Aula_Pratica_Bastonetes_Gram-Positivos_SALGADODAY

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BASTONETES GRAM-POSITIVOS 
Identificação de Bastonete 
esporulado 
• Espécies de Bacillus e Clostridium - 
formam esporos que se desenvolvem 
em determinadas posições e tamanhos, 
que servem de características no 
trabalho de identificação. 
TÉCNICA PARA COLORAÇÃO DE ESPOROS 
(Wirtz-Conklin) 
 
 
•Coloração com verde malaquita 
 
• O tempo prolongado de exposição ao corante 
(verde malaquita), associado ao aquecimento, 
permite a coloração do esporo em verde 
intenso. 
• Como contracorante é utilizada a safranina, 
que cora outras estruturas em rosa, facilitando 
a diferenciação dos esporos. 
ISOLAMENTO 
•Isolamento primário: 
•Ágar sangue – Jarra de anaerobiose - 35 a 37 ºC 
 IDENTIFICAÇÃO 
Morfologia das colônias 
Variável de acordo com a espécie: 
 Colônias elevadas com bordas definidas: C. perfringens 
 Colônias menores que se estendem por filamentos finos: C. tetani 
Colônia em “cabeça de medusa”: C. sporogenes. 
 
 
IDENTIFICAÇÃO 
 CARACTERÍSTICAS DE CRESCIMENTO 
 
 Ágar sangue → C. perfringens forma zonas duplas de hemólise. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ágar glicosado em camada alta: C perfringens intensa 
produção de gás (fragmentação do meio) 
 
 
IDENTIFICAÇÃO 
 Coloração de Gram - As colorações 
especiais para esporos usualmente não 
oferecem vantagens adicionais - difícil 
observação em C. perfingens 
 Prova da catalase→ negativa. 
 
 
 
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIE 
 Lecitinase em meio com gema de ovo→ Reação 
de Nagler 
 Produção de lipase em ágar de gema de ovo→ 
alguns clostrídeos (C. botulinum, C. sporogenes e C. 
novyi tipo A) produzem lipase. 
 Liquefação da gelatina→ produção da enzima 
gelatinase. 
 Proteólise do leite→ Ação de proteases sobre a 
caseína. 
 Proteólise da carne (Meio de Tarozzi)→ digestão 
das partículas da carne pela ação das proteases. 
 Fermentação de Açúcares - lactose, glicose, 
sacarose, ramnose, manitol. 
 
 
Identificação de bacilos gram 
positivos anaeróbios com o uso de 
provas bioquimicas 
(Abaixo ilustrativo) 
Identificação de algumas espécies 
do gênero Clostridium 
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Identificação de algumas espécies 
do gênero Clostridium 
Identificação Laboratorial 
Amostras de Alimentos 
 Aquecer 80ºC por 10’ 
 
 Caldo de enriquecimento 
 
 Outras metodologias 
C = anaeróbio estrito 
aer = aeróbios 
fac .= anaeróbios 
facultativos 
aerotol.= aerotolerantes 
 
•Meios contendo tioglicolato de sódio 
Identificação Laboratorial 
“Pour Plate” 
Incubar 45ºC / 48-72 h 
Agar SPS 
SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina) 
Ágar nutriente 
inclinado (37ºC/48h) 
ANAEROBIOSE 
Catalase (-) KOH 3%(-) 
Análise presuntiva das colônias 
Gram (+) 
Testes Bioquímicos 
Testes Bioquímicos 
Identificação Laboratorial 
 Testes Bioquímicos: 
 
- SIM (H2S; Indol; Motilidade) 
- Esculina 
- Gelatina 
- Urease 
- Fermentação de açúcares 
 (Glicose;Manitol; Ramnose e Lactose) 
BASTONETES GRAM-POSITIVOS ESPORULADOS 
AERÓBIOS E ANAERÓBIOS FACULTATIVOS 
1. Semear Ágar Sangue – Amostras clínicas 
2. Semear em Ágar MYP – Amostras de alimentos 
 
 Bom crescimento, colônias grandes, expandidas, 
branco acinzentadas, com bordas irregulares. 
 Muitos isolados clínicos são hemolíticos, 
(diferenciação entre espécies de Bacillus e B. 
anthracis – não hemolítico). 
CARACTERÍSTICA DA COLÔNIA 
Bacillus anthracis 
 Planas e irregulares, não hemolítico 
(diferenciação de isolados α ou β-hemolíticos – 
Bacillus) 
 
Bacillus cereus 
 Elevadas, irregulares, com aspecto de vidro 
esmerilhado acinzentado ou esverdeado, bordas 
onduladas, 
 halo de hemólise (freqüência) 
2. Coloração de gram 
 Bacilos gram-positivos, grandes, extremidades 
retas ou côncavas. 
 
 Bacillus anthracis - Pode-se observar endósporos 
ovóides subterminais que não produzem 
tumefação no interior das células 
 
3. Prova da Catalase - Positiva 
 
DIFERENCIAÇÃO - GÊNERO Bacillus 
 SIM 
 Fermentação de carboidratos: glicose, manitol, 
xilose, lactose, maltose, sacarose 
 Caldo Nitratado 
POSITIVO NEGATIVO 
DIFERENCIAÇÃO - GÊNERO Bacillus 
 APGF (VP) 
 Hidrólise da Gelatina 
 Hidrólise da Esculina 
DIFERENCIAÇÃO DE ESPÉCIES DO GÊNERO 
Bacillus 
 Espécies Motilidade Glic Xil Man Lac Sac Mal Red 
de 
nitrato 
Indol VP Gelatina Esculina 
B. anthracis - + - - - + + + - V + V 
B. cereus + + - - - V + V - V + V 
B. mycoides - + - - - V + V - - - + 
B. 
megaterium 
V + V + V + V - - - + V 
B. 
licheriformi
s 
V + V + - + + + - V V + 
B. subtilis V + - + - + V V - V + + 
 
Espécies Motilidade Glicose Xilose Manitol Lactose Sacarose Maltose Redução 
de 
nitrato 
Indol V
P 
Gela
tina 
Escul
ina 
B. firmus + + V + V + + V + - V V 
B. pumilus + + - + - + - - - V + + 
B. macerans V + V + + + + + - - + 
B. polymyxa + + + V + + + + - + + 
B. circulans + + + + + + + V - - - + 
B. 
stearothermo
philus 
+ + - - V + + + - - + 
B. lateroporus + + - + - - + + V - + + 
B. alvei + + - - - + + V + V + + 
B. brevis + V + + - V V V - V V 
B. sphaericus + - - - - - - V - - - - 
B. 
thuringiensis 
+ + - - - + + + - - + 
B. lentus + E - E E E E - - - + 
DIFERENCIAÇÃO DE ESPÉCIES DO 
GÊNERO Bacillus 
DIFERENCIAÇÃO DE ESPÉCIES DO GÊNERO Bacillus 
- IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA 
 
Espécies Hemólis
e 
Motilidade Hidrólise 
de 
gelatina 
(em 7 
dias) 
Fermentação 
de 
salicina 
Crescimento em agar 
sangue-álcool 
feniletilico 
B. anthracis - - - - - 
B. cereus + + 
usualmente 
+ + + 
Bacillus cereus 
 
 VIRULÊNCIA Hemolisinas (Exotoxinas) 
 
 
 Síndrome diarréica (termolábil - 56ºC / 5’) 
 Produtos cárneos, pescado, leite, produtos amiláceos, vegetais 
cozidos e brotos crus. 
 
 Síndrome emética (termoestável -120ºc / 60’) 
 Arroz 
Processamento das Amostras: 
 
DILUIÇÃO 10-1 
25g amostra em 
225ml Água 
Peptonada 0,1% 
esterilizada. 
Diluição 10-4 
1ml 
1ml 1ml 
Diluição 10-2 Diluição 10-3 
Identificação Laboratorial 
Identificação Laboratorial 
 diluições 
 duplicata 
 técnica de “Spread Plate” 
 
 
MYP 
Isolamento de 
Bacillus cereus 
Incubar : 
35ºC/24horas 
MYP (Manitol Yolk Polimixin) 
Isolamento e identificação de Bacillus cereus 
 Contagem viável em placas - Superficial (UFC/g) 
Gram (+) 
Ágar nutriente 
inclinado(35ºC/24h) 
Catalase (+) 
KOH 3% (-) 
Testes bioquímicos 
e confirmativos 
Análise presuntiva das colônias 
BASTONETES GRAM – POSITIVOS 
 NÃO ESPORULADOS 
BASTONETES GRAM – POSITIVOS 
 NÃO ESPORULADOS 
 Catalase 
Negativo Positivo 
Erysipelothrix Corynebacterium 
Listeria 
 
Oxidase 
SIM 
CAMP 
Esculina 
Ureia 
Gelatina 
 Gênero Corynebacterium 
 
 Gênero Listeria 
 
 Gênero Erysipelothrix 
Gênero Corynebacterium 
 Gram-positivas 
 
 Pleomórficos 
 
 Letras Chinesas 
 
 Não formadoras de esporos 
 
 Sem motilidade (há exceções) 
 
 Aeróbicos - microanaero/anaerobiose 
 
 
 
Gênero Corynebacterium 
COLETA DE MATERIAL E ISOLAMENTO 
 
 Espécie animal afetada sugere diagnóstico Material p/ laboratório: pus, exsudato, amostras de tecido 
afetado, urina 
 Visualização direta (esfregaço) por Gram – sugestivo 
 Meios de cultura – ágar sangue-cistina-telurito 
 Placas incubadas a 37ºC – 24 a 48 horas 
 
Gênero Corynebacterium 
DIAGNÓSTICO 
 
 Características coloniais (difere entre espécies) 
 Presença ou não de hemólise 
 Aerobiose/anaerobiose 
 pleomorfismo 
 Testes bioquímico convencional ou comercial 
 Teste da intensificação da hemólise 
 (C. pseudotuberculosis) 
 Diferenciação entre espécies: OF glicose, redução do nitrato, urease, 
utilização de carboidratos e reação de CAMP. 
 
 Carat. Principais: catalase positivos, imóveis , esculina negativos, 
gelatina negativos, fermentadoras ou não de CH. 
 
 Obs.:1) Recomenda-se a coloração de Albert-Laybourn para 
visualização de grânulos metacromáticos. 
 
Gênero Corynebacterium 
Corynebacterium bovis - mastite 
 Colônias pequenas, brancas, secas, não-hemolíticas 
 
Corynebacterium pseudotuberculosis 
Ovino/caprino (não-reduz de nitrato) – linfadenite caseosa 
Equino/bovino (reduz de nitrato) – linfadenite ulcerativa, abscessos 
 Colônias pequenas, brancas, zona estreita hemólise completa 
Intensificação da hemólise (Rhodococcus equi) 
 
 
Gênero Corynebacterium 
Corynebacterium renale 
 Colônias pequenas, não-hemolíticas, produz pigmento 
 
Tipo I – Bovinos: cistite, pielonefrite 
 Ovinos: balanopostite ulcerativa 
Tipo II – Bovinos: cistite, pielonefrite 
Tipo III – Bovinos: cistite grave 
 
Corynebacterium ulcerans – mastite 
 
Produzem UREASE 
Fímbrias – mucosa urogenital 
Gênero Corynebacterium 
Linfadenite caseosa C. pseudotuberculosis 
Gênero Corynebacterium 
Linfangite ulcerativa C. pseudotuberculosis 
Gênero Listeria 
 Bastonetes Gram-positivos 
 
 Pleomórficos - pequenos 
 
 Não formadores de esporos 
 
 Móveis 
 
 Anaerobiose facultativa 
 
 Crescimento 4 a 45ºC 
Cauda de actina polimerizada corada em verde 
Gênero Listeria 
DIAGNÓSTICO 
 
Listeria monocytogenes 
 
 Colônias pequenas 
 Translúcidas 
 Lisas 
 Azul-esverdeada (45º) 
 Ácido (glicose) 
 Vermelho de Metila + 
 Não reduz nitrato 
Listeria spp. 
 
 Material: hemocultura, LCR. Placenta, alimentos(, água,etc. 
 
 Isolamento: semeadura em ágar sangue, ágar chocolate, CLED., ágar nutriente, 
TSA., AMH. Incubar entre 25ºC(móvel) e 37ºC(imóvel). É anaeróbio facultativo. 
 
 Caract. coloniais: colônias pequenas. 
 
 Bioquimismo: Catalase(+),oxidase (-), glicose(+ ác.),CAMP(+), esculina(+), uréia(-
), gelatina(-), indol(-), H2S(-). 
 
 Espécie tipo: L. monocytogenes 
 
 
Gênero Listeria 
DIAGNÓSTICO 
 
 
 Móvel (guarda-chuva) 
 
 Beta-hemólise 
 
 CAMP test positivo 
 
 
 
 
Gênero Listeria 
Gênero Erysipelothrix 
 Gram-positiva 
 
 Não-esporulada 
 
 Imóvel 
 
 Tende a formar filamentos 
longos 
 
• Anaeróbios facultativos 
Gênero Erysipelothrix 
DIAGNÓSTICO 
 
 Morfologia após incubação 48h 
 
 Estreita zona de hemólise 
(esverdeada) 
 
 Catalase – 
 
 Produção de coagulase 
 
 
Erysipelotrix spp. 
 Material: coletar na profundidade da lesão pois, é anaeróbia facultativa, 
preferindo o interior desta. 
 
 Isolamento: a. sangue, a. chocolate ou caldo tripticase soja, a 35ºC em aerobiose 
ou 5% de CO2, incubado por 24-48h. 
 
 Caract. coloniais: no a. sangue crescem tanto colônias minúsculas, lisas e 
transparentes quanto grandes, rugosas e achatadas. Ocorre hemólise 
esverdeadas sob as colônias. 
 
 Provas bioquímicas: catalase(-), motilidade(-) , esculina(-), glicose(fraco+ s/ gás) , 
indol(-), H2S em TSI (+), lactose(+), sacarose(-). 
 
 Obs.: Crescem em caldo NaCl 6,5% entre 5ºC e 42ºC 
Gênero Erysipelothrix 
Erysipelothrix rhusiopathiae