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Extração de DNA, PCR e marcadores moleculares

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Extração de DNA;
Replicação “In vitro” do DNA e Marcadores 
moleculares
Profa. Marilene 
marilene.ufrrj@gmail.com
Instituto de Biologia
Departamento de Genética
Disciplina Genética Molecular
Introdução
• Mapeamento
• Sequenciamento
• Extração do DNA é o primeiro passo para 
utilizá-lo em técnicas de genética molecular
• Diversos protocolos – tecido e espécie
De modo geral:
• Um tampão para estabilizar o pH
• Sal para dissociar as proteínas
• Detergente para solubilizar as membranas
• Agente para inativar proteínas que degradam 
o DNA
Extração de DNA
• Protocolo Doyle e Doyle (1987)
• Uma boa extração depende principalmente:
– Adequação do tecido
– Estado do material
– Manuseio dos utensílios
Extração de DNA
Lembretes!
• Conhecer os reagentes
• Estar protegido
• Nunca beber, comer, fumar, aplicar cosméticos, 
lentes de contato
• Nunca cheirar reagentes
• Nunca pipetar com aboca
• Lavar as mãos antes de iniciar o trabalho
• Bancadas limpas e organizadas
• Identificar todo o material utilizado
• O lixo deve ser perfeitamente identificado
• Lise celular
• Libertação de todo material intracelular
• Precipitação de proteínas e detritos celulares
• Purificação do DNA
Extração de DNA
Cinco etapas básicas:
1. Maceração mecânica
– Romper as paredes e membranas celulares do 
tecido
Extração de DNA
2. Ressuspender o material vegetal com o 
tampão de extração
– CTAB – detergente antioxidante – EDTA –
tamponante
• Solubilização das membranas e desnaturação de 
proteínas
Extração de DNA
• Incubar 60-65°C – 15 a 60 minutos
Extração de DNA
3. Extração com um solvente orgânico
– Clorofórmio: álcool isoamílico
– Precipitação dos polissacarídeos
Extração de DNA
Suspensão
Solução Sobrenadante
Precipitado
• Duas fases
• Aquosa
– DNA, RNA e alguns polissacarídeos
• Orgânica
– Lipídeos, polissacarídeos, proteínas
Extração de DNA
4. adicionar álcool (isopropanol ou 
etanol)
– Presença de álcool forma um 
precipitado
Extração de DNA
Extração de DNA
Extração de DNA
Material 
vegetal
Macerar o material 
o almofariz
Adicionar o tampão 
CTAB e incubar a 
65°C
Transferir 
o pó para 
o tubo
Adicionar 
clorofórmio: 
álcool isoamílico
Fase aquosa
Fase orgânica
Agitar
Centrifugar
Transferir a 
fase superior 
para novo tubo
Repetir o 
procedimento 
de 2 a 3 vezes
Adicionar 
isopropanol
CentrifugarDescartar 
sobrenadante e 
dissolver DNA
DNA
Extração de DNA
Extração de DNA caseira
Eletroforese
• Movimentação das moléculas através de uma matriz 
tamponada 
– Gel de acrilamida, agarose
– Funciona como um filtro
• Separação por tamanho da moléculas
– DNA – grupo fosfato tem carga negativa
Eletroforese
Eletroforese
Quantificação
• Leituras em
espectofotômetro e
análise comparativa
em geís de agarose
com brometo de
etídio
Marcador molecular de DNA - RFLP
• RFLP – Restriction fragment lenght polymorphism
• Polimorfismo no comprimento do fragmento de 
restrição
• O uso de sondas de DNA e o uso de enzimas de 
restrição.
Enzimas de restrição – consideradas “tesouras 
moleculares”, clivam o DNA em locais específicos –
sítios de restrição
Corte com Eco RI Corte com Eco RI
Fragmentos com 
Extremidades coesivas
vazio
vazio
Anelamento permite que moléculas de
DNA recombinante realizem um 
pareamento complementar.
As duas fitas não estão ligadas
covalentemente como pode ser visto 
nas 
áreas circuladas (vazio)
Etapas RFLP - sumarizadas
DNA Extraído - clivado – separados por eletroforese em gel 
de agarose – desnaturados em fitas simples – transferidos 
para uma membrana de nailon (Southern blot) – os 
fragmentos são fixados por meio de luz UV – Hibridização 
com sonda marcada – autoradiografia
1.Amostras de DNA cortadas com
enzimas de restrição são carregadas em
gel de agarose para eletroforese
Linha 1: Padrão de Tamanho Marcado
Linha 2: DNA cortado com enzima A
Linha 3: DNA cortado com enzima B
Eletroforese
DNA é desnaturado,
gel é colocado sobre 
material esponjoso
2. DNA é separado por 
Eletroforese e visualizado por
corante, fotorradiografia ou luz UV
Peso
Toalhas de Papel
Membrana de Nilon
Gel
Esponja
Tampão
3.A membrana, toalhas de papel e peso 
São colocados sobre o gel. O Tampão 
sobe por capilaridade transferindo os 
fragmentos de DNA para a membrana
4. A membrana com o DNA é colocada em uma embalagem 
plástica selada, com uma solução contendo a sonda marcada 
radioativamente
Cobrir o filtro com
Filme de Raio X
Autorradiograma
5. Membrana é lavada para remover excesso de sonda, secada, e 
colocado em contato com filme para fazer autorradiografia
RFLP
• O polimorfismo ocorre devido:
• A criação ou eliminação de sítios de restrição
• Mutação 
• Rearranjo dos segmentos de DNA – deleções, 
inserções.
Reação em cadeia da polimerase - PCR 
(Polymerase Chain Reaction)
• Kery Muris, 1980 
• Síntese de DNA in vitro
– Em escala exponencial
Reagentes utilizados na PCR
Reagentes utilizados na PCR
• DNA-molde ou DNA-alvo – o DNA que se 
deseja multiplicar;
• dNTPs (desoxirribonucleotídeos) – que irão 
formar as novas fitas:
– Adenina, Timina, Guanina e Citosina
Reagentes utilizados na PCR
• Oligonucleotideos iniciadores (primers) – que norteiam
a região do DNA a ser amplificada;
• Taq DNA-polimerase – enzima que polimeriza o DNA; e
• Co-fatores e fatores tamponantes – que garantirão a
atividade da enzima – ph ótimo.
1 - Desnaturação 94 – 96°C
2 - Anelamento ~68ºC
3 - Extensão 72ºC
PCR
Baseia-se em ciclos repetidos de replicação in
vitro da molécula de DNA.
DNA molde
Amplificação
exponencial
RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
Microssatélites – SSR (Simple
Sequence Repeats)
• Sequências Simples Repetidas, a qual 
• consiste de pequenas sequências de 
nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem.
• Essas sequências são distribuídas ao acaso 
no genoma e constituem a classe de 
marcador mais polimórfica hoje disponível 
- rotina
• Primers específicos (20 a 30 pb).
• Diferentes números de elementos simples 
repetidos.
• Cada segmento amplificado de tamanho 
diferente representa um alelo diferente do 
mesmo loco
• Co-dominantes
• Requer biblioteca de fragmentos genômico para 
o organismo de interesse

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