Relatorio Aulas praticas Bioquimica_vet 07

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE 
BIOQUÍMICA ANIMAL (ZMZ-1301) 
 
 
 
Docente: Prof. Dr. Edson Roberto da Silva 
 
Componentes do grupo: 
Carolina Zanetti de Paula 
Gabriela Lopes Miranda 
Marina Del Monte 
Micheli Midori de Cerqueira C.A. 
Vitória Mattos Pereira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pirassununga 
2015 
 
 
 
 
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SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1 
2. CURVA DE TITULAÇÃO DA GLICINA ............................................................................ 1 
2.1. Materiais e métodos ...................................................................................................... 2 
2.2.Resultados ....................................................................................................................... 3 
2.3. Conclusões ..................................................................................................................... 5 
3. MANIPULAÇÃO DE ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS ............................................. 6 
3.1. Materiais e métodos ...................................................................................................... 6 
3.2.Resultados ....................................................................................................................... 8 
3.3. Conclusões ................................................................................................................... 14 
4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM MEIO AQUOSO – MÉTODO DE 
BRADFORD ....................................................................................................................... 15 
4.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 15 
4.1.1 Preparação da Curva Padrão ............................................................................. 17 
4.1.2 Preparação do Branco ......................................................................................... 18 
4.1.3 Preparação da Amostra ....................................................................................... 18 
4.1.4 Quantificação ........................................................................................................ 18 
4.2.Resultados ..................................................................................................................... 19 
4.3. Conclusões ................................................................................................................... 20 
5. CATALISE E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA ARGINASE DE LEISHMANIA 
AMAZONENSIS ................................................................................................................ 21 
5.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 21 
5.2.Resultados ..................................................................................................................... 24 
5.3.Conclusões .................................................................................................................... 25 
6. DETERMINAÇÃO DA GLICOSE – MÉTODO ENZIMÁTICO-COLORIMÉTRICO . 26 
6.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 26 
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6.2.Resultados ..................................................................................................................... 29 
6.3.Conclusões .................................................................................................................... 31 
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 32 
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 33 
 
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TABELAS 
TABELA 2.1: Variação de pH x NaOH 
TABELA 3.1: Resumo das características dos aminoácidos de interesse 
TABELA 4.1: Dados para curva padrão de albumina 
TABELA 4.2: Absorbância das amostras de fígado bovino 
TABELA 4.3: Resumo dos cálculos para determinar a quantidade de proteína na amostra 
TABELA 5.1: Preparo da reação de inibição enzimática e controles 
TABELA 5.2: Análise do produto (uréia) formado pela hidrólise de L-arginina 
TABELA 5.3: Leituras de absorbância das amostras de interesse 
TABELA 6.1: Diluição seriada do Padrão de Glicose 
TABELA 6.2: Diluição para determinação da glicose nas Amostras 1 e 2 
TABELA 6.3: Leitura de Absorbância para curva padrão 
TABELA 6.4: Concentração de glicose nas amostras de interesse 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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FIGURAS 
FIGURA 3.1: Estrutura tridimensional da Hemoglobina 
FIGURA 3.2: Grupo heme 
FIGURA 3.3: Pontos de hidrogênio em α-Hélice 
FIGURA 3.4: Arginase L 
FIGURA 3.5: α-Hélice em Arginase L 
FIGURA 3.6: Folha β-Pregueada em Arginase L 
FIGURA 3.7: Pontes de hidrogênio em Folha β-Pregueada 
FIGURA 3.8: Distância entre aminoácidos na α-Hélice da Arginase L 
FIGURA 3.9: Distância entre aminoácidos na Folha β-Pregueada da Arginase L 
 
 
 
 
 
 
 
 
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GRÁFICOS 
GRÁFICO 2.1: Volume (NaOH) x pH 
GRÁFICO 2.2: Volume (NaOH) x ∆pH 
GRÁFICO 2.3: Volume (NaOH) x ∆2pH 
GRÁFICO 4.1: Curva Padrão da Albumina 
GRÁFICO 6.1. Curva Padrão de Glicose 
 
 
 
 
 
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QUADROS 
QUADRO 2.1: Materiais utilizados para titulação da glicina 
QUADRO 3.1: Download da estrutura das proteínas de interesse 
QUADRO 4.1: Síntese de Materiais e Métodos – Método de Bradford 
QUADRO 5.1: Síntese de Materiais e Métodos – Inibição Enzimática 
QUADRO 6.1: Procedimentos – Determinação da Glicose 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUÇÃO 
Durante o primeiro semestre de 2015, foram realizados 06 experimentos práticos de maneira a 
complementar o estudo da disciplina de Bioquímica Animal (ZMZ-1301). Abaixo, segue a relação 
dos experimentos realizados: 
1. Curva de titulação da glicina: determinação de pKa e efeito tampão (09/03/2015); 
2. Manipulação de estrutura 3D de proteínas (16/03/2015); 
3. Determinação de proteínas em meio aquoso – Método de Bradford (23/03/15) 
4. Inibição enzimática (27/04/2015); 
5. Determinação de Glicose - Método enzimático-colorimétrico (25/05/2015); 
Cabe lembrar que todos os experimentos foram supervisionados pelo do Prof.Dr. Edson Roberto 
da Silva. As considerações e resultados ora apresentados são baseados nas informações obtidas 
durante a execução dos trabalhos e em consultas bibliográficas. 
Este relatório descreve as atividades conduzidas, bem como detalha os métodos empregados, 
conclusões e recomendaçõesformuladas. 
 
2. CURVA DE TITULAÇÃO DA GLICINA 
A glicina é um dos componentes que constitui os aminoácidos apolares, onde também são 
encontrados: alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina etriptofano. Esta 
substância é um aminoácido que apresenta um pKa característico, que pode ser determinado 
experimentalmente através da titulação com ácido ou com uma base forte. 
Esta constante pode ser identificada através da curva de titulação, uma vez que nestes pontos a 
capacidade tamponante é máxima. 
Titulação é uma técnica comum de laboratório em análise química quantitativa, usado para 
determinar a concentração de um reagente conhecido. A substância de interesse em qualquer 
determinação recebe o nome de analito. A espécie química com concentração definida recebe o 
nome de titulante, que é, em geral, uma solução obtida a partir de um padrão primário, podendo 
ser um sal ou uma substância gerada na solução que se deseja valorar. A solução a ter sua 
concentração determinada recebe o nome de titulado. 
O principal objetivo deste experimento foi reconhecer as modificações na estrutura de um 
aminoácido neutro (glicina) por efeito da variação do pH, identificando os grupos tamponantes do 
aminoácido glicina e os valores de pH onde eles ostentam a maior capacidade tamponante, 
comparando os valores obtidos de pH experimentalmente aos dados bibliográficos. 
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Este relatório detalha os procedimentos e resultados do experimento realizado para a titulação 
da substância glicina. 
2.1. Materiais e métodos 
O método consiste em reagir completamente um volume conhecido de uma amostra com um 
volume determinado de um reagente de natureza e concentração conhecida (solução padrão). No 
processo de titulação ácido-base, faz-se reagir um ácido com uma base para que se atinja o ponto 
de equivalência. À medida que é adicionado o titulante ao titulado, o pH da solução 
(titulante+titulado) vai variar, sendo possível construir um gráfico desta variação, ao qual se dá o 
nome de curva de titulação. O ponto de equivalência pode variar dependendo da concentração 
inicial do titulante e do titulado. 
Para a realização do experimento utilizou-se os seguintes materiais: 
1. Solução de glicina a 100mM; 
2. Hidróxido de sódio (NaOH) com concentração de 10M; 
3. Pipeta de 100uL; 
4. Béquer; 
5. PHmetro marca Bell modelo W3B. 
O QUADRO 2.1 apresenta os materiais utilizados. 
QUADRO 2.1: Materiais utilizados para titulação da glicina 
 
 
 
 
 
 Neste experimento, adicionou-se hidróxido de sódio à solução de glicina por meio de uma pipeta 
de 100μl. Ao todo, foram realizados 21 procedimentos totalizando 2.000μl de NaOH na solução de 
Béquer Pipeta Phmetro 
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glicina. 
 O procedimento consistiu em realizar a medição de pH da solução de glicina, utilizando-se 
pHmetro eletrônico. A cada adição de NaOH, o pH foi novamente medido, de maneira a construir 
uma curva de variação. 
Salienta-se que não houve controle de temperatura ambiente durante o experimento. 
2.2.Resultados 
Os resultados obtidos no experimento do sistema tampão são apresentados na TABELA 2.1. 
Note que o pH variou de 6,86 (glicina pura) a 11,63 (2.000ul de glicina), o que significa que 
passou de um pH aproximadamente neutro para básico, demonstrando a ionização do NaOH. 
 
 TABELA 2.1: Variação de pH x NaOH 
V(uL) NaOH pH ∆pH1 ∆pH2
0 6,86 - -
100 9,41 2,55 -
200 9,40 0,01 2,54
300 9,42 0,02 0,01
400 9,44 0,02 0,00 pKa
500 9,49 0,05 0,03
600 9,59 0,10 0,05
700 9,65 0,06 0,04
800 9,82 0,17 0,11
900 9,99 0,17 0,00
1.000 10,30 0,31 0,14
1.100 10,74 0,44 0,13
1.200 10,95 0,21 0,23
1.300 11,14 0,19 0,02
1.400 11,24 0,10 0,09
1.500 11,34 0,10 0,00
1.600 11,42 0,08 0,02
1.700 11,49 0,07 0,01
1.800 11,54 0,05 0,02
1.900 11,58 0,04 0,01
2.000 11,63 0,05 0,01
 
Com base na variação do pH calculada na terceira e quarta coluna da tabela pode-se inferir que 
o pka do grupo amina da glicina para o experimento foi de 9,44, compatível com o verificado na 
literatura (9,6). 
De maneira a melhor entender o comportamento da curva de titulação da glicina foram 
confeccionados os GRÁFICOS 2.1, 2.2 e 2.3, ressaltando-se que as variações calculadas no ApH1 
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e ApH2, são apresentados em módulo. 
 
GRÁFICO 2.1: Volume (NaOH) x pH 
9,41 9,44
10,74
0
2
4
6
8
10
12
14
0 500 1.000 1.500 2.000
pH
Volume de NaOH (uL)
V(NaOH) x pH
 
Conforme verifica-se, a adição das primeiras 100 µL de hidróxido de sódio foi suficiente para 
elevar em 2,55 o pH, transformando uma solução com tendência neutra (6,86) em uma solução 
básica (9,41), sendo este o primeiro pico verificado no gráfico. O segundo pico, menos 
proeminente, ocorre quando o montante de base adicionada totaliza 1.100 μL , elevando o pH para 
10,74. Neste contexto, verifica-se que o valor do pKa encontrado está em uma zona de crescente 
mínimo ou nulo. 
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
∆
pH
Volume de NaOH (uL)
GRÁFICO 2.2: V(NaOH) x ∆pH
 
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
∆
2 p
H
Volume de NaOH (uL)
GRÁFICO 2.3:V(NaOH) x ∆²pH
 
Os GRÁFICOS 2.2 e 2.3 são muito semelhantes, comprovando que as maiores variações 
ocorreram com a adição de 100µL de hidróxido de sódio à solução de glicina. Ambos gráficos 
ainda confirmam um segundo pico entre o volume de 1.000 e 1.220 μl da solução básica. 
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Note que os gráficos diferem apenas em relação ao eixo Y, ou seja, verifica-se que o GRÁFICO 
2.3 está deslocado um pouco mais para “baixo” que o GRÁFICO 2.2 no segundo pico. 
2.3. Conclusões 
De acordo com Lehninger, os pKas da glicina são: pKa1 igual a 2,34 e o pKa2 igual a 9,60. 
Conforme verificou-se, uma vez que o experimento iniciou-se com pH igual a 6,86, o primeiro pka 
não pode ser definido. 
Em relação ao pKa2, no experimento obteve-se valor igual a 9,44, sendo este inferior ao dado 
bibliográfico, entretanto, uma vez que tal alteração foi inferior a 2%, considera-se que o 
experimento foi satisfatório para obtenção do pKa na reação. Ressaltando-se que tais variações 
podem ocorrer em virtude de alterações das concentrações de íons na solução ou mesmo em 
decorrência da sensibilidade do sensor do pHmetro. 
 
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3. MANIPULAÇÃO DE ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS 
Proteínas são formadas a partir de três ou quatro estruturações, sendo que considera-se a 
estrutura secundária como sendo tridimensional. Dentre os métodos mais conhecidos para 
caracterização das estruturas, pode-se mencionar a cristalografia por difração de raio-x, 
espectroscopia de RMN e modelagem molecular comparativa. 
Atualmente, existem bancos de dados nos quais são disponibilizadas as estruturas 
tridimensionais de diversas moléculas, as quais, ao serem trabalhadas em softwares específicos 
ampliam os conhecimentos do aluno, permitindo que seja possível localizar e entender como se 
relacionam os diversos componentes das moléculas de interesse (pontes de hidrogênio, pontes de 
sulfeto, estruturas primárias,secundárias, grupos funcionais, entre outros). 
O objetivo deste experimento foi colocar o aluno em contato com as principais ferramentas para 
compreensão de estruturas tridimensionais e, se familiarizar com a plataforma do software USF 
CHIMERA e principais ferramentas de busca. 
3.1. Materiais e métodos 
De acordo com o roteiro da aula prática, pode-se dividir o experimento em duas partes. A 
primeira envolvia a pesquisa de estruturas de compostos químicos (glicina, alanina, valina, leucina, 
isoleucina, metionina e prolina) em site indicado (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Nesta etapa, 
os compostos foram pesquisados e planilhados. 
Na segunda parte do experimento, as estruturas tridimensionais da hemoglobina de Canis 
familiares e arginase de Leihmania deveriam ser estudas com auxílio do programa USF CHIMERA, 
um programa para visualização interativa e analises de estruturas moleculares presentes em um 
banco de dados. 
Nesta etapa, foi realizado o download das proteínas em banco de dados especifico 
(http://www.rcsb.org/pdb) e em formato PDB File text, conforme mostrado no QUADRO 3.1. 
Utilizando o programa CHIMERA observou-se o grupo heme ligado à estrutura proteica. Para 
melhor visualização ocultou-se as formas em hélice representadas pelo formato Ribbo, 
prosseguindo com as seguintes etapas: 
1. Selecionou-se o grupo heme; 
2. Inverteu-se a seleção; 
3. Ocultou-se as hélices da estrutura secundária; 
4. . Explorou-se a estrutura do grupo heme da hemoglobina localizando o íon ferro. 
 
 
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QUADRO 3.1: Download da estrutura das proteínas de interesse 
 
 
 
 
 
 
 
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3.2.Resultados 
Para a apresentação da primeira parte do experimento optou-se por montar a TABELA 3.1. 
TABELA 3.1: Resumo das características dos aminoácidos de interesse 
COMPOSTO CAS NUMBER
FÓRMULA 
MOLECULAR
DESCRIÇÃO pKa ESTRUTURA 3D
GLICINA 56-40-6 C2H5NO2
Aminoácido não essencial, encontrado 
em gelatinas. Muito conhecido por ser 
um inibidor de neurotransmissores.
pka1:2,37 
pKa2: 9,6
ALANINIA 56-41-7 C3H7NO2
Aminoácido não essencial abundante no 
plasma, está envolvido no metabolismo 
do açúcar, fornecendo energia aos 
tecidos. Além disso tem a função de 
melhorar o sistema imune.
pka1:2,4 
pKa2: 9,69
VALINA 72-18-4 C5H11NO2
Aminoácido essencial funcionando como 
estimulante. Promove o crescimento 
muscular e a reparação de tecidos.
pka: 2,3
LEUCINA 61-90-5 C6H13NO2
Aminoácido essencial e importante para 
formação da hemoglobina.
pka1:2,36 
pKa2: 9,63
ISOLEUCINA 73-32-5 C6H13NO2
Isomero da leucina importante na 
formação da hemoglobina, bem como na 
regulação da glicemia sanguinea.
pka1:2,36 
pKa2: 9,68
METIONINA 63-68-3 C5H11NO2S
Aminoácido essencial contendo enxofre 
e importante em diversas funções do 
organismo.
pka1:2,28 
pKa2: 9,21
PROLINA 344-25-2 C5H9NO2
Aminoácido não essencial presente no 
colágeno.
pka1:1,99 
pKa2: 10,6
 
Conforme verifica-se, valina, leucina, isoleucina e metionina são aminoácidos essências, 
enquanto que glicina, alanina e prolina não são. Além disso, o que se observa é que os 
aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina possuem seus valores de pka bem 
semelhantes. 
Note ainda que, com exceção da prolina, todos os demais aminoácidos possuem cadeia aberta, 
podendo ou não ser ramificada. 
A segunda parte do experimento, o qual usou os dados do Chimera, os resultados serão 
discutidos em dois tópicos: 
 
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Hemoglobina 
A hemoglobina é uma proteína globular, de estrutura quaternária, que contém 4 cadeias polipep-
tídicas (cadeias de globina) e um grupo heme ligado a cada uma das cadeias de globina. A função 
da hemoglobina é absorver e transportar oxigênio no sangue e liberá-lo no tecido. Isso ocorre gra-
ças à capacidade de seus átomos de ferro se ligarem com o oxigênio, reversivelmente. 
De maneira geral, considera-se como sendo formada por duas cadeias de globina do tipo alfa e 
duas cadeias de globina do tipo beta, sendo assim um tetrâmero de cadeias. Isso faz que haja 
diferentes combinações entre essas cadeias, determinando os 6 tipos de hemoglobinas produzidas 
na fase pré-embrionária e pós nascimento. A cada fase de desenvolvimento a síntese de 
hemoglobina vai se adaptando às mudanças sofridas pelo corpo. 
Segundo as imagens obtidas pelo programa CHIMERA foi possível visualizar a estrutura da 
Hemoglobina em diferentes graus de aprofundamento. De acordo com a FIGURA 3.1, é possível 
verificar as estruturas secundárias de α-Hélice, cujo formato em espiral contribui para o modelo 
compactado característico da Hemoglobina. 
Além dessas estruturas secundárias verificam-se também os quatro grupos Hemes, distribuídos 
um por cadeia peptídica, inferindo-se que a Hemoglobina possui quatro cadeias peptídicas-α1, α2, 
β1 e β2, ou seja, possui estrutura quaternária. 
 
FIGURA 3.1: Estrutura tridimensional da Hemoglobina 
 
Os grupos hemes da hemoglobina podem ser visualizados na FIGURA 3.2. Cada grupo é 
constituído por uma molécula de Porfina, cujo interior apresenta um átomo de Ferro (bolinha 
vermelha ao centro dos grupos), transportado até o grupo heme pela ferritina. 
Através de receptores específicos, o complexo ferro-transferrina liga-se a membrana da hemácia. 
A membrana então se invagina em alguns pontos, formando algumas vesículas com o ferro que 
penetrou e se desligou da transferrina, que por sua vez volta ao plasma sem o ferro para poder 
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transportar outro átomo de ferro. O oxigênio fica preso entre o Fe2+ e o anel imidazólico de 
Histidina distal, sendo responsável pela atração e retenção de O2 pela Hemoglobina 
 Cada grupo Heme é capaz de transportar uma molécula de oxigênio molecular (O2), assim cada 
proteína Hemoglobina transporta quatro moléculas de O2. Tal arranjo possibilita um transporte 
muito eficiente de oxigênio, o que justifica o fato de serem abundantemente encontrados nos 
Eritrócitos (células anucleadas do sangue, responsáveis pelo transporte de oxigênio dos pulmões 
aos tecidos nos organismos mais desenvolvidos). 
 
FIGURA 3.2: Grupo heme 
 
 
 
Conforme já mencionado, a estrutura α-Hélice, é a estrutura secundaria verificada na 
Hemoglobina. De acordo com FIGURA 3.3, tal estrutura é caracterizado pelo seu formato espiral, 
sendo que, examinado mais profundamente, é possível assinalar as pontes de hidrogênio (feitas 
entre os grupos aminos e carboxilas dos aminoácidos) que se encontram dispostas paralelamente 
em relação ao eixo da estrutura secundária α-Hélice. 
 
FIGURA 3.3: Pontos de hidrogênio em α-Hélice 
 
Cabe lembrar que defeitos ocasionados na sintese da hemoglobina são estremamente 
Grupos Heme Grupos Heme Ferro 
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prejudiciais ao organismo, acarretando doenças. As doençasda hemoglobina podem ser divididas 
em dois tipos de alteração: quantitativas e qualitativas. 
As alterações quantitativas (talassemias) são doenças em que há diminuição da sintese de 
hemoglobina, devido a maior produção de determinado tipo de globina. Já as alterações 
qualitativas ocorrem devido a mutações genicas pontuais, sendo responsavel pela produção de 
hemoglobinas anormais, por exemplo, Hb-S. As hemoglobinas S apresentam aminoacido valina ao 
invés de glutamina e, é responsavel por uma doença denominada drepanocitose, na qual as 
hemaceas adquirem forma de foice (anemia falsiforme) 
. 
Arginase L 
A arginase é uma metaloenzima contendo manganês e presente em mamíferos e protozoários, 
estando envolvida no ciclo da uréia. Ela catalisa a hidrolise da L-arginina em L-ornitina e ureia e 
compete com a oxido nítrico sintase (NOS II) pelo mesmo substrato. Além da síntese da ureia, 
essa proteína também tem propriedades de vasodilatação. 
Essa proteína apresenta-se sob duas isoformas: arginase1(hepática) e arginase 2 (presente em 
tecidos extra-hepáticos e mitocôndria). 
A Arginase L (FIGURA 3.4), responsável por catalisar o 15º e último passo do ciclo da uréia nos 
mamíferos, é formada por dois tipos de estruturas secundárias: a α-Hélice e a Folha β-Pregueada. 
 
FIGURA 3.4: Arginase L 
 
 
De maneira a melhor compreender as diferentes estruturas, detalhou-se a α-Hélice (FIGURA 
3.5) e a Folha β-Pregueada (FIGURA 3.6). Conforme já mencionado, a estrutura da α-Hélice é 
formada por pontes de hidrogênio formadas com grupo amina e carbonila. A estrutura helicoidal 
permite uma utilização mais eficiente de pontes de hidrogênio interna, o que faz com que essa 
conformação seja a mais abundante. 
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 Apesar disso, nem todos os polipeptideos podem formar α-Hélice estável, isso porque a 
cadeia lateral dos aminoácidos (grupo R) pode influenciar na estabilidade. De modo geral, se uma 
cadeia de polipeptídio apresentar muitos resíduos de lisina e/ou arginina, próximos uns dos outros, 
os grupos R, positivamente carregados, tenderão a se repelirem, impedindo a estabilidade da 
estrutura. 
FIGURA 3.5: α-Hélice em Arginase L 
 
 
FIGURA 3.6: Folha β-Pregueada em Arginase L 
 
Na Folha β-Pregueada as pontes de hidrogênio são estabelecidas entre átomos da mesma 
molécula (intracadeia) ou entre cadeias polipeptídicas diferentes (intercadeia). Neste caso, a 
estrutura formada lembra uma folha de papel dobrada em zigue-zague. Conforme FIGURA 3.7, as 
ligações de hidrogênio são perpendiculares ao eixo da estrutura Folha β-Pregueada e ocorre entre 
cadeias polipeptídicas diferentes, formando-se uma estrutura mais distendida que a α-Hélice. 
 
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13 
FIGURA 3.7: Pontes de hidrogênio em Folha β-Pregueada 
 
 
 
 
 
 
 
 
De maneira a melhor caracterizar as diferenças nos diversos tipos de estrutura da arginase, 
foram feitas as FIGURAS 3.8 e 3.9, as quais esquematizam a distância das pontes de hidrogênio 
formadas entre os aminoácidos nas cadeias de interesse. 
Note que, na α-Hélice da Arginase, a ligação de hidrogênio feita entre as unidades pepdíticas da 
estrutura dista 4.A, enquanto que na Folha β-Pregueada tal distância é de 90.A. 
 
FIGURA 3.8: Distância entre aminoácidos na α-Hélice da Arginase L 
 
 
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FIGURA 3.9: Distância entre aminoácidos na Folha β-Pregueada da Arginase L 
 
 
3.3. Conclusões 
Com base neste estudo e na manipulação da estrutura tridimensional de proteínas verificou-se 
que as interações entre peptídeos são fundamentais na exibição da forma final das proteínas, 
sendo que, pequenas alterações podem, não somente modificar a forma como também a função 
das proteínas. 
A distância entre os aminoácidos que fazem a ligação de hidrogênio delimita a estrutura 
secundária da proteína. Neste caso, percebeu-se pequenas distâncias entre as pontes de 
hidrogênio foram responsáveis pela formação de estrutura helicoidal (α-Hélice), enquanto que 
distâncias maiores configuram a estrutura da folha β-pregueada. 
 
 
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15 
4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM MEIO AQUOSO – MÉTODO DE 
BRADFORD 
O método de Bradford11 é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o 
corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250, sendo considerado um método de 
espectrofotometria. 
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas 
que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação 
entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio 
do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. 
O principal objetivo deste experimento foi estabelecer o teor de proteínas solúveis em meio 
aquoso a partir do preparado de amostra contendo fígado bovino cru. 
Uma vez que proteínas desempenham um papel extremamente importante em processos 
biológicos (atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, entre outros), a metodologia 
para a determinação de proteínas totais é de grande interesse para profissionais ligados tanto à 
área de indústria alimentícia/nutrição como em laboratórios de análises químicas. 
4.1. Materiais e métodos 
Para determinação de proteínas solúveis em meio aquoso através do Método de Bradford, foram 
utilizados os seguintes materiais: 
1. Balança; 
2. 2,5 g de fígado bovino; 
3. Solução Tampão TE (100mM Tris;EDTA 2 mM ph 7,4); 
4. Solução de Albumina (0,1mg/mL); 
5. Solução de Bradford; 
6. Homogeneizador (liquidificador); 
7. Uma (01) Pipeta; 
8. Provetas; 
9. Centrífuga; 
10. Cinco (05) tubos de ensaio; 
11. Cinco (05) microtubos do tipo “Eppendorf”; 
12. Espectrofotômetro Femto – Cirrus 80MB. 
O QUADRO 4.1 apresenta registro fotográfico dos materiais utilizados. 
 
 
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16 
 
QUADRO 4.1: Síntese de Materiais e Métodos – Método de Bradford 
 
 
 
 
 
 
Liquidificador e pipeta para 
processamento da amostra Centrifugação do preparado de fígado bovino 
Sobrenadante da amostra 
preparada 
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17 
 
 
A seguir são apresentados os métodos utilizados no desenvolvimento do experimento. 
4.1.1 Preparação da Curva Padrão 
No preparo da curva padrão de albumina, foi realizado uma diluição seriada. Neste caso, 
utilizou-se 04 microtubos (P1 a P4). Em P1 adicionou-se 400 µL de albumina a 0,1mg/mL. Nos 
demais microtuboulos foram adicionados 200 UL de solução tampão. Em todos os tubos adicionou-
se 1ml da solução de Bradford. O P1 foi adicionado ao P2, posteriormente ao P3 e P4, resultado 
na solução padrão desejada. Tal procedimento é esquematizado abaixo. 
 
 
Cabe lembrar que foram utilizadas ponteiras limpas para cada diluição de maneira a controlar a 
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18 
representatividade do experimento, evitando-se contaminação cruzada. 
4.1.2 Preparação do Branco 
O branco do experimento foi preparado utilizando-se 1mL da solução de Bradford a 100μl de 
água. 
4.1.3 Preparação da Amostra 
No preparo da amostraforam pesados 2,5g de fígado bovino, o qual foi transferido para uma 
proveta, onde adicionou-se 250 ml de solução tampão. A mistura foi transferida para o liquidificador, 
onde permaneceu até que seu conteúdo estivesse suficientemente homogêneo. Posteriormente, 
foram pipetadas 5ml de preparado que foram dispostos em tubos de ensaio e, acondicionados na 
centrifuga. O preparado permaneceu na centrifuga por 15 minutos a uma rotação de 4.000 rpm. 
Esse procedimento foi realizado pelos monitores do laboratório, que entregaram aos alunos 
apenas o prepara pronto. 
Para o experimento utilizou-se o sobrenadante da amostra preparada, a qual sofreu diluição 
seriada. Para diluição seriada utilizou-se 04 tubos de ensaio (A1 a A4). No tubo A1 adicionou-se 
2ml de sobrenadante da solução de fígado bovino e, nos demais tubos (A1 a A4) adicionou-se 1 ml 
de solução tampão em cada. Em todos os tubos foi adicionado 1ml da solução de Bradford. 
O conteúdo do A1 (1ml) foi transferido para o A2 e homogeneizado. A mistura de A2, foi 
adicionada a A3 e posteriormente em A4, resultado em uma solução 8 vezes mais diluída do que o 
preparo inicial. 
Cabe lembrar que não houve controle de temperatura ambiente durante o experimento. 
4.1.4 Quantificação 
Para quantificação das amostras utilizou-se um espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). O 
conteúdo dos tubos referente à curva padrão (P1 a P4), branco e amostras (A1 a A4) foram 
transferidos para cubetas próprias para posicionamento no espectrofotômetro, garantindo-se que o 
frasco não tivesse qualquer tipo de interferência (impressões digitais, sujeira, gotículas). Para este 
experimento utilizou-se o comprimento de onda padrão de 595 nm. 
A leitura no espectrofotômetro, iniciou-se com o branco, o qual apresentou leitura zero de 
absorbância. Tal procedimento foi repetido para todos os tubos (A1 a A4 e P1 a P4), sendo 
anotadas as suas leituras de absorbância. 
Os resultados da curva padrão de albumina (P1 a P4) foram plotados em planilha Excel para 
confecção da curva padrão, a partir da qual pode-se definir uma função e coeficiente linear da reta, 
dados essenciais para calcular a concentração de proteína da amostra. 
O cálculo da concentração de proteína (C) foi realizado utilizando-se a seguinte fórmula: 
 
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19 
 
C= Absorbância___ 
 Coeficiente linear 
4.2.Resultados 
A TABELA 4.1 apresenta a compilação dos dados obtidos para confecção da curva padrão de 
albumina. 
TABELA 4.1: Dados para curva padrão de albumina 
AMOSTRA CONCENTRAÇÃO (mg/mL) ABS
P1 0,1000 0,400
P2 0,0500 0,226
P3 0,0250 0,106
P4 0,0125 0,060
 
Note que a concentração de albumina variou de 0,1 mg/L (P1) a 0,0125 mg/l (P4), sendo que 
nestas faixas de concentração a absorbância variou de 0,4 a 0,06, respectivamente. A partir destes 
dados confeccionou-se o GRÁFICO 4.1, o qual apresenta a curva padrão do experimento. 
 
GRÁFICO 4.1: Curva Padrão da Albumina 
y = 4,1186x
R² = 0,991
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120
A
b
so
rb
ân
ci
a
Concentração de Albumina (mg/ml)
Curva de Calibração (albumina)
 
Conforme verifica-se, a curva padrão da albumina é uma reta crescente que estabelece uma 
função de primeiro grau (y=4,118x) com coeficiente linear igual a 0,991, tais dados serão usados a 
seguir para definição da porcentagem de proteína da amostra de fígado bovino. 
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20 
A TABELA 4.2 apresenta as leituras de absorbância das amostras de fígado bovino. 
 
TABELA 4.2: Absorbância das amostras de fígado bovino 
AMOSTRA ABS
A1 0,740
A2 0,608
A3 0,493
A4 0,304
 
Uma vez que ocorreu a diluição seriada da amostra bovina, considera-se que a amostra tenha 
sido diluída 8 vezes, sendo assim os dados de interesse (A4) deverão ser multiplicados por 8 para 
dar prosseguimento aos cálculos. A TABELA 4.3 apresenta o resumo dos cálculos realizados, note 
que, de acordo com os dados, 1g de bife de fígado bovino apresentam 5,9g de proteínas solúveis. 
 
TABELA 4.3: Resumo dos cálculos para determinar a quantidade de proteína na amostra 
X = quantidade de proteina bovina na amostra
y = 8 vezes a absorbância de A4
A4=0,304
Logo, em 1g de figado de boi esta presente 59 
mg de proteina.
como foram homogenizados 2,5 g de proteina 
em 250 ml, conclui-se que existe 147,5 mg de 
proteina no preparado.0,590X (mg/mL)= 
CALCULO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEINA NA AMOSTRA DE FIGADO BOVINO 
(2,5g)
y = 4,1186XEquação Padrão:
 
4.3. Conclusões 
De acordo com a TABELA Brasileira de Composição de Alimentos (TACO), em cada 100 g de 
bife de fígado bovino cru são esperadas aproximadamente 20,7 g de proteínas totais. Conforme 
cálculos realizados, neste experimento, em 100g de fígado bovino cru seriam encontrados 5,9g de 
proteínas solúveis em meio aquoso. Isso significa cada 100g de fígado bovino possui 28,5% de 
proteínas solúveis em meio aquoso e 71,5% de proteínas insolúveis. 
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21 
5. CATALISE E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA ARGINASE DE LEISHMANIA AMAZONENSIS 
Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catalise, reduzindo a 
velocidade ou paralisando reações enzimáticas. As enzimas catalisam praticamente todos os 
processos celulares, por isso os inibidores enzimáticos estão entre os mais importantes agentes 
farmacêuticos conhecidos. 
A arginase (L-arginina aminohidrolase) é uma metaloenzima que catalisa a hidrólise de L-arginina 
em L-ornitina e ureia (KREBS & HENSELEIT, 1932), estando presente em grandes quantidades no 
fígado de mamíferos e, em pequenas quantidades em animais uricotélicos (aves e répteis), plantas, 
protozoários e bactérias (HELLERMAN & PERKINS, 1935; HIRSCH-KOLB et al., 1971). 
 A arginase hepática é a enzima-chave do ciclo da uréia, uma via metabólica essencial para a 
remoção de amônia, uma base altamente tóxica resultante da degradação de proteínas 
(HERZFELD & RAPER, 1976). 
A quercetina (3,5,7,3’- 4’-pentahidroxi flavona), um flavonóide obtido por meio de dieta alimentar, 
atua inibindo a arginase, favorecendo maiores concentrações de L-arginina no organismo, as quais 
propiciam melhora nas funções associadas com a ativação dos macrofágos. 
Entre fatores que influenciam a atividade catalítica da arginase estão o pH e a natureza do metal 
bivalente de ativação. A curva de pH da enzima é uma função particular do metal ativador. 
Diferentes curvas de pH são obtidas com Mn2+ e Co2+ como ativadores (MOHAMED, 1950). 
Nos tecidos onde o ciclo da uréia é incompleto, a arginase regula a concentração de L-arginina e 
L-ornitina disponível para reações de biossíntese, entre elas a biossíntese de poliaminas, 
fundamentais para proliferação de células e tecidos. 
O objetivo deste experimento foi determinar a porcentagem de inibição da arginase, proveniente 
da Leishmania amazonenses, na presença de quercetina. A metodologia, resultados e conclusões 
são apresentados abaixo. 
5.1. Materiais e métodos 
Para realização deste experimento foram utilizados os seguintes materiais: 
1. Enzima Arginase recombinante de Leishmania amazonensis; 
2. Quercetina 100 µM; 
3. Arginina 500 mM (ph 9,5); 
4. Reagente R1 (Uréia Enzimática) 
5. Reagente R2 (Urease e Tampão Fosfato); 
6. Micropipeta; 
7. Equipamento para banho maria (marca Quimis); 
8. 5 (cinco) tubos de ensaio; 
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229. 3 (três) microtubos; 
10. Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). 
Os 3 microtubos de ensaio foram nomeados: CN (Controle Negativo), CP (Controle Positivo) e TI 
(Teste de Inibição), sendo posteriormente preparados de acordo com a TABELA 5.1. 
 
TABELA 5.1: Preparo da reação de inibição enzimática e controles 
Tubo Água (µL) L-arginina 500mM (µL) Quercetina (µL) Arginase (µL)
CN (controle Negativo) 410 100 0 0
CP (Controle Positivo) 400 100 0 10
TI (Teste de Inibição) 300 100 100 10
 
Todos os microtubos foram incubados em equipamento de banho maria por 15 minutos 
(temperatura de 37°C). 
Durante o tempo de incubação, foram pipetadas 1.000 µL do Reagente R1 em 05 tubos de 
ensaio (T1 a T5), sendo que nestes tubos foram preparadas amostras conforme apresentado na 
TABELA 5.2. 
 
TABELA 5.2: Análise do produto (uréia) formado pela hidrólise de L-arginina 
Tubo R1 (µL) Amostra
T1 10 µL do Tubo de CN
T2 10 µL do Tubo de CP
T3 10 µL do Tubo de TI
T4 10 µL de Uréia
T5 10 µL de de Uréria Padrão
1.000
 
Os preparos T1 a T5 foram incubados por 10 minutos (a 37ºC). Após incubação, adicionou-se 
1.000 µL de reagente R2 em todos os tubos, os quais foram novamente incubados por outros 10 
minutos. 
O preparo foi transferido para cubetas apropriadas para leitura utilizando-se o espectrofotômetro. 
O experimento deveria ter sido zerado com a amostra T1, entretanto, como a coloração de T1 não 
foi padrão, utilizou-se a amostra T4 para zerar o espectrofotômetro, sendo que posteriormente, 
prosseguiu-se com a leitura nos demais tubos (T2 a T5). 
O cálculo da concentração do inibidor e o percentual de inibição foi realizado com base na 
seguinte equação: 
 
 
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23 
Inibição (%): 100 – A (TI) * 100 
 A (CP) 
 
Onde A representa a absorbância. 
Cabe lembrar que devido aos procedimentos realizados, A (TI) refere-se a leitura da amostra T3, 
enquanto que a A (CP), equivale a absorbância da amostra T2. Além disso, salienta-se que em pH 
alcalino e na presença de Salicilato e Hipoclorito de Sódio, a Amônia origina um composto 
esverdeado, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de Uréia na amostra analisada. 
O QUADRO 5.1 apresenta as principais imagens relacionadas ao procedimento do experimento. 
QUADRO 5.1: Síntese de Materiais e Métodos – Inibição Enzimática 
 
Materiais básicos utilizados: micropipetas, reagente (R1 e R2) e 
microtubos
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24 
 
Materiais básicos utilizados: equipamento de banho-maria 
 
 
5.2.Resultados 
Abaixo são apresentadas síntese de linhas de raciocínio que serão utilizadas para compreensão 
dos resultados do experimento: 
 
Tal como pode ser verificado na TABELA 5.3, as leituras de absorbância variaram de 0 nm (T4) 
a 1,782 nm (T2), sendo que a amostra T4 pode ser interpretada como controle. 
(1) L-arginina → L-ornitina + Uréia (em presença de Arginase); 
(2) Uréia → Amônia + CO2 + Oh- (em presença de Urease); 
(3) Quercetina inibe Arginase. 
 
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25 
 
TABELA 5.3: Leituras de Absorbância das amostras de interesse 
Tubo CONTEUDO Absorbância (nm)
T1 R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + R2 (Urease) 0,435
T2
R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + Arginase + R2 
(Urease)
1,782
T3
R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + Quercitina + 
Arginase + R2 (Urease)
0,317
T4 R1 (Uréia = 70mg/dl) + R2 (Urease) 0,000
T5 Uréria Padrão + R1 (Uréia = 70mg/dl) + R2 (Urease) 0,643
 
Note que o conteúdo de T2 e T3 variaram apenas quanto a presença de quercetina, entretanto, 
a leitura de absorbância no tubo com quercetina (T3) foi inferior ao tubo sem o composto (T2). 
Uma vez que tanto a coloração como a absorbância dos preparos estavam diretamente 
relacionados à presença de amônia, os resultados demonstram que em presença de quercetina há 
menos produção de amônia, pois a quercetina inibe a arginase e, sem esta enzima, não ocorre a 
reação (1) e (2), consequentemente a disponibilidade de amônia (composto envolvido na coloração 
da reação) é afetada. 
Com base nestes resultados, e utilizando-se a equação já apresentada no subitem 5.1 
“Materiais e Métodos”, verificou-se que em presença de quercetina e nas condições descritas, a 
Arginase é inibida em aproximadamente 82,2%. 
5.3. Conclusões 
No experimento realizado, demonstrou-se que a presença de quercetina inibe a arginase, sendo 
assim, apesar de haver reagentes nos frascos, as transformações L-arginina → L-ornitina + Uréia e 
Uréia → Amônia + CO2 + Oh- são afetadas (inibidas). 
A produção de amônia verificada no tubo T3 e que forneceu 0,317 nm de absorbância, poderia 
estar relacionada a transformação da Ureia (Reagente 1) em Amônia pela ação da Urease pois a 
presença de quercetina não afeta a Urease. Outra possibilidade é que tal valor seja 
correspondente às reações catalisadas pelos quase 18% de arginase que não teriam sido inibidos 
pela quercetina. 
Uma vez que nas condições descritas, a quercetina foi capaz de inibir pouco mais de 82% de 
arginase, considera-se a quertcina um inibidor enzimático eficaz da arginase. 
 
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6. DETERMINAÇÃO DA GLICOSE – MÉTODO ENZIMÁTICO-COLORIMÉTRICO 
A glicose é um monossacarídeo amplamente encontrado na natureza, composto por 6 carbonos, 
podendo associar-se a determinadas moléculas, para formar outros compostos complexos 
(glicolipídídicos e glicoproteicos). 
Sua principal função é o fornecimento de energia para o corpo participando nas vias metabólicas 
(glicólise, ciclo de Krebs), sendo que em combinação com outras moléculas também assume 
funções estruturais (glicoproteínas de membrana). 
Neste experimento, a determinação da concentração de glicose foi realizada através do método 
enzimático-colorimétrico. Neste caso o peróxido de hidrogênio, em presença de Peroxidade (POD) 
reage com a 4-amoniantipirina e fenol, formando um cromógeno vermelho cereja cuja intensidade 
de cor é proporcional à concentração de glicose. Abaixo é apresentada a reação geral: 
 
 
 
Estudos clínicos comprovam que a quantidade de glicose circulante no sangue altera o 
metabolismo podendo levar a quadros de hipoglicemia, hiperglicemia, entre outros. Por esse 
motivo, o presente experimento teve como objetivo determinar a concentração de glicose visto sua 
importância principalmente para a avaliação de quadros clínicos. 
 
6.1. Materiais e métodos 
Para determinação da glicose através do método enzimático-colorimétrico foram utilizados os 
seguintes materiais: 
1. Micropipeta; 
2. Quatro tubos de ensaio; 
3. Água; 
4. Padrão de Glicose; 
5. Amostra 1 e 2; 
6. Reagente de Trabalho (fenol aminoantipirina) 
7. Equipamento para banho maria (marca Quimis); 
8. Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). 
As amostras 1 e 2 são preparos de glicose, cujas concentrações foram alvo deste experimento. 
Inicialmente foi obtido uma curva padrão de glicose, a qual foi compara com as Amostras 1 e 2. 
O experimento foi dividido em três procedimentos, conforme descrito abaixo: 
 
Glicose +O2+H2O → Ácido Glucônico + H2O2 → Fenol Aminoantipirina → composto 
colorido 
 
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Procedimento 1: Preparo da Curva Padrão 
Os tubos de ensaio foram nomeados (P1 a P4) para posterior realização da diluição seriadado 
Padrão de Glicose, conforme apresentado na TABELA 6.1. 
 
TABELA 6.1: Diluição seriada do Padrão de Glicose 
TUBO ÁGUA (μL) PADRÃO GLICOSE 100 mg/dl 
P1 - 40 μL
P2 20 20 μL de P1
P3 20 20 μL de P2
P4 20 20 μL de P3*
* Obs: depois de homogeneizado, foi 
descartadi 20 μL do tubo P4
 
Após diluição, foram adicionados 2mL de Reagente de Trabalho aos tubos (P1 a P4) os quais 
foram homogeneizados e incubados por 10 minutos a 37°C em equipamento de banho maria. 
 
Procedimento 2: Preparo da Reação para Determinação da Glicose 
Foram pipetadas 2mL de reagente de Trabalho aos tubos de Branco, Padrão, Amostra 1 e 2, 
conforme sintetizado na TABELA 6.2: 
 
TABELA 6.2: Diluição para determinação da glicose nas Amostras 1 e 2 
TUBO
REAGENTE DE 
TRABALHO 
(mL) 
PADRÃO 
GLICOSE 100 
mg/dl 
AMOSTRA 1 AMOSTRA 2
B (Branco) 2 - - -
P (Padrão) 2 20 μL - -
A1 (Amostra 1) 2 - 20 μL -
A2 (Amostra 2) 2 - - 20 μL 
 
Após o preparo, as amostras foram homogeneizadas e incubadas por 10 minutos a 37°C em 
equipamento de banho maria. 
 
Procedimento 3: Análise das Amostras e Curva Padrão 
A análise das amostras e da curva padrão foram realizadas com espectrofotômetro utilizando 
comprimento de onda de 505 nm. O aparelho foi zerado utilizando-se o Branco e, posteriormente 
foi realizada a medição da curva padrão e das amostras. 
O cálculo do fator de calibração foi realizado primeiramente com base na equação de 
Lambert-Beer: 
 
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28 
 
Glicose (mg/dl)= absorbância da amostra x 100 
 Absorbância do padrão 
 
Posteriormente, as leituras de absorbância foram planilhadas em Excell para montagem da 
curva padrão. Com base na curva, foi obtida a equação da reta, a partir da qual, também pode-se 
calcular as concentrações de glicose para comparação com os valores obtidos pelo método de 
Lambert-Beer. 
O QUADRO 6.1 apresenta os principais aspectos dos procedimentos realizados. 
QUADRO 6.1: Procedimentos – Determinação da Glicose 
 
Equipamento de banho-maria 
 
Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB) 
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29 
 
Padrão preparado (P1 a P4) 
 
Amostras preparadas 
 
6.2.Resultados 
Conforme se verificou na TABELA 6.3, os valores de absorbância (ABS) variaram entre 0,057 
nm (P4) a 0,403 nm (P1), sendo que a leitura de ABS da amostra de Branco confirmou que os 
resultados estão dentro do padrão de aceitabilidade, uma vez que apresentou valor nulo tal qual 
esperado. 
 
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TABELA 6.3: Leitura de Absorbância para curva padrão 
AMOSTRA ABSORBÂNCIA (nm) GLICOSE (mg/dl)
P1 0,403 100,00
P2 0,184 50,00
P3 0,056 25,00
P4 0,057 12,50
B (Branco) 0,000 0,00
P (Padrão) 0,377 100,00
 
Com base nestes dados, dados confeccionou-se o GRÁFICO 6.1, no qual verificou-se a 
configuração de uma reta linear crescente cuja equação traduz-se em y = 0,0039x, com coeficiente 
linear (R²) igual a 0,9741, denotando forte correlação entre os pontos da reta. 
 
GRÁFICO 6.1. Curva Padrão de Glicose 
y = 0,0039x
R² = 0,9741
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0 20 40 60 80 100 120
Ab
so
rb
ân
ci
a 
(nm
)
Glicose (mg/dl)
 
A equação da reta foi utilizada para calcular a concentração de Glicose nas amostras de 
interesse (A1 e A2), comparando-se os valores ao obtido pela Lei de Lambert-Beer. Os resultados 
estão resumidos na TABELA 6.4. 
 
TABELA 6.4: Concentração de glicose nas amostras de interesse 
Lei de Lambert-Beer Equação da Reta
A1 (Amostra 1) 0,206 54,64 52,82
A2 (Amostra 2) 1,247 330,77 319,74
AMOSTRA ABSORBÂNCIA (nm) GLICOSE (mg/dl)
 
 
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Note que, a amostra A2 apresenta concentração aproximadamente 6 vezes maior que a de A1. 
Além disso, verifica-se que apesar de terem sido obtidas com metodologias distintas, não 
houveram variações significativas nas concentrações de glicose calculadas. 
 
6.3.Conclusões 
 
O método enzimático-colorimétrico utilizado para a determinação da glicose mostrou-se eficiente 
uma vez, mesmo durante os procedimentos laboratoriais, pode-se estimar que colorações de 
vermelho mais intenso estariam relacionadas com maiores concentrações de glicose. Tais 
resultados foram comprovados com o cálculo da glicose. Neste caso, a amostra A2, com maiores 
concentrações de glicose também apresentou coloração de vermelho mais intenso. 
Em relação aos cálculos, conforme apresentado neste experimento, não houve variação 
significativa entre a Lei de Lambert-Beer e a equação da reta, uma vez a variação entre os 
métodos foi cerca de 3,33%. Nestas condições, apesar da metodologia de curva padrão e equação 
da reta demonstrar-se com maior precisão pois possuem mais pontos amostrais, a utilização da Lei 
de Lambert-Beer é, além de simples, perfeitamente aceitáveis no cotidiano. 
 
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7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
A disciplina de bioquímica faz parte da grade curricular de diversos cursos de graduação, estando 
inserida no ciclo de conteúdos básicos, sem a qual é difícil compreender fenômenos e processos 
patológicos e fisiológicos de forma plena. 
Neste contexto, as aulas práticas são extremamente enriquecedoras de conteúdo, pois além de 
familiarizam o aluno com as principais técnicas, aparatos laboratoriais e metodologias, possibilitam 
o aprimoramento do pensamento técnico-cientifico durante a elaboração dos relatórios. 
Com base nos cinco (05) experimentos realizados, o que mais chama atenção é que a partir da 
utilização do espectrofotômetro, bem como com a confecção de curvas padrões que forneçam uma 
equação de reta, é possível realizar o cálculo das concentrações das principais substâncias 
envolvidas nos processos bioquímicos do organismo. 
Além disso, ficou demonstrado que certos exames padrões, tais como a determinação da glicose 
ou de uréia, são relativamente simples de serem executados, dado a sua importância no 
diagnóstico de anomalias. 
 
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
BRADFORD, M. (1976), Analytical Biochemistry. 
DA SILVA, E. R. et al. Biochemical and biophysical properties of a highly active recombinant 
arginase from Leishmania (Leishmania) amazonensis and subcellular localization of native 
enzyme. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 159, n. 2, p. 104-111, JUN 2008. 
http://dx.doi.org/10.1016/j.molbiopara.2008.02.011 
DA SILVA, E. R.; MAQUIAVELI, C. D. C.; MAGALHAES, P. P. The leishmanicidal flavonols 
quercetin and quercitrin target Leishmania (Leishmania) amazonensis arginase. 
Experimental Parasitology, v. 130, n. 3, p. 183-188, MAR 2012. 
http://dx.doi.org/10.1016/j.exppara.2012.01.015 
HARRIS, D. C.(2005) Análise química quantitativa.6º ed. Rio de Janeiro: LTC. 
HELLERMANN, L. & PERKINS, M. E. Activation of enzymes II. The role of metal ions in 
activation of arginase. The hydrolysis of arginina induced by certain metal ions with urease. 
J. Biol. Chem., 112: 174-94, 1935. 
HERZFELD, A. & RAPER, S.M. The heterogeneity of arginases in rat tissues. Biochem. J., 
153(2): 469-478, 1976. 
HIRSCH-KOLB, H.; KOLB, H.J.; GREENBERG, D.M. Nuclear magnetic resonance studies of 
manganesebinding of rat liver arginase. J. Biol. Chem., 246 (2): 395-401, 1971 
KREBS, H. A. & HENSELEIT, K. Urea formation in the animal body. Z. Physiol. Chem. 210: 33-
66, 1932. 
LEHNINGER, D.A.; WEST, D.M; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R (2006) Fundamentos de Química 
Analítica. 4ª Ed. São Paulo: Savier. 
MOHAMED, M.S. Evidence for the presence of two enzymes with arginase activity. Acta Chem. 
Scand., 4: 990-992, 1950. 
SKOOG, D.A.; et al(2007). Fundamentos de química analítica. São Paulo: Thomson Laerning. 
UNICAMP (2011), TABELA brasileira de composição de alimentos- 4. ed. rev. e ampl.. 
Campinas: NEPA- UNICAMP, 2011 
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YIP, M.C. & KNOX, W.E. Function of arginase in lactating mammary gland. Biochem. J.,127(5): 
893-899, 1972.