos e 
com a mesma função);
- A sua função não se alterou ao longo do processo evolutivo;
- Contém várias regiões em que a sequência de nucleotídeos é
conservada em todos os tipos de células;
-- Sequências assinatura / grupos taxonómicos específicos
rRNA 16S (procariotas)
rRNA18S (eucariotas) 
A sequência de bases nestas moléculas de rRNA é muito 
conservada ao longo do processo evolutivo
rRNA 16S rRNA 16S rRNA 18S
(domínio Bacteria) (domínio Archaea) (domínio Eukarya)
Ribossomas 
(procariotas)
SSU – Small Subunit
OBTENÇÃO DE ÁRVORES FILOGENÉTICAS COM BASE 
BNA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO rRNA - RNA RIBOSSOMAL
(a) extracção do DNA de células de cada um dos microrganismos que se 
pretende comparar
(neste exemplo, são 3 bactérias, designadas por 1, 2 e 3);
(b) Obtenção de muitas cópias do gene que codifica o 16S rRNA em cada um 
dos microrganismos (técnica de PCR)
PCR – “Polymerase chain reaction” - reacção em cadeia 
pela polimerase
(Kary Mullis – 1993)
- “Primers”
- “DNA polymerase” de bactérias 
termófilas ou hipertermófilos. 
Permite obter 
muitas cópias 
iguais de um 
gene específico.
Comparação:
1 vs. 2 – 3 diferenças; 
1 vs. 3 – 2 diferenças; 
2 vs. 3 – 4 diferenças
Base de dados “Ribossomal Database Project”
Onde está depositada uma colecção de mais de
850 000 sequências de 16S rRNAs de Archaea e Bacteria
– dados de Maio 2009).
Algoritmo → comparações e
cálculo de distâncias evolutivas
http://rdp.cme.msu.edu/ Michigam State University
- Filogenia molecular / biologia evolutiva
- Identificação de bactérias
- Caracterização de populações bacterianas
- Compreensão da biodiversidade e da 
ecologia bacteriana
Sequências assinatura no rRNA
�sequências curtas de nucelotídeos que ocorrem na maior parte ou em todos 
os membros de um grupo filogenético 
� únicas → podem servir de diagnóstico de um organismo particular ou de 
um grupo de organismos particulares;
+ conservadas
+ variáveis
Por exemplo, são conhecidas:
- Sequências assinatura específicas para cada um dos três domínios
(i.e., são conservadas no rRNA de todas as espécies de cada um dos 
domínios);
- Sequências assinatura que definem um grupo de organismos dentro de 1 
domínio (são conservadas entre todos os géneros e espécies desse grupo);
- Sequências assinatura que estão presentes nos organismos 
pertencentes a um certo género ou a uma certa espécie (p.ex., são mais 
variáveis, isto é, diferem entre os organismos de grupo mais amplo )
O conhecimento sobre sequências assinatura específicas pode ser usado para gerar
sondas filogenéticas→→→→ úteis no dignóstico de microrganismos ou na análise de 
comunidades microbianas
(Ex. técnica FISH – Fluorescent in situ hybridization”). 
→→→→
SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO
Fragmento de ácido nucleico, em cadeia simples, que pode ser marcado (“labelled”), 
com Fósforo radioactivo ou com molécula fluorescente, e usado para hibridar 
(emparelhar) com sequência complementar de ácido nucleico numa mistura 
(p.ex. moléculas de ácidos nucleicos de uma população mista de microrganismos
– em amostra de alimento, ambiental ou clínica). 
Permite deste modo identificar de forma específica a presença de um 
microrganismo específico que contenha essa sequência-diagnóstico.
SEQUÊNCIAS ASSINATURA SÃO A BASE PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS 
ATRAVÉS DE:
- COMPARAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS EM REGIÕES DO rRNA QUE 
SEJAM ESPECÍFICAS PARA MICRORGANISMOS PARTICULARES (p.ex. comparação 
com sequências de rRNA depositadas em bases de dados – p.ex. Ribossomal 
Database Project)
- RECURSO A SONDAS FILOGENÉTICAS (Ex. técnica FISH)
“Fluorescent in situ Hybridization (FISH)” na
detecção e identificação de microrganismos específicos
(NÃO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura)
Microscópio de 
fluorescência
Observação da fluorescência
emitida pelas células
(emparelhamento entre 
sonda e rRNA)
16S rRNA – procariotas
18S rRNA - eucariotas
Sonda filogenética
marcada com fluorocromo
+
Células 
(amostra com 
população mista) Ribossomas
Exemplo – uso de sondas filogenéticas
para detectar a presença de bactérias específicas
em grânulo de lama activada – tratamento biológico de efluentes
Classificação de Procariotas
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
• 1ª Edição (1º volume em 1984)
- Classificação fenética• 2ª Edição (desde 2001)
- usa classificação filogenética
Manual que contém descrições de todas as espécies bacterianas identificadas.
Domínio Bacteria
• Metabólica e morfologicamente diversos
• Divididos em 23 filos (“phyla”)
Domínio Archaea
2 “phyla”
8 classes
12 ordens
metanogénicos
termofílicos
halobactérias