Biotecnicas Reprodutivas de Bovinos

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Biotécnicas Reprodutivas 
CAIQUE MENEZES
NEDSON MACIEL
Junho 2014
 Segundo Bertolini e Bertolini (2009) os avanços biológicos e tecnológicos proporcionaram o desenvolvimento de quatro gerações de tecnologias de reprodução.
1º Geração: Inseminação artificial, criopreservação de gametas e embriões; 
2º Geração: superovulação e transferência de embriões; 
3º Geração: a sexagem espermática e embrionária, a recuperação de oócitos e a fertilização in vitro;
 4º Geração: envolve a Ciência Animal (clonagem entre outras)
 
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Importância das biotécnicas reprodutivas
Ferramenta importante para compreensão da fisiologia reprodutiva (feminina e masculina);
Multiplicação de animais geneticamente superiores;
Formação de bancos de germoplasma animal;
Reposição de espécies ameaçadas de extinção;
clonagem.
Para reaalização das técnicas reprodutivas os animais devem chegar a puberdade em otimas condições, o condicionamento destes animais segue o quadro acima, fatores que influencia na formação de indivíduos férteis e com características desejáveis. 
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Biotecnicas Reprodutivas
 
IA - Inseminação Artificial 
IATF - Inseminação Artificial em Tempo Fixo 
Clonagem
Sexagem de Semem 
TE - Transferência de Embriões
Fertilização in vitro: Produtividade multiplicada 
(IA) Inseminação Artificial 
A inseminação artificial ou monta natural podem gerar uma prenhez somente se os espermatozóides estão "no local correto e na hora correta". Os oócitos são liberados dos ovários de 10 a 14 horas depois do fim do cio e podem sobreviver não fertilizados por 6 a 12 horas. Todavia, os espermatozóides podem viver até 24 horas no trato reprodutivo da vaca. 
Uma recomendação comum de manejo do melhor período para a inseminação é conhecida com regra da "manhã-e-tarde": vacas observadas em cio de manhã são inseminadas na mesma tarde, e vacas em cio durante a tarde são inseminadas na manhã seguinte.
(IATF) Inseminação Artificial em Tempo Fixo
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 IATF elimina as falhas de observação de cio e encurta o anestro pós- parto, principais responsáveis pela baixa taxa de serviço e prenhez dos programas de inseminação artificial tradicionais.
 IATF - INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO
 Aumento de produtividade devido ao melhoramento genético do rebanho;
 Melhora o desempenho reprodutivo (eliminando falhas de obs.cio e induzindo ciclicidade em vacas em anestro reduzimos o intervalo entre partos do rebanho);
 Racionalização da mão de obra. 
 Diminuição do custo de aquisição e manutenção de touros. 
Pré-requisitos para implantar um protocolo de IATF: 
Vacas com mais de 40 dias pós-parto; 
Vacas com bom escore corporal;
 Controle sanitário eficiente (Controle brucelose/ leptospirose/ IBR/ BVD/ Campilobacteriose/ etc);
Veterinário capacitado para implantar o programa de IATF;
 Infra-estrutura adequada para inseminação (troncos/ currais/ mão de obra/ etc);
 Contar com inseminadores experientes; 
 Utilizar somente sêmen de touros com alta fertilidade. 
Dicas Importantes: 
 
 A quantidade de vacas por lote sincronizado nunca deve exceder a capacidade de inseminação da equipe no período de 6 horas. 
 Descongelar o sêmen conforme as instruções do fornecedor, deixar uma pessoa exclusivamente para descongelar e montar aplicadores, para ganhar agilidade. 
 As vacas que não emprenharem da primeira inseminação retornarão ao cio sincronizadas, cerca de 18 a 23 dias após, possibilitando nova inseminação com observação de cio ou simplesmente o repasse com touros. No caso de optar pelo repasse com touros, colocá-los na proporção de 1:15, uma vez que o cio de retorno pós IATF ocorre sincronizado
PGF- prostaglandina atuara em animais ( vacas) em estagio de corpo luteo, os animais restantes que nao entrar na sincronização apos a primeira aplicação de pgf, poderar receber uma segunda dose de 11 dias (apica-se a mesma dose anteriormente)
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Protocolo Ovsynch
1° protocolo de sincronização de ovulação para bovinos
GnRH (100ug) estimula a liberação de LH e a ovulação – 8-12 horas
IATF – 16-24h após a segunda dose
Protocolo Ovsynch Adaptado
Sincronização de ovulação
E2 estimula a liberação de GnRH, que estimula a liberação de LH e a ovulação
Protocolo com Progestágeno/Estrógeno/PGF2α
Sincronização de estro e ovulação
P4 por 7 a 10 dias
E2: aplicado no momento da inserção
PGF2α: 24h antes da retirada
P4: simula um CL funcional
Estro 48h depois da retirada
Superovulação (SOV) e Transferência de Embriões (TE)
Superovulação (SOV) e Transferência de Embriões (TE)
 Disseminar a genética de fêmeas de alta produção de forma mais rápida e prática. São produzidos embriões de uma fêmea doadora e transferidos a uma série de receptoras aptas a continuar a gestação. Os embriões podem ser produzidos in vitro (FIV) ou in vivo, através dos protocolos de superovulação de doadoras
 O crescimento dos folículos ovarianos nas fêmeas bovinas se dá em ondas, geralmente duas ou três por ciclo. Cada onda pode ser dividida em 3 fases: 
Recrutamento: 
Quando vários folículos primários passam a se desenvolver concomitantemente. Esta fase é dependente do FSH (Hormônio Folículo Estimulante). 
 
Seleção, divergência e dominância: 
Fase na qual um folículo cresce mais que os outros, tornando-se dominante e inibindo o crescimento dos demais (subordinados). Nesta fase, o crescimento do folículo dominante torna-se dependente também de pulsos basais de LH (Hormônio Luteinizante).
Ovulação ou atresia:
 
 O folículo dominante produz altos níveis de 17β-estradiol, que na ausência de progesterona, induz a liberação de um pico de GnRH, que por sua vez, induz um pico de LH e, conseqüentemente, ovulação. No entanto, se houver um corpo lúteo ativo, os níveis de progesterona estarão altos (fase luteal) inibindo a liberação de LH (feedback negativo). Então, o folículo dominante entra em atresia, e uma nova onda de crescimento folicular se inicia, alguns dias após. 
 
A última onda folicular de cada ciclo culmina com a regressão do corpo lúteo (induzida pela prostaglandina F2α liberada no útero). Com a diminuição dos níveis de progesterona, cessa-se a inibição sobre o LH e um pico pré-ovulatório é liberado, induzindo o crescimento final do folículo, sua ovulação e posterior luteinização, formando o novo corpo lúteo. 
Fig.1 -.Fases do crescimento folicular: 
recrutamento (dependente de FSH); 
Seleção e dominância (dependente de LH);
Ovulação ou atresia (na dependência da presença o não do pico pré-ovulatório de LH) 
Fig.2 - Esquema de ciclo estral com 2 ondas foliculares. A primeira onda culmina com a atresia do dominante por falta do pico pré-ovulatório de LH (fase luteínica). A segunda onda culmina com a ovulação (fase folicular, baixa progesterona e pico pré-ovulatório de LH).
Fig.3 - Esquema de ciclo estral com 3 ondas foliculares. A primeira e a segunda onda culminam com a atresia dos dominantes por falta do pico pré-ovulatório de LH (fase luteínica). A terceira onda culmina com a ovulação (fase folicular, baixa progesterona e pico pré-ovulatório de LH). 
Para se conseguir a ação estimulante sobre todos os folículos em crescimento, com produção de oócitos viáveis, o FSH deve ser administrado antes do momento da divergência da onda folicular;
Caso contrário, os folículos que estiverem em processo de atresia nesse momento, irão produzir oócitos de baixa qualidade que, por sua vez, terão baixa taxa de fertilização e/ou produzirão embriões de baixa qualidade ou mesmo degenerados;
O excesso de estímulo devido a altas doses de FSH também produz diminuição da qualidade dos oócitos. 
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Clonagem
A clonagem tem contribuído para estudos científicos básicos, preservação de raças e espécies em vias de extinção, melhoramento animal e, sem dúvida, dará suporte 
a produção de animais transgênicos (Rumpf, Dode e Silva, 2002).
A clonagem em mamíferos teve início com os trabalhos de Wilmut et al (1997) a partir da ovelha Dolly. Posteriomente muito trabalhos foram publicados e atualmente sabe-se que a eficiência da clonagem fica em torno de 7% para as fêmeas e 12% para os machos tendo em vista que há uma maior mortalidade neonatal entre as fêmeas, do que entre os machos (Bertolini e Anderson, 2002; Meirelles et al, 2008; Panarace et al, 2007). 
 Clonagem por transferência nuclear de células embrionárias ou somáticas, a transgenia e a biologia de células-tronco. Sob esta classificação apresenta-se a seguir algumas generalidades sobre a biotecnologia aplicada à reprodução. 
Vantagens
 A clonagem é um processo rápido que envolve poucos custos.
Desvantagens
Produz um elevado número de organismos geneticamente idênticos;
Reduz a variabilidade genética das espécies. 
Reduz o numero de alelos do fundo genético, diminuindo a probabilidade de serem produzidas novas variedades, quer naturalmente quer artificialmente.
Transferência de Embriões em Tempo Fixo (TE)
 As receptoras de embriões necessitam de cuidados tão rigorosos quanto os dispensados às doadoras (sanidade, nutrição, manejo, mineralização e fertilidade), influem de forma significativa sobre os resultados da técnica. 
 
 
Sincronização de receptoras
 
A sincronização do ciclo estral entre doadoras e receptoras é fundamental para que as taxas de prenhez sejam as mais elevadas possíveis. 
A condição uterina e perfil hormonal devem ser o mais semelhante possível em relação à doadora, sob o risco de morte embrionária precoce. Com essa preocupação em mente, vários estudos foram realizados e alguns protocolos desenvolvidos. 
Sexagem de Semem 
 Separação dos espermatozóides contendo o cromossomo X daqueles contendo o cromossomo Y. É possível através da detecção de pelo menos uma diferença fenotípica entre essas células, podendo ser: antígenos de superfície e conteúdo de DNA (Mota, 2004). 
 Nos bovinos, o espermatozóide X contém, aproximadamente, 4% mais DNA que o espermatozóide Y, sendo possível medir o conteúdo de DNA de cada um dos espermatozóides com precisão suficiente para distinção entre espermatozóides X e Y (Seidel, 2007). 
Com base nesta diferença, existem duas técnicas que podem ser utilizadas para a seleção do sexo dos espermatozóides: a centrifugação em gradiente de densidade e a citometria de fluxo (Lima, 2006).
• Centrifugação em gradiente de densidade: baseia-se na diferença de densidade existente entre os cromossomos X e Y (Lima, 2006)
Análise da cabeça dos espermatozóides por meio da técnica de microinterferometria, foi verificado que o cromossomo X contém mais conteúdo de DNA e proteína nuclear que os espermatozóides Y, assim, causando diferença de peso e, consequentemente, na densidade entre os dois tipos celulares (Sumner & Robinson, 1976). 
Com base nesta diferença, existem duas técnicas que podem ser utilizadas para a seleção do sexo dos espermatozóides: a centrifugação em gradiente de densidade e a citometria de fluxo (Lima, 2006).
Baseia-se no fluxo de fluidos que é quebrado em poucas gotas por um cristal vibrador, formando cerca de 70.000 a 80.000 gotas por segundo. 
Cerca de um terço das gotículas contêm um espermatozóide e cerca de dois terços são vazias. 
A gotícula que contém o espermatozóide com o cromossomo X analisado pelo computador, recebe uma carga elétrica positiva, a gotícula que contém o espermatozóide com o cromossomo Y, recebe uma carga negativa e se a gota não contém nenhum espermatozóide, espermatozóides danificados, ou espermatozóides indistinguíveis em relação ao conteúdo de DNA, nenhuma carga é acrescentada (Seidel, 2007).
Citômetro de fluxo
Vantagens 
Maximizar a produção animal.:
 Possibilita produzir em escala comercial,doses de sêmen enriquecido com espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y;
Aumentará os benefícios da utilização da inseminação artificia, conferindo-lhe um papel decisivo na maximização do progresso genético; 
Desvantagens 
Promove danos às células, deixando-as mais sensíveis ao processo de criopreservação (Hollinshead et al., 2003). 
Danos ao sêmen, devido ao estresse químico e físico aos quais os espermatozóides são expostos durante a sexagem (Seidel, 2003);
Menores taxas de desenvolvimento embrionário comparados aos não-sexados (Sartori et al., 2004).
 Os princípios básicos da criopreservação do sêmen é a suspensão do metabolismo e a manutenção das características espermáticas por um período prolongado de tempo. 
Diluição
Resfriamento
Congelação, 
Armazenamento 
Descongelação. 
 A preservação das estruturas espermáticas após a congelação é obtida pela interação entre o diluidor, crioprotetor, curvas de resfriamento e congelação e descongelação (Amann & Pickett, 1987). 
Criopreservação do Sêmen 
Fertilização in vitro: Produtividade multiplicada 
Com a fertilização in vitro, os ovócitos doados por uma fêmea podem gerar até 50 bezerros por ano.
O ultrassom mostra a localização exata dos ovários da vaca, de onde são aspirados folículos que guardam os óvulos imaturos, chamados ovócitos.
Essas células serão transportadas em recipientes apropriados para um laboratório especializado, onde o especialista as submeterá a um processo denominado maturação, que leva em torno de 24 horas.
Passado esse tempo, as que estiverem amadurecidas serão liberadas e, em seguida, fertilizadas pelo sêmen de um reprodutor – como a fêmea doadora dos óvulos, o macho é de alto valor zootécnico.
O próximo passo será cultivá-las durante sete dias, num ambiente em que a temperatura e a umidade, entre outras condições, são rigorosamente controladas.
Os embriões obtidos nesse processo serão então classificados de acordo com padrões da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) e aqueles aptos a produzirem uma prenhez serão transferidos para as receptoras ou, em alguns casos, congelados. 
Obrigado!