tecnicas basicas de biologia molecular

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Técnicas Básicas de Biologia 
Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ
Visão da Apresentação
„ PCR
„ Bibliotecas genômica e de expressão
„ Fragmentação - digestão
„ Separação - eletroforese
„ Clonagem molecular
„ Sequênciamento
„ Southern, Northern e Western blotting
By Diamar
Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas, 
pois a maioria dos cromossomo já estão 
mapeados. 
- O projeto genoma tem sido uma 
grande ferramenta para unir genomas e 
laboratório clínico. 
Mapas Genéticos, Citológicos e 
Físicos
EST – Sequências expressas marcadas. 
cDNA curtos que ligam mapas físicos a 
genéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos 
dos fragmentos de restrição
By Diamar
Procurar um gene dentro de um genoma 
humano é comparável a procurar uma pessoa 
sem sobrenome em uma casa sem endereço 
em uma rua desconhecida em uma cidade não 
identificada de um país estrangeiro.
Solange Farah
By Diamar
Enzimas de Restrição
„ 1953 – a eficiência de replicação de um 
bacteriófago dependia da célula hospedeira
„ Verificou-se, então, a presença de nucleases
„ Bactéria restringe o crescimento do fago e 
protege o seu DNA metilando-o (modificando)
„ Fenômeno chamado restrição/modificação
„ Advento das endonucleases de restrição
„ Sítio é normalmente uma palíndrome
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
Palíndrome:
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
„ Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de 
bases
„ Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
„ Primeira letra maiúscula é gênero e as duas 
outras minúsculas são espécies
„ 1073 – foram usadas para clonagem molecular
„ Pode-se recombinar DNA humano com qualquer 
outra espécie
„ Fragmentos separados por eletroforese
By Diamar
Enzimas de Restrição
(continuação)
By Diamar
By Diamar
Vídeo de Enzima de 
Restrição
By Diamar
Eletroforese
„ Já conhecida desde 1930
„ Difundida em 1950-1960
„ Movimentação de moléculas submetidas a 
campo elétrico
„ Usa um substrato: papel, agarose, 
poliacrilamida
„ Separa proteínas por cargas e peso molecular
„ Separa ácido nucléicos por peso molecular
By Diamar
Eletroforese
+-
Horizontal
VerticalFonte de eletroforese
Visualização do gel de agarose
-
+
By Diamar
Eletroforese
By Diamar
Vídeo de Eletroforese
By Diamar
Clonagem Molecular
„ Consiste no isolamento e propagação de 
moléculas de DNA idênticas
„ Primeiro: inserto + vetor = rDNA
„ Segundo: rDNA + célula hospedeira = 
transformação
By Diamar
By Diamar
Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um 
gene específico, com uma característica desejada, e transfere este 
gene para outro organismo vivo
Célula humana Bactéria
Plasmídeo
DNA
Enzima de restrição
Tesoura genética
Transformação
Digestão
DNA da bactéria
DNA da célula humana
rDNA
Clonagem
By Diamar
O DNA recombinante 
8 Não se limita a organismos de uma mesma espécie
8 A compatibilidade sexual torna-se irrelevante
8 Permite modificações em uma única geração, o que
antes levaria dezenas ou centenas de gerações
By Diamar
Vídeo de Clonagem 
Molecular
By Diamar
Vetor
„ São moléculas de transporte
„ Moléculas de DNA
„ Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, 
vírus, YACs, etc.
„ Diferenças de tamanho de inserto
„ Podem ter comportar linear e/ou circular
By Diamar
Vetor
(continuação)
Vetores de expressão procarióticos
„ Promotores fortes
„ Sítios de ligação a ribossomos
„ Sítios de clonagem
Vetores de expressão eucarióticos
„ Origem de replicação eucariótica
„ Região de controle de transcrição e tradução, 
poliadenilação de mRNA, capping
„ Sinais especiais para processamento e secreção
By Diamar
Vetor
(continuação)
Características gerais
„ Região promotora
„ Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker
„ Gene de resistência a antibióticos
„ Origem de replicação
„ Gene repórter
By Diamar
Vetor
(continuação)
PLASMÍDEOS:
„ Penetra naturalmente nas bactérias
„ Fita dupla
„ Circular
„ Extracromossômico
„ Resistência a antibióticos
„ Vetores shuttle
„ Insertos até 4000 pb
„ pUC 18, pUC 19
By Diamar
Vetor
(continuação)
FAGOS
„ Vírus de bactérias
„ Fago λ é o mais utilizado
„ Fita dupla linear
„ Recirculariza durante a infecção na bactéria
„ Aceita até 20 mil pb
By Diamar
Vetor
(continuação)
COSMÍDEOS
„ Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
„ Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do 
fago para infectar bactéria
„ Possuem seqüências cos
„ Aceitam insertos de até 50 mil pb
By Diamar
COSMÍDEOS
By Diamar
Vetor
(continuação)
YACs (Yeast Artificial Chromosome)
„ Células hospedeiras as leveduras
„ Comportam-se como cromossomos
„ Aceitam 400 mil pb
„ Possuem seqüências de DNA específicas de 
levedura: telômero, centrômero e origem de 
replicação 
ARS: Seqüência de replicação autônoma
CEN: Seqüências centroméricas 
By Diamar
Engenharia Genética – Produção em série
- Hormônio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormônio sexuais 
By Diamar
Sequenciamento
„ Frederick Sanger (1977), Inglaterra
„ Segundo Prêmio Nobel
„ Síntese de DNA in vitro por término 
didesoxi
„ Mapa físico dos genes e dos 
cromossomos 
By Diamar
Sequenciamento 
(continuação)
„ Hood: Semi-automatizado (1986)
„ Venter: Genoma de bactéria usando 
ddNTPs fluorescentes automatizados, 
robóticas e PCR (1995)
„ Perkins-Elmer Corp: Comercializado o 
Sequenciamento totalmente automatizado 
(1999)
By Diamar
Considerações
P
P
BN
A
C
G
T
U
OH
P
OHOH
Ribose
C1
C2C3
C4
C5
P
P
BN
A
C
G
T
OH
P
OHOH
dNTP
Pentose
C1
C2C3
C4
C5
Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico
O - Necessário 
para ligação 
fosfodiéster
5’ 3’ 
Polimerização
ddNTP (Didesoxinucleotídeo)NTP
By Diamar
Estuda a integridade da sequência de um DNA 
molde. Analisa diferentes tamanhos de 
fragmentos formados a partir de um primer e da 
inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e 
ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.Sequenciamento
ddNTP
ddNTP
ddNTP
Fragmento 1
Fragmento 2
Fragmento 3
Primer
DNA molde
dNTPdNTPdNTP
dNTP
dNTPdNTP
DNA polimerase
ACGT
AC
ACG
TGCA
By Diamar
Sequenciamento automatizado
Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)
By Diamar
Southern Blotting
„ E. M. Southern (1975)
„ Fragmentos de DNA são separados em gel de 
agarose
„ Transferidos para membranas por ação capilar
„ DNA é desnaturado antes ou durante a 
transferência
„ Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na 
membrana
„ Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
By Diamar
Southern blot
Descrição:
- Digestão do DNA em teste com enzimas 
de restrição; 
- Resolução dos fragmentos com 
eletroforese em gel de agarose;
- Transferência do DNA para membrana de 
nylon;
- Hibridação com uma sonda de DNA ou 
RNA marcada com radioatividade ou 
quimioluminescentes 
Aplicação: Alterações em um único 
nucleotídeos; detecção de inserções, deleções 
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do 
DNA em um mapa físico; fragmentos de 
cromossomo.
Com o advento da PCR seu uso tornou-se 
limitado.
By Diamar
Southern blot
46, XY.Síndrome da insensibilidade 
androgênica. Vagina em fundo de 
saco, sem útero ou tubas uterinas. 
1:20.000. Testículos no abdome ou 
canal inguinal (confundidos com 
hérnias, na infância). Defeito 
molecular: varia de deleção 
completa do gene a mutações de 
ponto nos domínios de ligação de 
andrógenos ou ligaçãoao DNA da 
proteína receptora de andrógeno. 
Sonda de cDNA para o 
gene humano ligado ao X 
de receptor de andrógeno 
hibridando no genoma 
digerido do paciente.
Exemplo da especificidade das 
sondas.
By Diamar
Vídeo de Southern blot
(DNA _DetectivePC)
Northern blotting
„ Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de 
agarose
„ RNAs devem ser desnaturados (formaldeído)
„ Sensibilidade a RNAses
„ Transferência para membrana por ação capilar
„ Sondas de RNA ou DNA para hibridar
By Diamar
Northern blotting
(Continuação)
„ Úteis em estudo de expressão gênica
„ Estudo de diferentes tecidos
„ Estuda o padrão temporal de expressão 
de genes durante o crescimento do 
indivíduo
By Diamar
Northern blotting
Marcadores 
rRNA
RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).
A – sonda de α-tubulina – hibrida todos
B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores 
C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos
By Diamar
Western blotting
„ Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
„ Separação e caracterização de proteínas
„ Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para 
desnaturação
„ Transferência para membrana por força elétrica
By Diamar
Western blotting 
(continuação)
„ Proteína alvo é identificada por anticorpo mono 
ou policlonal
„ Revelação do sistema com anticorpo secundário 
fluorescente ou radioativo
„ Informa o tamanho e a quantidade das proteínas
By Diamar
Western blotting
By Diamar
Western blotting
Análise de proteínas por anticorpos específicos após 
eletroforese e transferência para membrana.
By Diamar
Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos 
fragmentos de restrição
„ Uso de enzimas de restrição 
„ Produção de fragmentos de DNA de tamanho 
adequados para serem utilizados
„ As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco 
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de 
DNA
„ Aplicação: compara alelos normais e afetados para 
cada mutação estudada.
Mapa de Restrição
By Diamar
PCR - RFLP
By Diamar
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos 
fragmentos de restrição
Um caso de erro inato do metabolismo: 
G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
By Diamar
RFLP de Planta
DNAs genômico de 
Arabidopis é digerido 
com EcoRI. 
Southern blotting 
com sonda azul e 
verde.
F1 é heterogênio 
possui fragmentos de 
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo 
diferentes: C-
Colombia, N-
Niederzenzes e H –
Heterozigoto.
Oligonucleotídeo alelo-
específico (ASO)
Descrição:
- Hibridação preferencial de sonda 
marcada para testar DNA com composição 
de bases complenmentar única.
Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.
Mutação é conhecida. Revela uma única 
alteração de base. Distingue hetero ou 
homozigotos para a sequência. A análise é 
restrita a mutação familiar conhecida ou para 
distúrbios genéticos com nº finito de 
mutações diferentes. Ex: beta-talassemia.
By Diamar
FISH 
Hibridação in situ com fluorescência
„ Detecta DNA localizados dentro de cromossomos
„ Usa lâminas de microscopia
„ Cromossomos estão em metáfase, anáfase e 
interfase
„ Usa sondas de DNA específicas
By Diamar
FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no 
cromossomo 15 paterno. 
By Diamar
By Diamar
FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
Relação evolutiva 
entre cromossomos.
DNA de gibão 
Hylobates lar
sondado com DNA 
Humano.
Setas indicam 
cromossomo 8 do 
gibão.
Cromossomo 
humano 4 hibrida 
com cromossomo 
(laranja) do macaco 
verde africano.
Evolução cromossômica em mamíferos
SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
) Método baseado na 
mobilidade eletroforética.
) Gel não desnaturante.
Protocolo Básico
) PCR do gene alvo.
) DNA desnaturado.
(eletroforese)
) Mobilidade diferente 
da normal indica 
mutação.
) Sensível para 
tamanho e forma da fita 
simples.
) Detecta a mudança 
de uma base.
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SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
) Fragmentos até
200 pb – 90% de 
sensibilidade.
) Fragmentos 
maiores que 400 pb 
- 80% de 
sensibilidade.
(digestão )
Heterozigoto
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
„ Southern blotting em lâmina
„ Chips de genes
„ Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas
By Diamar
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
„ Microdisposição de oligo ou de sondas
- Microssíntese de oligos in situ (no chip) 
- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
fabricadas
- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA
„ Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
„ Leitura por scanners
By Diamar
Microarray 
Microarranjos de DNA – Chips de DNA
� É uma técnica que emprega arranjos (arrays), 
que contêm um grande número de genes 
roboticamente distribuídos de forma ordenada em 
uma placa de vidro.
�Pode comparar a expressão de um grande 
número de gene, simultaneamente. 
� Existem lâminas de 400.000 pontos.
São feitas com ponteiras de titâneo.
By Diamar
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
„ Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos
„ Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos 
sob condições normais e anormais
„ Sequenciamento do DNA e genotipagem 
Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Contras Utilização
Técnica cara - Mapear mutações
Sensibilidade é reduzida - Oncogenes
Lâminas não são reutilizadas - Expressão das vias
metabólicas
Repetir várias vezes - Regiões regulatórias 
de genes de levedura
Grande quantidade de - Expressão de genes
mRNA (2 a 5 µg) anônimos
- Analisar 10.000 amostras
em 12 horas
Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Descrição:
- Hibridação do DNA em 
teste com disposições 
ordenadas de nucleotídeos 
em chip de silicone.
Aplicação:
- Detecção de DNA em 
teste com composição 
conhecida.
By Diamar
Referências Bibliográficas:
„ MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array 
of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
„ MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase 
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. 
„ SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA 
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. 
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
„ SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences 
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. 
Mol. Biol. 98:503-517.
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Obrigada!
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