Titulação de Aminoácidos

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Introdução
Os aminoácidos são as unidades fundamentais das proteínas. São moléculas orgânicas as quais possuem ligadas ao mesmo átomo de carbono (denominado de carbono alfa) um átomo de hidrogênio, um grupo amina, um grupo carboxílico e uma cadeia lateral “R” característica para cada aminoácido. Essa cadeia lateral é o que difere os aminoácidos em sua estrutura, tamanho, cargas elétricas e solubilidade em água. Além de conferir propriedades físico-químicas diferentes a cada aminoácido, as cadeias laterais são também responsáveis por forças estabilizadoras, advindas de interações fracas (ligações de hidrogênio, hidrofóbicas, eletrostáticas etc.), que mantêm as estruturas conformacionais enoveladas das proteínas.
Devido aos agrupamentos das moléculas, e por dados experimentais, sabe-se que a forma predominante de um aminoácido em solução aquosa é a forma dipolar, onde têm cargas elétricas em seus dois pólos devido ao grupamento amina se encontrar protonado (NH3 +) e a carboxila dissociada (COO− ):
					 H
 					 
					 R C COO-
					 
					 NH3+
E, de acordo com seu comportamento ácido-base, denota-se que eles podem agir como ácidos e bases, portanto recebem a denominação de anfóteros. Quando um aminoácido é dissolvido em água, ele existe na solução como um íon dipolar. Podendo agir tanto como ácido, doando prótons:
Figura 1- Íon dipolar agindo como um ácido. (Fonte: desconhecida)
Ou como uma base, recebendo prótons:
Figura 1.1 – Íon dipolar agindo como uma base. (Fonte: desconhecida)
Efetuam-se titulações potenciométricas de soluções aquosas destes compostos, sendo titulação a adição ou remoção gradual de prótons de um eletrólito fraco por meio da adição ao meio de uma base ou ácido forte. E, essas titulações, podem ser feitas a partir de um aminoácido totalmente protonado, utilizando a solução de NaOH, por exemplo, conforme os seguintes termos:
 H				 H					 H
 				 						 
 R C COOH 	 OH-		R C COO-	 OH- R C COO-
 		 pK1		 			 pK2		 
 NH3+				 NH3+					NH2
 ( +1 )				 ( 0 )					( -1 )
Numa titulação, o pK (medida de tendência de um grupo ionizável em doar ou receber prótons) corresponde ao pH em que a relação entre a base conjugada e o ácido conjugado é 1, ou seja, equimolar. Neste ponto, o pH é igual ao pK pela equação de Handerson-Hasselbach, e a substância que está sendo titulada encontra-se no pH onde possui maior poder tampão.
Figura 1.3 – Equação de Handerson-Hasselbach. (Fonte: desconhecida)
A forma dipolar do aminoácido tem carga total nula. Quando colocada sob a ação de um campo elétrico não migra para pólo algum. O pH onde existe esta forma é conhecido como ponto isoelétrico. Para calcularmos o ponto isoelétrico (pI), basta acharmos a média aritmética dos dois, um anterior e outro posterior à sua existência. 
Figura 1.4 – Equação para calcular o ponto isoelétrico. (Fonte: desconhecida)
O conhecimento deste comportamento em geral, é da maior importância para a compreensão de muitas das propriedades das proteínas.
Objetivos
Entender o comportamento ácido-básico dos aminoácidos, e por meio da titulação, determinar os valores de pK de um aminoácido.
Materiais
Balão volumétrico
Bureta
Pipeta de Pasteur
Bequeres
Agitador magnético
Garras
Pinça
Pedestal/suporte
Funil
pHmetro (medidor de pH)
Glicina a 0,1 mol L -1
HCl concentrado
NaOH a 0,5 mol L -1
Procedimentos
Mediu-se 50 ml da solução de glicina e colocou-se em um béquer de 100 ml, colocou o agitador magnético dentro do bécker e mergulhou o eletrodo na solução. Na capela, mediu-se 1 ml de HCl (ácido clorídrico) concentrado e acrescentou-o na solução de glicina para reduzir o pH, posteriormente a agitação, ligou-se o pHmetro e atingiu um valor de PH de 1,02.Concomitantemente para realizar a titulação utilizamos a base (NaOH) fazendo o ambiente dentro da bureta e posteriormente com o auxílio de um funil mediu-se e transferiu 50 ml de glicina, formando uma solução de glicina com hidróxido de sódio a 0,5 mol L. Gradualmente deixou-se pingar 1 ml por vez na solução glicina+HCL que estava no béquer , anotando os valores obtidos a cada ml.
Resultados e Discussões
A tabela abaixo representa os valores de PH a cada ml titulado da solução de glicina com hidróxido de sódio.
	mL
	pH
	
	0
	1,02
	
	1
	1,04
	
	2
	1,08
	
	3
	1,12
	
	4
	1,17
	
	5
	1,22
	
	6
	1,28
	
	7
	1,36
	
	8
	1,44
	
	9
	1,52
	
	10
	1,62
	
	11
	1,74
	
	12
	1,86
	
	13
	1,98
	
	14
	2,11
	
	15
	2,25
	
	16
	2,4
	
	17
	2,56
	
	18
	2,76
	
	19
	3,03
	
	20
	3,48
	
	21
	8,04
	
	22
	8,93
	
	23
	9,25
	
	24
	9,49
	
	25
	9,69
	
	26
	9,85
	
	27
	10,02
	
	28
	10,19
	
	29
	10,41
	
	30
	10,7
	
	31
	11,1
	
	32
	11,69
	
	33
	11,98
	
	34
	12,16
	
Com os resultados obtidos na tabela, foi realizado um gráfico que representa a curva de titulação da glicina, a qual possui o pK1 = 2,40 e pK2 = 9,69 e o momento potencial isoelétrico igual a 6,04 de acordo com o cálculo a seguir:
pI = pK1 + pK2\2 
*Espécies iônicas de acordo com o pH
Em pHs com valor semelhante a 1,a forma predominante de glicina é a que apresenta carga líquida +1:
Em pH na proximidade de 2,34 estão presentes em concentrações iguais as formas que apresentam cargas líquidas +1 e zero:
Em pHs próximo a 5,97 a forma que aparece com maior frequência é a de carga líquida zero: 
Em pH proximo a 9,60 aparecem em concentrações iguais as formas que apresentam cargas líquidas zero e -1:
 Em pH proximo de 12 a forma mais frequente da glicina é a que apresenta carga líquida -1.
Neste gráfico existe uma região na qual a solução de glicina+acido clorídrico resiste a variação de PH diante da adição da solução hidróxido de sódio. Nesse intervalo, a região próxima do valor de pk, existe uma mistura de formas protonadas e desprotonadas ou, uma mistura de um ácido fraco com seu sal de base forte, nessa região, a curva mostra a existência de uma solução tampão, sendo a faixa apresentada pela tabela onde o PH tem um crescimento mínimo e logo após a “saída” da região tamponete há um salto no valor dos PHs.
O PH 6,04 é atingido no ponto em existe igualdade de cargas.Nesse ponto isoelétrico,a carga líquida do aminoácido é zero e corresponde a um PH cujo o valor é a média aritmética dos valores dos pks.
Comparando os valores obtidos com os valores da literatura, observa-se que há uma pequena variação do pI. Segundo dados, o pI da glicina apresenta o valor de 5,97,mas nesse experimento constatou-se um pI igual a 6,04. Esse diferencial do experimento provavelmente deve-se ao fato de ter-se trabalhado com a dosagem de 1ml de HCl , o que provavelmente aumenta a margem de erro quando comparada com os gráficos da literatura. Se fosse trabalhada uma dosagem um pouco maior, a margem de erro cairia bastante. Isso ocorre provavelmente pelo fato de que na glicina os grupos carboxila e amina são os dois mais tituláveis. Em PH muito baixo, a glicina tem um grupo carboxilado protonado, um grupo sem carga e um grupo amina carregado positivamente que também é protonado. Sobre essas condições a glicina tem carga líquida positiva de 1. Ao adicionar o HCl concentrado para protonar a solução de glicina, o pH reduziu para 1,02. Já com base sendo adicionada, os grupos carboxilas perderam seus prótons para tornar-se um grupo carboxilato carregado negativamente, e o ph da solução aumenta. A glicina não possui nenhuma carga líquida. À medida que o pH vai aumentando com a adição de mais base ( glicina+NaOH), o grupo amina protonado perde seus prótons, e a molécula deglicina agora tem uma carga negativa.
Conclusão 
A titulação de aminoácidos evidencia o efeito do PH sobre sua estrutura. ​A glicina é o mais simples dos aminoácidos, apresentado R=H. O aminoácido glicina possui dois grupos ionizáveis com capacidade tamponante: -COOH/-COO- em PH ácido e -NH3+/-NH2 em pH alcalino. No PH 2,3, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo carboxila protonado (-COOH) e 50% apresentam o grupo carboxila desprotonado (-COO-). Nestas condições, o pK é igual ao pH (pK1 da glicina é igual a 2,3). Da mesma forma, no pH 9,6, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo amino protonado (-NH3+) e 50% apresentam o grupo amino desprotonado (-NH2). Nestas condições, o pK é também igual ao pH (pK2 da glicina é igual a 9,6).
A glicina é o aminoácido mais simples e portanto apresenta apenas dois grupos passíveis de sofrer reações de ácido base, portanto temos também apenas dois valores de pKa para os respectivos grupos, carboxílico e amino. Como existe uma zona onde o pH praticamente não varia com as adições de OH-, sabe-se que existe H+ que está a tamponar a solução e que proveio do grupo amino da solução. Assim verifica-se que o primeiro grupo a desprotonar é o grupo carboxílico.
A curva de titulação de uma forma protonada com uma base forte (ou de uma forma desprotonada com um ácido forte) evidencia zonas em que o pH varia bruscamente com a adição de titulante e zonas em que o pH varia muito pouco com a adição de titulante (zonas em que o poder tampão da solução do aminoácido é acentuado).
A titulação potenciometrica indica então os valores da relação de H+ e consequente alteração de estruturas de acordo com variações nessa concentração; concluímos que ha uma elevada importância ao se realizar uma titulação quando se leva conta a especificidade das curvas de aminoácidos. Além disso, tem-se relação destas reações e alterações de pH nos sistemas biológicos, o pH específico é necessário para que algumas reações, ou seja, a concentração de H+ é muito influente no pH, além disso tem-se a relação enzima substrato. Para que ocorra o reconhecimento de uma proteína, e no caso, a proteína tem que ser específica e será alterada casa o pH esteja diferente do adequado para está interação.
Referências
http://portal.virtual.ufpb.br/biologia/novo_site/Biblioteca/Livro_1/2-Bioquimica_Estrutural.pdf
Princípios de Bioquímica. Lehninger, Nelson e Cox, 2002.
Práticas de Bioquímica. UFV. 2007
http://www.maxwell.vrac.puc-rio.br/16190/16190_7.PDF
http://www.bibliotecadigital.unicamp.br/document/?code=vtls000062591
https://www.passeidireto.com/arquivo/3645948/relatorio-de-bioquimica-1
Questões
1) Considerando que o pH de uma solução é 5, calcule a concentração em mol L -1 de OH-.
OH- = 5
OH- = 10(elevado a 5)
pOH = -log [OH-]
pOH = log 1
 [OH-]
pH + pOH = 14
pH + 5 = 14
pH = 9
10 elevado a -9 mol L
2) Considerando que a concentração mol L -1 de H+ numa solução é 0,00456, calcule o pH da solução.
[H+] = 0,00456
pH = log 1 / [H+]
pH = log 1 / 0,00456 = 2,34
3) Calcular o pH da solução tampão formada por ácido fórmico 0,05 mol.L-1 e formiato de sódio 0,1 mol.L-1. O pK do ácido fórmico é 3,75.
pH = pKa + log [A - ] [HA] pH = 3,75 + log 0,1 0,05 pH = 3,75 + log 2 pH = 3,75 + 0,3 pH = 4,05
4) Qual é a relação de bicarbonato para ácido carbônico no plasma sanguíneo normal, com um pH de 7,4? O pK do ácido carbônico é 6,1.
pH= pKa + log [sal]/[ácido]
7,4= 6,1 + log [sal]/[ácido]
7,4 – 6,1 = log [sal]/[ácido] 
4,3 = log [sal]/[ácido] => 19,95
5) Calcule o pH e a variação de pH causados pela adição de 0,01 mol de HCL a um tampão acetato de sódio/ ácido acético 0,1 mol/L, pH 4,76.
Tampão ácido acético pKa: 4,76, 0,1 mol/L.
pH inicial : 4,76
pH com adição de 0,01mol de HCl? (acrescentando ácido -> consome sal; forma mais ácido)
Ph = pKa + log [ sal – x ]/ [ ácido + x] 
Ph = 4,76 + log [0,1-0,01] / [ 0,1+0,01]
Ph = 4,76 + log 0,09/0,11
Ph = 4,76 + (-0,09) = 4,67
Novo pH = 4,67
Variação de pH = pH inicial – pH final = 4,76 – 4,67 = 0,09
6) Calcule o pH e a variação de pH causados pela adição de 0,01 mol de HCl a um tampão acetato de sódio/ácido acético 1mol/L, pH 4,76.
Tampão ácido acético pKa: 4,76, 0,1 mol/L.
pH inicial : 4,76
pH com adição de 0,01mol de HCl? (acrescentando ácido -> consome sal; forma mais ácido)
Ph = pKa + log [ sal – x ]/ [ ácido + x] 
Ph = 4,76 + log [1-0,01] / [ 1+0,01]
Ph = 4,76 + log 0,99/1,01
Ph = 4,76 + (-0,009) = 4,75
Novo pH = 4,75
Variação de pH = pH inicial – pH final = 4,76 – 4,75 = 0,01
7)Calcule o pH e a variação de pH causados pela adição de 0,01 mol de HCL a um tampão acetato de sódio\ácido acético 1 mol L , pH 5,5.
[acetato de sódio]=1mol/L              
[sal]+[ácido]=1                                
[acidoacético]=1mol/L                        
pH=5,5                                               
pH= pKa + log[sal/ácido]                            
5,5 = 4,76 + log[sal/ácido]                     
[sal/ácido]=10^0,74                           
5,5[ácido]+[ácido]=1                        
 6,5[ácido]=1                                       
[ácido]=0,15M                         
[sal]=1-[ácido]=0,85                        
[ácido]=0,15M+0,01=0,16M               
[sal]=0,75M-0,01=0,84M                      
pH = pKa + log [sal/ácido]                    
pH =4,76 + log 0,84/0,16        
Novo pH = 
Variação de pH:0,72 
8) Qual é a relação entre a concentração de um tampão e seu poder tamponante?
A característica mais notável da capacidade tamponante é que ela alcança um máximo quando Ph= pKa, ou seja, um tampão é mais eficaz em resistir a mudança de pH quando pH=pKa, isso é [HÁ]=[A].
Na escolha de um tampão para um experimento, deve-se buscar um cujo pKa seja o mais próximo possível do pH desejado. A faixa de pH útil de um tampão geralmente é considerada pKa +-1 unidade de pH. A capacidade tamponante também pode ser aumentada aumentando a concentração do tampão.
9)A lisina tem três grupos ionizáveis pk1=2,2; pk2=9,2 e pkr=10,8.Faça a curva de titulação da lisina e indique seus 3 valores de pk.Escreva a estrutura da lisina e a carga liquida da molécula em cada estado de ionização.Quando se usa a lisina como tampão,quais os pontos da curva de titulação que representam os piores valores de pH para a capacidade tamponante Quais são as espécies predominantes nesses valores de pH