Marcadores Moleculares

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Marcadores Moleculares Genéticos: 
identificação de pessoas e teste de 
paternidade
Prof. Fabricio Fernandes
Marcadores Moleculares
• Aproximadamente 99,9% do genoma humano é comum entre quaisquer
indivíduos.
• 0,1% = 3.000.000 pb, onde estão as diferenças em cada um de nós, o que
chamamos de polimorfismos.
• Polimorfismos – fonte de variabilidade, o que nos dá a individualidade e
identidade.
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• Polimorfismo de DNA
– Mutações pontuais: substituição ou inserção/deleção
– Macro-rearranjos: translocações, inversões, deleções
• Parte do nosso genoma é constituído por sequências repetidas em tandem,
denominadas regiões satélites, devido a tendência de formar bandas
quando analisadas.
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Tipos de polimorfismos
– polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP - Single Nucleotide
Polymorphism), pronúncia “snip”.
– número variável de repetições em tandem (VNTR - Variable Number Tandem
Repeat), consiste em marcadores minissatélites, baseados na variação do
número de repetições em tandem de uma unidade repetida de 10 a 100
nucleotídeos. Tamanho total de 1 a 5 Kb.
– Repetições curtas em tandem (STR - Short Tandem Repeat), ou
microssatélites, baseados em números de repetições em tandem de uma
sequencia mais simples, de 2 a 9 nucleotídeos. Tamanho total até 350 pb,
podendo ser analisados pela técnica de PCR.
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SNP’s
• Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP - Single Nucleotide
Polymorphism).
• Pequena mudança, ou variação, que pode ocorrer numa sequência de DNA 
em uma porção significativa (mais de 1% ) de uma população.
• Variações nas sequências são resultados de mutações.
• Codominante: indivíduos heterozigotos são detectados.
• Necessário sequenciamento.
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Aplicações dos SNP’s
• Genotipagem - padrões de SNP.
• São marcadores para identificar genes e diferenças genéticas que podem
determinar a resposta de pacientes a uma doença ou tratamento.
• Diagnóstico ou perfil de risco.
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Minissatélites
• Também conhecidos como número variável de repetições em tandem
(VNTR - Variable Number Tandem Repeat).
• Sequências de 15 a 100 nucleotídeos repetidas em tandem.
• Normalmente locus multi-alélico.
• Codominante: indivíduos heterozigotos são detectados.
• Bandas de tamanho total entre 1 e 5 Kb.
• Necessita de RFLP com sondas específicas.
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Minissatélites
• Foi utilizada por quase 10 anos em casos de paternidade.
• Como desvantagem, a tipagem de alelos VNTR requer DNA íntegro e em
grande quantidade (100-500 ng), tornando praticamente inviável a tipagem
de amostras biológicas antigas, degradadas ou com pouca quantidade de
DNA.
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Microssatélites
• Também conhecidos como repetições curtas em tandem (STR’s) ou
repetições de sequências simples (SSR’s).
• Sequências curtas (2 a 9 bases) repetidas em tandem.
• Normalmente locus multi-alélico.
• Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições
– Deslocamento da DNA polimerase durante a replicação
– Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
• Codominante: indivíduos heterozigotos são detectados.
• Altamente reprodutível.
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Microssatélites
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ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG 
GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG 
TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA 
TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC 
ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT 
CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG 
AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC 
CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG 
 
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN
Primer REV
Primer FOR
Repetição CA
Microssatélites
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Características dos polimorfismos STRs
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• Marcadores STRs ou microssatélites
– Localizados em locais específicos do genoma e distribuídos aleatoriamente
dentro das populações.
– Cada individuo carrega 2 cópias desses polimorfismos, um do pai e outro da
mãe.
• Utilização de marcadores microssatélites
– Identificação de pessoas.
– Exclusão da paternidade.
– Probabilidade da paternidade.
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Marcadores microssatélites
• Quantos desses marcadores de STRs nos fazem únicos?
• Foram definidos pelo FBI por meio de estudos populacionais.
– São necessários pelo menos 13 marcadores.
• A análise pode ser feita diretamente em um sequenciador automático,
sendo o resultado analisado por meios de picos no Eletroferograma (gráfico
do resultado).
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CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
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• PCR Multiplex marcadores STR’s
– Até 16 marcadores podem ser utilizados por tubo.
– Pode ser utilizado pequenas quantidades de DNA (1 ng).
– DNA de baixa qualidade e degradado.
– O uso de fluorescências de cores diferentes permitem a
análise de produtos de PCR de mesmo tamanho.