Sequenciamento de DNA

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Sequenciamento de DNA
Fabricio Fernandes
• A dupla hélice: Francis Crick e James Watson (1953).
– Nobel em 1962
Sequenciamento de DNA
• Hoje, é possível determinar a sequência inteira de nucleotídeos de um
genoma, como foi feito para organismos que variam em complexidade,
desde bactérias até o ser humano.
• Isso permite que sejam encontradas sequências especificas com grande
rapidez e precisão.
• O princípio básico do sequenciamento de DNA consiste na separação, por
tamanho, de subconjuntos de moléculas de DNA.
• Assim, para um mesmo subconjunto, todas as moléculas terminarão com
um G, para outro com C, para um terceiro com A e para o subconjunto
final com um T.
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de DNA
• O procedimento mais comumente utilizado, emprega nucleotídeos
terminadores de cadeia (método de Sanger, década de 70) e síntese de
DNA in vitro.
Sequenciamento de DNA
• A ausência do grupo hidroxila impede a adição de novos nucleotídeos, o
que provoca o término do alongamento .
Sequenciamento de DNA
Componentes necessários para reação de sequenciamento:
• Amostra de DNA;
• DNA Polimerase;
• Iniciador (primer);
• Desoxirribonucleotídeos;
• Didesoxirribonucleotídeos.
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Cadeias de DNA interrompidas por ddATP:
Sequenciamento de DNA
Leitura do sequenciamento:
Vídeo sequenciamento método Sanger
3’
5’
Sequenciamento automatizado
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento automatizado: Eletroferograma
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Como sequenciar um genoma com esta metodologia?
Genoma bactéria >600 Kb – precisaria fragmentar em ~1000 partes
Sequenciamento de DNA
Vantagens do método de Sanger
• Alta confiabilidade.
• Possibilidades de leituras com até 1Kb.
• Baixo custo por amostra.
• Ideal para estudo de genes específicos.
Sequenciamento de DNA
Desvantagens do método de Sanger
• Baixo throughput (taxa de transferência/capacidade de gerar dados).
• Grande dificuldade para sequenciar genomas.
• No máximo 96 amostras por vez.
Sequenciamento de DNA
Necessidade de novas estratégias de sequenciamento
• Rápidas
• Menor custo
• Maior capacidade de leitura
• Atender as pesquisas de sequenciamento de genomas
Sequenciamento de DNA
NGS – SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento do genoma inteiro
• Sequenciamento shotgun de genoma inteiro (WGS; do inglês, whole-
genome shotgun).
• Quebra de DNA de longos cromossomos em muitos segmentos curtos
(submete o DNA a altas taxas de vibração ou nebulização, ou pro enzimas
de restrição).
• WGS tradicional - empregou a técnica de sequenciamento didesóxi de
Sanger.
• WGS de última geração - livres de células, empregam novas técnicas
para o sequenciamento e são desenhados para um alto processamento
(número de leituras).
Sequenciamento de DNA
WGS tradicional
• Construção de bibliotecas genômicas.
– Coleções de segmentos curtos.
– Segmentos inseridos em vetores (plasmídeo).
– Propagação em microrganismos, bactérias ou leveduras.
• As sequências de leituras sobrepostas são montadas em unidades
denominadas sequências contigs (sequências que são contíguas ou que se
tocam).
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WGS de última geração
• Tem o mesmo objetivo de obter um grande número de leituras de
sequências sobrepostas que possam ser montadas em contigs.
• Diversos sistemas que, embora sejam diferentes na sua química de
sequenciamento e no desenho de sua máquina, empregam, cada um, três
estratégias que aumentaram consideravelmente a produtividade:
– reações livres de células, sem clonagem em hospedeiros microbianos.
– DNA individuais são isolados e sequenciados em paralelo durante cada operação
da máquina.
– softwares avançados tornam possível detectar os produtos de reações de
sequenciamento em volumes extremamente pequenos.
Sequenciamento de DNA
WGS de última geração
• Não descreverei todos os sistemas de nova geração, tendo em vista que o
campo da tecnologia genômica evolui rapidamente.
• Examinaremos uma abordagem amplamente utilizada que emprega todas
essas três características descritas anteriormente.
• Um dos primeiros sistemas de nova geração foi o 454.
Sequenciamento de DNA
WGS de última geração
• Pode-se considerar que a abordagem tenha três estágios:
1. É construída uma biblioteca de DNA molde de moléculas de DNA
unifilamentares.
2. Moléculas únicas são imobilizadas em esferas individuais (beads). Em seguida,
as moléculas são amplificadas por meio de PCR.
3. Utilização de uma nova química de “sequenciamento por síntese” denominada
pirossequenciamento. A DNA polimerase e um primer são adicionados aos poços
para iniciar a síntese. Duas enzimas, sulfurilase e luciferase, também estão
presentes.
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Preparação da biblioteca
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de DNA
Montagem da sequência do genoma inteiro
• Seja qual for o método de obtenção de sequência bruta utilizado,
permanece o desafio de montar as contigs na sequência do genoma inteiro.
• A dificuldade de tal processo depende fortemente do tamanho e da
complexidade do genoma.
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