Conceitos de HPLC
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Conceitos de HPLC


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Conselho Regional de Química IV Região (SP) \u2013 Apoio: Caixa Econômica Federal
ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna
1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas
padrões contendo o padrão interno. Nessa curva de calibração utiliza-se a relação entre área
do componente i e área do padrão interno em função das relações de suas concentrações.
2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padrão interno (preferencialmente na
mesma concentração utilizada na calibração) e obtem-se a concentração do analito através
da curva de calibração.
Ai / Api
Ci / Cpi
Se o volume de amostra injetado for 
diferente do utilizado na calibração, ou se 
algum parâmetro analítico for alterado 
resultando em áreas diferentes daquelas 
esperadas nas condições de calibração, a 
relação de área entre analito e padrão 
interno não será afetada.
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\u2022 UHPLC \u2013 ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID 
CHROMATOGRAPY
\u2022 A tecnica utiliza particulas menores que 2µm o que fornece colunas com maior 
eficiência( maior número de pratos) e consequentemente melhor separação, desde 
que os analitos tenham coeficiente de partição diferentes.
\u2022 Normalmente utiliza-se colunas com 1.7µm o que acarreta maior pressão no 
sistema, sendo necessário utilizar equipamento configurado para isso.
\u2022 O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com pressões 
maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela.
\u2022 Em analises rápidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa 
de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de 
0.05 seg.
\u2022 SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS
\u2022 Waters Corporation \u2013 Acquity UPLC System \u2013 6 FE BEH/sílica
\u2022 Thermo Scientific \u2013 Accela High Speed LC \u2013 3 FE Hypersil Gold
\u2022 Agilent \u2013 1200 Series \u2013 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond
\u2022 Restek(colunas) \u2013 Pinnacle DB 1.9µm
\u2022 Grace/ Alltech - colunas
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V ERIFICAÇÃO DE EQUIVALÊNCIA DE COLUNAS HPLC
Dois grupos \u2013 projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parâmetros para caracterizar colunas
HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas.
\u2022 PROJETO USP \u2013 Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil-
Keystone, Waters
\u2022 Parâmetros avaliados: 
\u2022 Hidrofobicidade
\u2022 Quelação de metais
\u2022 Atividade do grupo silanol
\u2022 Seletividade
\u2022 Densidade de ligações
Projeto Snyder/Dolan \u2013 Grupo de trabalho Impurezas PQRI \u2013 informação obtida em Wyeth, Eli Lilly, 
FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras
\u2022 Parâmetros avaliados:
\u2022 Hidrofobicidade
\u2022 Seletividade
\u2022 Acidez \u2013 pontes de H
\u2022 Basicidade \u2013 pontes de H 
Capacidade de troca iônica
\u2022 Site: www.usp.org/USPNF/columns.html
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DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR
\u2022 Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento 
de método de análise por HPLC.
\u2022 São softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas, 
pois cada método é desenvolvido em pouco tempo.
\u2022 Dependendo da experiência em cromatografia e da complexidade da amostra, um 
método desenvolvido manualmente(método convencional), pode levar um mês ou 
mais.
\u2022 Com um desses programas eletronicos, o método pode ser desenvolvido em 
algumas horas ou poucos dias.
ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:
\u2022 DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) \u2013 www.molnar-institut.com/www.rheodyne.com
\u2022 CHROMSWORD AUTO - (Hitachi \u2013 Agilent \u2013 Iris) \u2013 www.chromsword-auto.com
\u2022 ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE \u2013 www.acdlabs.com
\u2022 POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography \u2013 BISCHOFF 
CHROMATOGRAPHY \u2013 www.poplc.def 
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REFERÊNCIAS PARA CONSULTA
\u2022 HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis \u2013 George Lunn \u2013 Norman Schmulf \u2013
Wiley Interscience \u2013 1997 (1632 pag.) \u2013 ISBN 0471181765
\u2022 HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals \u2013 George Lunn \u2013 Wiley \u2013
2005 (717 pag.) \u2013 ISBN 9780471669418
\u2022 HPLC for Pharmaceutical Scientists \u2013 Yuri Kazakevich \u2013 Rosario Lobrutto \u2013Wiley \u2013
Jan 2007(1104 pag.) \u2013 ISBN 9780471681625
\u2022 HPLC Made to Measure \u2013 Stravos Kromidas \u2013 Wiley \u2013 2006 \u2013ISBN 352731377X
\u2022 Validation Chromatographic Methods \u2013 A Practical Guide \u2013 David M. Bliesner \u2013 Wiley 
2006 \u2013 (304 pag.) \u2013 ISBN 9780471741473
\u2022 HPLC Practical and Industrial Applications \u2013 Joel Swadesh
\u2022 Modern HPLC for practicing scientists \u2013 Michael W.Dong \u2013 Wiley Interscience \u2013 2006 
\u2022 HPLC \u2013 A practical user\u2019s guide \u2013 Marvin C. McMaster \u2013 John Wiley & Sons - 2007
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REFERÊNCIAS PARA CONSULTA
Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho \u2013 REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a 
Ed.
Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life, 
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide, 
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis, 
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods, 
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
The Reporter, Optimizing HPLC Separations, 
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, 
pág. 12
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\u2022 FONTES DE INTERNET
\u2022 www.chem.agilent.com
\u2022 www.alltech.web
\u2022 www.dionex.com
\u2022 www.esind.com
\u2022 www.gls.co.jp
\u2022 www.hamiltoncompany.com
\u2022 www.macherey-nagel.com
\u2022 www.mac-mod.com
\u2022 www.merck.de
\u2022 www.microlc.com
\u2022 www.microsolvtech.com/
\u2022 www.phenomenex.com
\u2022 www.instruments.perkinelmer.com
\u2022 www.polymerlabs.com
\u2022 www.restekcorp.com/h
\u2022 www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco
\u2022 www.thermo.com
\u2022 www.tosoh.com/
\u2022 www.varianinc.com
\u2022 www.vydac.com/
\u2022 www.waters.com
\u2022 www.zirchrom.com/
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CEP CURSOS - Centro de Educação Profissional
O Centro de Educação Profissional (CEP) é uma Empresa voltada para a Educação 
Continuada e Profissionalizante através de: Cursos de Extensão Presenciais; 
Cursos a Distância (EAD); Cursos In-Company;Programas Especiais e Especializações; 
Assessoria e Consultoria Customizada;
Dentro das diversas áreas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentação e Desenvolvimento Analítico,
Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatórios, Pesquisa e Desenvolvimento,
Microbiologia e Habilidades Gerenciais.
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Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com
Av. Ibirapuera