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Extração de DNA; Replicação “In vitro” do DNA e Marcadores moleculares Profa. Marilene marilene.ufrrj@gmail.com Instituto de Biologia Departamento de Genética Disciplina Genética Molecular Introdução • Mapeamento • Sequenciamento • Extração do DNA é o primeiro passo para utilizá-lo em técnicas de genética molecular • Diversos protocolos – tecido e espécie De modo geral: • Um tampão para estabilizar o pH • Sal para dissociar as proteínas • Detergente para solubilizar as membranas • Agente para inativar proteínas que degradam o DNA Extração de DNA • Protocolo Doyle e Doyle (1987) • Uma boa extração depende principalmente: – Adequação do tecido – Estado do material – Manuseio dos utensílios Extração de DNA Lembretes! • Conhecer os reagentes • Estar protegido • Nunca beber, comer, fumar, aplicar cosméticos, lentes de contato • Nunca cheirar reagentes • Nunca pipetar com aboca • Lavar as mãos antes de iniciar o trabalho • Bancadas limpas e organizadas • Identificar todo o material utilizado • O lixo deve ser perfeitamente identificado • Lise celular • Libertação de todo material intracelular • Precipitação de proteínas e detritos celulares • Purificação do DNA Extração de DNA Cinco etapas básicas: 1. Maceração mecânica – Romper as paredes e membranas celulares do tecido Extração de DNA 2. Ressuspender o material vegetal com o tampão de extração – CTAB – detergente antioxidante – EDTA – tamponante • Solubilização das membranas e desnaturação de proteínas Extração de DNA • Incubar 60-65°C – 15 a 60 minutos Extração de DNA 3. Extração com um solvente orgânico – Clorofórmio: álcool isoamílico – Precipitação dos polissacarídeos Extração de DNA Suspensão Solução Sobrenadante Precipitado • Duas fases • Aquosa – DNA, RNA e alguns polissacarídeos • Orgânica – Lipídeos, polissacarídeos, proteínas Extração de DNA 4. adicionar álcool (isopropanol ou etanol) – Presença de álcool forma um precipitado Extração de DNA Extração de DNA Extração de DNA Material vegetal Macerar o material o almofariz Adicionar o tampão CTAB e incubar a 65°C Transferir o pó para o tubo Adicionar clorofórmio: álcool isoamílico Fase aquosa Fase orgânica Agitar Centrifugar Transferir a fase superior para novo tubo Repetir o procedimento de 2 a 3 vezes Adicionar isopropanol CentrifugarDescartar sobrenadante e dissolver DNA DNA Extração de DNA Extração de DNA caseira Eletroforese • Movimentação das moléculas através de uma matriz tamponada – Gel de acrilamida, agarose – Funciona como um filtro • Separação por tamanho da moléculas – DNA – grupo fosfato tem carga negativa Eletroforese Eletroforese Quantificação • Leituras em espectofotômetro e análise comparativa em geís de agarose com brometo de etídio Marcador molecular de DNA - RFLP • RFLP – Restriction fragment lenght polymorphism • Polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição • O uso de sondas de DNA e o uso de enzimas de restrição. Enzimas de restrição – consideradas “tesouras moleculares”, clivam o DNA em locais específicos – sítios de restrição Corte com Eco RI Corte com Eco RI Fragmentos com Extremidades coesivas vazio vazio Anelamento permite que moléculas de DNA recombinante realizem um pareamento complementar. As duas fitas não estão ligadas covalentemente como pode ser visto nas áreas circuladas (vazio) Etapas RFLP - sumarizadas DNA Extraído - clivado – separados por eletroforese em gel de agarose – desnaturados em fitas simples – transferidos para uma membrana de nailon (Southern blot) – os fragmentos são fixados por meio de luz UV – Hibridização com sonda marcada – autoradiografia 1.Amostras de DNA cortadas com enzimas de restrição são carregadas em gel de agarose para eletroforese Linha 1: Padrão de Tamanho Marcado Linha 2: DNA cortado com enzima A Linha 3: DNA cortado com enzima B Eletroforese DNA é desnaturado, gel é colocado sobre material esponjoso 2. DNA é separado por Eletroforese e visualizado por corante, fotorradiografia ou luz UV Peso Toalhas de Papel Membrana de Nilon Gel Esponja Tampão 3.A membrana, toalhas de papel e peso São colocados sobre o gel. O Tampão sobe por capilaridade transferindo os fragmentos de DNA para a membrana 4. A membrana com o DNA é colocada em uma embalagem plástica selada, com uma solução contendo a sonda marcada radioativamente Cobrir o filtro com Filme de Raio X Autorradiograma 5. Membrana é lavada para remover excesso de sonda, secada, e colocado em contato com filme para fazer autorradiografia RFLP • O polimorfismo ocorre devido: • A criação ou eliminação de sítios de restrição • Mutação • Rearranjo dos segmentos de DNA – deleções, inserções. Reação em cadeia da polimerase - PCR (Polymerase Chain Reaction) • Kery Muris, 1980 • Síntese de DNA in vitro – Em escala exponencial Reagentes utilizados na PCR Reagentes utilizados na PCR • DNA-molde ou DNA-alvo – o DNA que se deseja multiplicar; • dNTPs (desoxirribonucleotídeos) – que irão formar as novas fitas: – Adenina, Timina, Guanina e Citosina Reagentes utilizados na PCR • Oligonucleotideos iniciadores (primers) – que norteiam a região do DNA a ser amplificada; • Taq DNA-polimerase – enzima que polimeriza o DNA; e • Co-fatores e fatores tamponantes – que garantirão a atividade da enzima – ph ótimo. 1 - Desnaturação 94 – 96°C 2 - Anelamento ~68ºC 3 - Extensão 72ºC PCR Baseia-se em ciclos repetidos de replicação in vitro da molécula de DNA. DNA molde Amplificação exponencial RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Microssatélites – SSR (Simple Sequence Repeats) • Sequências Simples Repetidas, a qual • consiste de pequenas sequências de nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem. • Essas sequências são distribuídas ao acaso no genoma e constituem a classe de marcador mais polimórfica hoje disponível - rotina • Primers específicos (20 a 30 pb). • Diferentes números de elementos simples repetidos. • Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco • Co-dominantes • Requer biblioteca de fragmentos genômico para o organismo de interesse
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