Conceitos de HPLC
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Conceitos de HPLC


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Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, 
HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
Conselho Regional de Química IV Região (SP) \u2013 Apoio: Caixa Econômica Federal
CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÃO IÔNICA
ION PAIR CHROMATOGRAPHY 
\u2022 A análise de compostos com carga tem sido obtida por supressão de ion (ajuste 
cuidadoso do pH da fase móvel para resultar em analito não ionizável.
\u2022 Determinação do pH ótimo da fase móvel em supressão de ion frequentemente 
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do método.
\u2022 Para amostras contendo mais de um componente ionizável, o método 
frequentemente nao é adequado.
\u2022 As limitações da supressão de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma 
metodologia mais adequada para a separação de componentes ionizados: 
cromatografia por interação iônica \u2013 ion pair chromatography.
\u2022 A técnica envolve a adição de composto iônico na fase móvel para promover a 
formação de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes são 
constituidos de uma cadeia alquílica com terminal ionizável.
\u2022 Quando usado com colunas hidrofóbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem 
ser usados para aumentar seletivamente a retenção de analitos carregados.
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QUANDO UMA FASE MÓVEL DEVE SER TAMPONADA?
Em HPLC com fase reversa, a retenção dos analitos está relacionada com sua 
hidrofobicidade. Quanto mais hidrofóbico o analito, mais ele será retido.
Quando um analito é ionizado, ele torna -se menos hidrofóbico e portanto sua retenção 
diminui.
Ácidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.
Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.
Portanto, nas separações contendo ácidos e/ou bases utilizando fase reversa, é necessário 
controlar o ph da faxe móvel, usando um tampão apropriado para se obter resultados 
reprodutíveis.
FASES MÓVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
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A figura 2 mostra que metilamfetamina é totalmente protonada em pH menor que 3 e sua retenção 
não é afetada por pequena mudança no pH da fase móvel. Já a pH 7, próximo de seu pKa, uma 
mudança de apenas 0.2 unidades de pH desloca a retenção de quase 9% .
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ANÁLISE QUALITATIVA
A análise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificação dos analitos de
interesse.
Existem dois casos a serem considerados para análise qualitativa com HPLC:
\u2022Análise Qualitativa em Controle de qualidade
\u2022Análise Qualitativa em identificações não rotineiras
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ANÁLISE QUALITATIVA
Análise Qualitativa em Controle de qualidade
É normalmente efetuada através da comparação do tempo de retenção ou
retenção relativa dos analitos de interesse com esses parâmetros de padrões. Tais
análises são realizadas com metodologias já estabelecidas.
É fundamental o controle e monitoramento das condições analíticas para evitar
conclusões errôneas.
Análise qualitativa em identificações não rotineiras
Neste caso é importante conhecer o máximo da história da amostra e utilizar
detectores que auxiliam a identificação da estrutura do composto, como detector
de espectrometria de massa.
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e são
detectáveis
Existem dois procedimentos:
\u2022 Normalização de área (% em área)
\u2022 Normalização utilizando-se a área corrigida
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Normalização de área (% em área)
Ai = área do composto i
\uf053Ai = somatória das áreas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua
concentração e que mesma concentração de diferentes compostos resulte em
áreas iguais (o que dificilmente ocorre).
100% x
A
A
i
i
i \uf0e5
\uf03d
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Normalização com área corrigida
Ai = área do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
\uf053AiFi = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
É necessário conhecer todos os componentes da amostra para determinação dos
fatores de resposta de cada componente
100% x
xFA
xFA
ii
ii
i \uf0e5
\uf03d
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS
Utiliza-se métodos absolutos quando:
\u2022 O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes da
amostra.
\u2022 Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente os
componentes de interesse
\u2022 Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições de
análise ou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-los.
\u2022 Quantificação de componentes em baixa concentração.
\u2022 Existem dois procedimentos:
\u2022Padronização externa
\u2022Padronização interna
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização externa
1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas padrões
injetando-se um determinado volume.
2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentração do analito através da
urva dec calibração.
Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver alteração de algum
parâmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variação da intensidade
de luz do UV-VIS ou alteração na FM, as áreas dos picos poderão ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibração e consequentemente os resultados serão incorretos.
Ai
Ci
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna
Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a mistura padrão são
modificadas pela adição de um composto considerado como padrão interno. O padrão
interno deve ter as seguintes características:
1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa.
2. Pico separado dos componentes da amostra
3. Eluir próximo dos componentes de interesse
4. Detecção semelhante dos picos de interesse
5. Concentração que produza área similar aos picos analisados
6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir com os
picos de interesse).
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