2015414_17637_Tecnologia+do+DNA+recombinantemodif

Prévia do material em texto

Valeska Portela Lima 
Conceitos Básicos 
 O Dogma Central da Biologia Molecular foi 
descrito em 1958 por Francis Crick na tentativa 
de relacionar o DNA, o RNA e as proteínas, 
salientando o fluxo unidirecional da 
informação: do DNA à proteína. 
Tecnologia do DNA recombinante 
 Até o início da década de 70 o material genético dos 
organismos era o componente químico mais difícil de ser 
analisado; 
 
 Surgimento das primeiras técnicas de isolamento e 
purificação de genes específicos, através do processo de 
clonagem gênica; 
 
 Técnicas provenientes da Microbiologia, Bioquímica, 
Imunologia e Genética Microbiana permitiram que a 
molécula de DNA ganhasse um novo enfoque; 
 
 DNA mais fácil de ser analisado, possibilitando o isolamento 
de regiões específicas da molécula, obtê-las em grandes 
quantidades e determinar a sua seqüência numa velocidade 
de milhares de nucleotídeos por dia. 
Tecnologia do DNA recombinante 
 Tecnologia do DNA Recombinante, também 
chamada Engenharia Genética ou 
Biotecnologia, é um conjunto de técnicas para 
localizar, isolar, alterar e estudar segmentos de 
DNA; 
 
 O termo recombinante é devido 
freqüentemente tais técnicas serem usadas 
para combinar o material genético de fontes 
distintas, tornando-o bem sugestivo. 
 
 
Tecnologia do DNA recombinante 
 Objetivos da manipulação de DNA: 
 
 Estudos genômicos e de expressão de mRNAs; 
 Métodos de diagnóstico: Engenharia Genética; 
 Expressão heteróloga de proteínas; 
 Vacinas de DNA; 
 Produção de organismo transgênicos; 
 Terapia Gênica; 
 Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-
proteína; 
 Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas. 
 
Tecnologia do DNA recombinante 
 Baseia-se em propriedades do DNA: 
 
 1 O DNA pode ser cortado em posições específicas: 
Endonucleases de restrição 
 2 Seleção de pequenas moléculas de DNA capazes de 
auto-replicação: Vetores 
 3 Diferentes moléculas de DNA podem ser ligadas 
covalentemente: DNA-Ligase e DNA recombinante 
 4 Moléculas específicas de DNA podem ser amplificadas: 
Reação em cadeia da polimerase - PCR 
 5 Moléculas de DNA sintéticas podem ser inseridas em 
células vivas: Transformação de células 
 6 Células contendo o DNA recombinante pode ser 
selecionada: Seleção do clone 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição 
 Designação: abreviação de 3 letras mais 
numeral romano: 
 
○ Hind III - Haemophilus influenza (linhagem Rd); 
○ EcoRI - Escherichia coli - primeira endonuclease 
retirada da linhagem RY13. 
 
 Enzimas especializadas em degradar DNA 
exógeno em bactérias; 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição 
 Mecanismo de defesa contra infecção viral; 
 Reconhecem seqüências palindrômicas de 
DNA: lidas da mesma forma em ambos os 
sentidos 
Clivagem em extremidades coesivas ou cegas 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição 
Clivagem em 
extremidades coesivas ou cegas 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição 
 Reconhecem seqüências específicas, sítios de 
restrição. 
Endonucleases ou enzimas de 
Restrição: uso 
 Em vetores de clonagem; 
 
 Pesquisa de polimorfismos; 
 
 Genotipagem de microorganismos. 
Vetores de clonagem 
 Plasmídios e bacteriófagos; 
 
 Moléculas de DNA capazes de auto-replicação; 
 
 Tamanho: 1 a 200 kbp; 
 
 Carregam vantagens para o hospedeiro; 
 
 Marcas de seleção 
 Permitem a 
propagação de 
moléculas de DNA de 
interesse; 
 
 Possuem sítios 
múltiplos de clonagem; 
 
Vetores de clonagem 
Vetores de clonagem 
Vetores de expressão 
 Permite a expressão controlada da proteína; 
 
 Fragmento de DNA deve ser inserido em fase 
de leitura; 
 
 Indução da expressão; 
 
 Proteína pode ser purificada. 
DNA ligase 
 DNA ligase: liga moléculas de DNA; 
DNA recombinante 
 Técnica de biologia molecular empregada para obter-se 
amplificação exponencial de fragmentos de DNA alvo in 
vitro, empregando elementos do processo natural de 
replicação do DNA; 
 
 O conceito de amplificação do DNA não é novo e sempre 
foi utilizado, entretanto, a amplificação era feita in vivo e não 
in vitro como na PCR. 
 PCR: DEFINIÇÃO 
 BREVE HISTÓRICO 
 Técnica “inventada” em 1985 por Kary B. 
Mullis; 
 A técnica já existia, entretanto, a DNA 
polimerase utilizada (E. coli) era destruída 
durante os ciclos de aquecimento e era 
necessário adição consecutiva a cada novo 
ciclo; 
 Foi o primeiro a sugerir a utilização de uma 
DNA Polimerase “termoestável”. 
 
 Kary Mullis X Cetus Corporation 
 
 
 
 Prêmio Nobel de US$ 300 milhões 
Química em 1993 Roche Molecular Systems 
 
 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma 
nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na 
água a temperatura média de 75ºC; 
 DNA POLIMERASE TERMOESTÁVEL 
Yellowstone National Park 
 Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo 
a primeira DNA polimerase termoestável – Taq DNA 
polimerase (1976) 
 PCR 
 
 Componentes 
 PCR 
 
 A reação 
DESNATURAÇÃO → ANELAMENTO  EXTENSÃO 
 PCR 
 
 A reação: 1º ciclo 
 PCR 
 
 A reação: após sucessivos ciclos 
 PCR 
 
 Detecção de mutações/polimorfismos em genes 
específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e 
doenças genéticas; 
 
 Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de 
bactérias, vírus e protozoários; 
 
 Elucidar relações evolutivas entre espécies; 
 
 Fingerprinting – paternidade; 
 
 Grande potencial na Medicina Forense. 
 APLICAÇÕES 
 ELETROFORESE 
 É a migração de partículas em um determinado gel 
(gelatina) de acordo com seu tamanho e sua carga elétrica; 
 
 O gel é formado por conjuntos de moléculas e polímeros 
que formam uma rede; 
 
 A eletroforese normalmente é utilizada para separar 
proteínas ou moléculas de DNA ou RNA. 
 ELETROFORESE 
 ELETROFORESE 
 ELETROFORESE 
 ELETROFORESE 
506 pb 
491 pb 
 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
 POLIMORFISMO DE MICROSSATÉLITES 
Questão 01 
Uma cientista forense foi chamada para analisar evidências de uma 
cena de assassinato. Ela colheu amostras de sangue da vítima, de 
uma mancha de sangue na roupa da vítima, provavelmente do 
assassino, e de dois outros suspeitos. Ela isolou DNA e determinou o 
padrão usando uma sonda. Examinando o resultado do gel abaixo, o 
que a cientista pode conclui? 
Vítima Vítima Suspeitos 
Mancha de sangue 
Questão 02 
De uma cena de assassinato, amostras foram coletadas da vítima, de 
dois suspeitos e de pele embaixo da unha da vítima. Analisando os 
resultados abaixo, quais as conclusões que é possível obter? 
Vítima Vítima 
Suspeito 1 
Suspeito 2 
Amostra de pele 
Questão 03 
Baseado nos resultados abaixo, que criança poderia ser excluída como 
filha do casal? 
Criança 1 
MÃE 
Criança 2 
Criança 3 
PAI 
Criança 4 
Clonagem molecular 
 Transformação de células: 
○ permite a introdução de DNA exógeno em células 
adequadas; 
○ etapa crucial para a criação de um clone: 
 Pode ser feita por: 
○ Eletroporação ; Choque térmico ; Cálcio 
 
 Seleção de clones transformantes: usa-se meio 
seletivo no qual somente as células que 
contêm os plasmídios com a marca de seleção 
sobreviverão Ex: AntibióticoClonagem molecular 
Sequenciamento 
 Método de dideóxi-ribonucleotídeos 
 Fluorescência – Necessita de um fluoróforo 
ligado à molécula 
 Fluoriceínas ligadas aos diferentes ddNTP 
Sequenciamento 
Obrigada!!!!!