27-Síntese de proteínas 2014

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Síntese de Proteínas
Novembro
2014
Universidade Federal do Ceará
Centro de Ciências
Introdução a Bioquímica
Síntese de proteínas
Síntese de proteínas
Proteínas ribossomais - > 70
Enzimas ativadoras de aminoácidos - >20
Etapas de iniciação, alongamento e término - >12
Processamento das proteínas - >100
RNAt e ribossomais - > 40
Mais de 300 macromoléculas diferentes!!!
Síntese de proteínas
Pode chegar a consumir 90% do total de energia da célula
Acontece com grande rapidez – 1 proteína de 100 resíduos de aminoácidos em 5 segundos.
Processo de síntese é finamente regulado
Onde ocorre a síntese de proteínas?
Paul Zamecnik, 1950
Aminoácidos radioativos
Aminoácidos radioativos foram injetados em ratos e o fígado foi coletado. Foi observado que após alguns dias havia a presença de proteínas em toda a célula. Mas em questões de minutos só havia aminoácidos em partículas de ribonucleoproteínas que passaram a se chamar ribossomos. 
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Molécula adaptadora - RNAt
Como 4 bases nucleotídicas poderiam gerar 20 tipos de aminoácidos diferentes?
Década de 60
42 = 16
43 = 64
Não havia interação direta entre as bases nitrogenadas do RNAm e os aminoácidos
Crick em 1955 propôs que o adaptador seria uma molécula de RNA já que era preciso haver uma complementaridade de bases com o RNAm.
Estudos posteriores mostraram que antes de serem incorporados nas proteínas, os aminoácidos ligam-se a uma classe de RNA chamados de RNAt
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Considerações gerais
Códon é um triplete de nucleotídeos que codifica um aminoácido
A tradução acontece de forma continua sendo os códons lidos sucessivamente e sem sobreposição.
A sequencia de aminoácidos de uma proteína é definida por uma sequencia de tripletes contíguos chamada de fase aberta de leitura ou quadro de leitura aberta (ORF- Open-Reading Frame);
Cada ORF define uma proteína.
Síntese de proteínas
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Código genético
Experimentos de Nirenberg e Matthaei (1961)
UUUUUUUUUUUUUUU
+
Extrato de E. coli
+
GTP + ATP
+
1 aminoácido radioativo (Ex: fenilalanina)
20 tubos diferentes (cada tubo 1 tipo de AA marcado radioativamente)
Peptídeo de fenilalanina radioativa
Código genético
Experimentos de Nirenberg e Matthaei (1961)
UUUUUUUUUUUUUUU
+
Extrato de E. coli
+
GTP + ATP
+
1 aminoácido radioativo (Ex: fenilalanina)
20 tubos diferentes (cada tubo 1 tipo de AA marcado radioativamente)
Peptídeo de fenilalanina radioativa
Códon UUU codifica fenilalanina
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Código genético
61 dos 64 códons possíveis codificam aminoácidos
3 códons de terminação – UAA, UAG, UGA (não codificam aminoácidos)
Códon de iniciação – AUG (tbe codifica metionina)
Código genético
DEGENERADO - Um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon mas, cada códon codifica apenas um aminoácido.
UNIVERSAL – Com exceção de mitocôndrias, algumas bactérias e eucariotos unicelulares, os códons são idênticos em todas as espécies estudadas até agora.
Componentes da tradução
RNAm
Ribossomos
RNAt
Aminoacil-RNAt sintetases
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Ribossomos
E. coli – mais de 15000 ribossomos
65% de RNAr e 35% de proteína
E. coli - Possuem duas subunidades: 30S e 50S (coeficiente de sedimentação 70S)
50S – RNAr 5S e 23S formam o cerne estrutural
30S – RNAr 16S
Eucariotos - Possuem duas subunidades: 40S e 60S (coeficiente de sedimentação 80S)
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Ribossomos de procariotos e eucariotos
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Ribossomos de E. coli
65% de RNAr e 35% de proteína
Coeficiente de sedimentação 70S
Subunidade maior – centro da peptidil transferase
Subunidade menor – Centro de decodificação
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RNAt
Fita única de RNA dobrada em estrutura tridimensional em folha de trevo com 4 braços
Resíduo guanilato na extremidade 5´e CCA na 3´
Pequeno tamanho
Pelo menos 1 tipo de RNAt para cada aminoácido
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Braço do aminoácido – Grupo carboxil do aa ligado à extremidade 3´do RNAt (2´ou 3´- hidroxila do resíduo A)
Braço do anticódon
Braço D
Braço TC
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Braço do aminoácido – Grupo carboxil do aa ligado à extremidade 3´do RNAt (2´ou 3´- hidroxila do resíduo A)
Braço do anticódon
Braço D
Braço TC
Funções dos braços D e TC: Formação de interações importantes para o dobramento do RNAt e interação com a subunidade maior do ribossomo.
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RNAt
RNAt pareiam com códons do RNAm em uma sequencia de três bases de RNAt denominada anticódon.
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RNAt
A terceira base da maioria dos códons pareia de maneira mais frouxa com a base correspondente do anticódon.
Anticódons de alguns RNAt possuem o nucleotídeo inosinato (I) que forma pontes de H com U, C e A.
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Hipótese da oscilação (Crick)
As 2 primeiras bases de um códon estabelecem pareamentos fortes de bases do tipo Watson-Crick
A base oscilante permite que a síntese proteica aconteça numa velocidade maior.
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Estágios da síntese proteica
1 – Ativação de aminoácidos
2 – Iniciação
3 – Alongamento
4 – Terminação e Reciclagem do ribossomo
5 – Dobramento e processamento pós-traducional
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1 – Ativação dos aminoácidos
Ocorre no citosol
Processo de ativação do grupo carboxil dos aminoácidos para haver a ligação peptídica
Cada um dos 20 aminoácidos é covalentemente ligado a um RNAt específico às custas de ATP - Reações catalisadas pelas Aminoacil-RNAt-sintetases
A maioria dos organismos possui uma aminoacil-RNAt-sintetase para cada aminoácido.
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Ligação do aminoácido ao RNAt
Aminoacil-RNAt-sintetases
Aminoácido + RNAt + ATP  Aminoacil-RNAt + AMP + 2Pi
Aminoacil-RNAt sintetase
Pirofosfatase
Mg2+
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1 – Ativação dos aminoácidos
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1 – Ativação dos aminoácidos
Funções das aminoacil-RNAt-sintetases
Ativar os aminoácidos para a formação da ligação peptídica;
Posicionar corretamente o aminoácido no polipeptídeo crescente – Função de edição
Ile-RNAt-sintetases
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1 – Ativação dos aminoácidos
As aminoacil-RNAt-sintetases devem ser específicas para cada aminoácido e também para um determinado RNAt
Como saber qual o RNAt correto?
Reconhecimento: Sequencias existentes no braço do aminoácido e no braço do anticodon
As sequencias de reconhecimento podem envolver 10 ou mais nucleotídeos ou um único par de bases
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1 – Ativação dos aminoácidos
Reconhecimento do RNAtAla
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1 – Ativação dos aminoácidos
Estrutura geral do aminoacil-RNAt
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2 – Iniciação
A síntese inicia na extremidade aminoterminal e procede em direção à extremidade carboxiterminal.
Códon de iniciação: AUG (codifica para uma metionina)
Existem dois RNAt para metionina: RNAtfMet - Quando se quer introduzir fMet no inicio da proteína e RNAtMet -quando se quer introduzir Met no meio da proteína.
Bactérias (fMet)
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2 – Iniciação
Bactérias (fMet)
Metionina + tRNAfMet + ATP  Met-tRNAfMet + AMP + PPi
N10-Formiltetraidrofolato + Met-tRNAfMet  tetraidrofolato + fMet-tRNAfMet 
Metionina-tRNA sintetase
Transformilase
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2 – Iniciação (Bactérias)
Para a iniciação em bactérias é necessário:
Subunidade 30S do ribossomo;
RNAm que codifica a proteína (peptídeo) a ser produzida(o);
fMet-RNAtfMet iniciador;
Fatores de iniciação (IF-1, IF-2, IF-3);
GTP;
Subunidade 50S do ribossomo;
Mg2+
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2 – Iniciação (Bactérias)
Etapa 1 
1.1 Ligação da subunidade 30S aos fatores de iniciação IF-1 e IF-3;
1.2– Ligação do RNAm à subunidade 30S;
1.3 – O códon de iniciação AUG é posicionado pela sequencia de Shine-Dalgarno presente no mRNA (sequencia consenso rica em purina localizada no lado 5´do códon de iniciação) ;
1.4 – Interação da sequencia de Shine-Dalgarno com uma sequencia de pirimidina próximo a extremidade 3´do RNAr 16S (posicionamento do códon de iniciação)
OBS: O 5´AUG específico p/ fMet-RNAtfMet é reconhecido por estar próximo à sequencia de SD
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2 – Iniciação (Bactérias)
Etapa 2 
2.1 - Ligação do IF-2-GTP ao fMet-RNAtfMet e ligação ao codon AUG no RNAm
Etapa 3
3.1 – Ligação do complexo à subunidade 50S do ribossomo com
consequente formação de GDP + Pi e liberação dos fatores de iniciação.
Complexo de Iniciação
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2 – Iniciação (Eucariotos)
1 – Ligação do RNAm ao ribossomo através de proteínas ligantes específicas 
	Ligação das extremidades 5´e 3´do RNAm 
2 – Reconhecimento do códon AUG pelo rastreamento envolvendo o eIF4F e não pela sequencia Shine-Dalgarno.
	
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3 – Alongamento (Bactérias)
Para o alongamento em bactérias é necessário:
Complexo de iniciação;
Aminoacil-RNAt;
Fatores de iniciação (EF-Tu, EF-Ts, EF-G);
GTP;
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3 – Alongamento (Bactérias)
Etapa 1 – Ligação de um aminoacil-RNAt
1.1 - O aminoacil-RNAt se liga ao complexo EF-Tu-GTP
1.2 – O complexo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP liga-se ao sítio A do complexo de iniciação;
1.3 – Liberação complexo EF-Tu-GDP do ribossomo 70S
1.4 – Regeneração do complexo EF-Tu-GTP envolvendo EF-Ts e GTP
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3 – Alongamento (Bactérias)
Etapa 2 – Formação da Ligação Peptídica:
2.1 – Formação de uma ligação peptídica entre os dois aminoácidos ligados ao RNAt (sítios P e A) pelo RNAr 23S (peptidil-transferase);
2.2 – Produção do dipeptidil-RNAt no sítio A;
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3 – Alongamento (Bactérias)
Etapa 3 - Translocação:
3.1 – O ribossomo se desloca em direção à extremidade 3´do RNAm utilizando a energia de um GTP ligado ao EF-G;
3.2 – Translocação do dipeptidil para o sítio P e do RNAtfMet para o sítio E;
3.3 – Entrada do terceiro aminoacil-RNAt;
3.4 – Dissociação do RNAt não carregado do sítio E 
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3 – Alongamento (Eucariotos)
Mecanismos semelhantes aos de procariotos;
Fatores de alongamento: eEF1, eEF1β e eEF2
Ribossomos não possuem sítio E
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4 – Terminação (Bactérias)
Sinalizada pela presença de códons de terminação (UAA, UAG, UGA);
Após o códon de terminação tenha ocupado o sítio A, três fatores de terminação (RF-1, RF-2 e RF-3) causam:
Hidrólise da ligação peptidil-RNAt terminal
Liberação da proteína (peptídeo) e do último RNAt do sítio P;
Dissociação do ribossomo 70S em suas subunidades 30S e 50S
RF1= UAG, UAA
RF2= UGA, UAA
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Polissomo
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Transcrição acoplada a tradução em bactérias
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5 – Dobramento e Processamento Pós-Traducional
Modificações aminoterminais e carboxiterminais
Ex: retirada da formilmetionina (bactérias) ou metionina (eucariotos)
Perda de sequencias sinalizadoras (envolvidas no endereçamento das proteínas)
Modificação de alguns aminoácidos (fosforilações, carboxilações, metilação, etc)
Glicosilação
Formação de pontes dissulfeto
Adição de grupos prostéticos
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Inibição da Síntese Proteica
Antibióticos e toxinas naturais
Puromicina (Fungo S. alboniger)
Bloqueio do sítio A de bactérias
Inibe a peptidil-transferase de bactérias
Ricina – Inativa a subunidade 60S dos ribossomos de eucariotos
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Endereçamento de Proteínas
Proteínas que serão secretadas, integradas à membrana plasmática ou inclusas nos lisossomos, são direcionadas, através de sequencias sinalizadoras presentes na extremidade amino-terminal, para o RE.
Sequencias sinalizadoras:
10 a 15 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos;
1 ou mais resíduos carregados positivamente precedendo os aminoácidos hidrofóbicos;
Na extremidade carboxiterminal, próximo ao sítio de clivagem, há aminoácidos com cadeias laterais curtas.
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Endereçamento de Proteínas
Partícula de reconhecimento de sinal
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Glicosilações
Resíduos de asparagina – N-glicosilações
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