Conceitos de HPLC
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Conceitos de HPLC


DisciplinaAnalise Instrumental Farmaceutica47 materiais143 seguidores
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compostos serem oxidados ou reduzidos quando se
aplica um potencial elétrico.
Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e um potencial
suficientemente elevado é aplicado provocando uma reação de oxidação ou redução
gerando uma corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é
proporcional a concentração do composto.
TIPOS DE DETECTORES
\u2022Amperométrico
O elemento flui pela superfície do eletrodo onde uma fração das espécies
eletroativas é oxidada ou reduzida (15-20%).
\u2022Coulométrico
O elemento flui através de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espécies eletroativas são oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é
muito maior (10-15 mol = fentomol) .
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS \u2013 COULOMÉTRICO
A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulométrica:
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS \u2013 COULOMÉTRICO \u2013 COULARRAY
É possível montar um conjuntos de detectores coulométricos em série o que permite aplicar um
potencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente
em cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar de
não terem sidos separados.
É possível o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais.
Tais detectores tem grande aplicação na análise de produtos farmacêuticos, bebidas e
alimentos, análises ambientais e em neurociência (neurotransmissores, drogas).
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS \u2013 COULOMÉTRICO \u2013 COULARRAY
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COMPARAÇÃO DE DETECTORES HPLC
Índice de Refração
Espectrofotometria UV-
VIS Fluorescência Eletroquímico
Princípio de operação Mudança do IR da fase móvel
Absorbância de luz UV-
VIS
Excitação com luz produz 
emissão fluorescente
Oxidação ou redução em 
um potencial fixo
Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo
Quantidade mínima 
detectável Micrograma Nanograma < picograma Fentograma
Faixa de linearidade 103 \u2013 104 104 \u2013 105 103 \u2013 105 105
Volume da cela 
(microlitro) 3-15 1-20 8-25 5-10
Sensibilidade a 
temperatura Alta Baixa Baixa Média
Aplicações Geral
Compostos que 
absorvem na região UV-
VIS
Compostos ou derivados 
que fluorescem
Espécies que oxidam ou 
reduzem
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ELSD \u2013 EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
\u2022 Detector universal para compostos não voláteis.
\u2022 Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento(scattering) de 
fótons, quando elas atravessam um feixe de luz policromática.
\u2022 O líquido efluente do HPLC é primeiro nebulizado e a mistura aerosol 
resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe de luz. As 
partículas causam espalhamento da luz. É gerado um sinal, que é proporcional 
à massa presente, e independe da presença ou ausência de grupos 
cromóforos, fluoróforos ou eletroativos.
\u2022 Qualquer analito não volátil pode ser detectado.
\u2022 Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de massa, para fornecer uma 
análise completa da amostra.
\u2022 Aplicações para o elsd:
\u2022 Lípidios, acidos graxos, carbohidratos, polímeros, esteroides, aminoácidos, 
aditivos de plásticos, produtos farmacêuticos, etc.
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ELSD \u2013 EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
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CHARGED AEROSOL DETECTOR
CORONA
\u2022 Este detector oferece os benefícios de desempenho que cada um dos detectores: 
índice de refração, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescência 
de nitrogênio num único detector.
\u2022 O eluente é primeiro nebulizado com nitrogênio, e as gotas são secas para remover 
a fase móvel, produzindo as partículas dos analitos.
\u2022 Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta voltagem e é 
carregado positivamente.
\u2022 Esta carga é transferida para as partículas do analíto, que flue em sentido oposto.
\u2022 A carga é transferida para um coletor onde é medida por um eletrômetro altamente 
sensível, gerando um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de analito 
presente.
\u2022 O fator de resposta do analito é independente da estrutura química.
\u2022 Aplicações do CAD:
\u2022 Ideal para uma larga faixa de aplicações de compostos não voláteis e semi-voláteis: 
drogas, carbohidratos, lipídios, esteróides, peptídios, proteínas, polímeros.
\u2022 Indústrias farmacêuticas, alimentícias, químicas, pesquisa life science,etc.
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QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES
Sensibilidade Faixa Dinâmica Consistência de 
Resposta
Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade 
Cromatográfica
Facilidade 
de Uso
Charged Aerosol \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b
UV \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b \u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b \u263b\u263b\u263b
Evaporative Light 
Scattering \u263b\u263b \u263b \u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b
Chemiluminescence 
Nitrogen \u263b\u263b\u263b \u263b\u263b \u263b\u263b \u263b\u263b \u263b\u263b \u263b \u263b
Refractive Index \u263b \u263b\u263b \u263b \u263b\u263b \u263b\u263b \u263b \u263b\u263b\u263b
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AQUISIÇÃO DE DADOS
Atualmente utilizam-se softwares que permitem:
\u2022Processar os dados de cromatograma
\u2022Armazenar e registrar
\u2022Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, 
amostrador automático, temperatura da coluna
\u2022Realizar cálculos para \u201cSystem Suitability Test\u201d (SST)
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
Em função da fase estacionária utilizada tem-se os seguintes 
mecanismos de separação:
\u2022Adsorção
\u2022Partição
\u2022Troca iônica
\u2022Exclusão
\u2022Bioafinidade
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
ADSORÇÃO
A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certas
substâncias.
Na adsorção tem-se o seguinte equilíbrio:
Compostos com diferentes constantes de adsorção são separados.
Kads = 
[adsorvido na FE]
[desorvido na FM]
FM FE
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
PARTIÇÃO
A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido.
As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionária
ligada e a fase móvel líquida de acordo com sua afinidade relativa:
Compostos com diferentes constantes de partição são separados.
Kpart = 
[dissolvido na FE]
[dissolvido na FM]
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