Conceitos de HPLC
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Conceitos de HPLC


DisciplinaAnalise Instrumental Farmaceutica47 materiais142 seguidores
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\u2013 Apoio: Caixa Econômica Federal
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REAÇÕES PÓS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITÚRICOS
característica original: baixa absorbância no UV
\u2022reação pós coluna: elevação de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a
absorbância máxima de barbitúricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,
porém, nessa condição, a FM dissolve a sílica da FE, assim, o problema é resolvido
elevando-se pH somente após a coluna.)
detecção: UV a 240 nm
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PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.
Particularmente na separação de compostos básicos e portanto um problema constante na 
análise de produtos farmacêuticos.
Picos com cauda causam inúmeros problemas, incluindo baixa resolução, sensibilidade 
reduzida , precisão e quantificação inadequada.
A figura 1 ilustra como a resolução e sensibilidade da amostra é afetada por picos com 
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatidão e precisão de uma análise pode sofrer devido a inabilidade 
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
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CAUSAS DE CAUDA NO PICO AÇÃO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE 
MÓVEL
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MÓVEL OU 
REDUZA A FORÇA DO SOLVENTE 
EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA
REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA
TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA 
DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES 
COLUNAS.
INTERAÇÃO DE SILANOL COM AMINAS
REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3 
AUMENTE A FORÇA IÔNICA DA FASE MÓVEL, 
25mM A 50mM É RECOMENDADO ADICIONE UMA 
AMINA COMPETITIVA NA FASE MÓVEL \u2013 10mM DE 
TEA É SUFICIENTE.
SELECIONE FASE ESTACIONÁRIA COM MENOR 
ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6
ADSORÇÃO DE ÁCIDOS NA sílica
AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MÓVEL.
25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.
REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3.
ADICIONE UM ÁCIDO ORGÂNICO COMPETITIVO. 
1% DE ACIDO ACÉTICO OU 0.1% DE TFA É 
USUALMENTE SUFICIENTE.
VAZIOS NA COLUNA
SUBSTITUA A COLUNA.
TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS 
RARAMENTE VALE A PENA.
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ANÁLISE DE COMPOSTOS BÁSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos básicos são normalmente comuns. 
Mas há vários passos simples que podem melhorar significativamente a forma do 
pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-sílica desativada.
2- Usar fase móvel com baixo ph. 
3 \u2013 Aumento da concentração de sais na fase móvel.
4 \u2013 Selecione uma coluna \u201cheavily endcapped\u201d.
5 \u2013 Adicione uma base competitiva.
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ANÁLISE DE COMPOSTOS ÁCIDOS
1\u2013 Adicione um ácido orgânico competitivo.
Adicionou-se 1% de ácido acético à fase móvel para minimizar as interações 
soluto-silanol, pela ação de um ácido competidor.
Os resultados foram notáveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente 
gaussiano \u2013 fator cauda 1.0.
2- Substituindo o ácido acético por 0.1% de ácido trifluoracético \u2013 tfa.
A concentração relativamente alta de ácido acético resulta em ruído da linha de 
base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase móvel mais 
transparente, menos ruído, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda 
simétrica, fator cauda 1.09.
Em pH 3, a fase móvel está tamponada, porém a capacidade tamponante é 
baixa. aumento da concentração para 10 \u2013 20mm melhorará a reprodutibilidade 
cromatográfica por mais tempo, além de melhorar ainda mais a forma do pico.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
\u2022 Tempo de retenção não reprodutível é 
um problema comum quando se usa fase 
móvel altamente aquosa.
\u2022 Na separação de compostos muito 
polares, solúveis em água não é 
incomum usar fm com menos de 10% de 
modificador orgânico(metanol, 
acetonitrila, etc.) Para conseguir 
retenção suficiente.
\u2022 Entretanto, nestas condições a 
reprodutibilidade é ruim.
\u2022 Com o tempo, os picos eluirão com 
tempo de retenção cada vez menores e a 
resolução piora.
\u2022 A figura mostra cromatogramas de 
análise de vitaminas em coluna ymc ods-
fm:5meoh \u2013 95% 0.1M KH2PO4 \u2013
f:1ml/min
\u2022 Vitamina C \u2013 vitamina B1 \u2013 vitamina B6 -
nicotinamida
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA 
\u2022 A mudança do tempo de retenção é causada pelo fenômeno denominado colapso de fase 
de fases alquílicas hidrofóbicas c18 ou c8 em condições de fase móvel altamente aquosas. 
\u2022 A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com 
solutos diminui e o tempo de retenção decresce.
\u2022 Há também evidência que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da 
FE, reduzindo a área superficial acessível para os solutos e portanto reduzindo os tempos 
de retenção. 
\u2022 Em condições normais a fase alquílica está extendida na FM e solvente e moléculas da 
amostra tem total acesso a fe.
\u2022 Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de retenção é 
afetado.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA
\u2022 A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base 
desativada;
\u2022 Após deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo 
de retenção de amoxicilina diminuiu de 5 min. 
Indicando colapso da fase; 
\u2022 Purgando a coluna com solvente orgânico a fase 
alquilica é novamente extendida e o tempo de 
retenção é restaurado.
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HPLC REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLUNAS QUE NÃO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema 
usando silanos polares com fase ligada ou 
usando \u201cendcapping\u201d hidrofilico.
Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase 
alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS 
quando se usa fase móvel 100% aquosa.