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4. Membrana Plasmática (MP) Conceito: A membrana plasmática é um envoltório celular que delimita um meio intracelular com características físicas e bioquímicas diferenciadas do meio extracelular sem, no entanto, isolar esta célula do meio exterior. Características Gerais: a.É uma membrana seletiva, de intercâmbio com o meio extracelular. b.Apresenta assimetria na constituição das lâminas externa e interna da membrana plasmática, em qualidade e quantidade de cada constituinte. c.Apresenta assimetria entre as superfícies externa e interna da membrana plasmática, devido à diferentes associações como o glicocálix (SE) e proteínas relacionadas ao citoesqueleto(SP). d.É visível somente ao ME, devido às suas dimensões em espessura, de 75 Å à 100 Å (7,5 nm à 10 nm). Sua localização ao MO só é possível pelo depósito de corantes nas superfícies externa e interna da membrana. e. Composição química: proteínas, lipídios e glicídios. Histórico: a composição química da MP foi estudada durante anos. 1665 - Robert Hooke observou a parede celular vegetal numa lâmina de cortiça. ±1895 - Overton - aspectos fisiológicos: propriedade de barreira e permeação. Observou que substâncias solúveis em lipídios penetravam com mais rapidez e facilidade nas células, assim postulou que a membrana plasmática possuía lipídios. 1925 - Gorter + Grandel - análise quantitativa de lipídios. Membranas plasmáticas de hemáceas foram lisadas e tratadas com acetona, esta solução, contendo lipídios dissolvidos foi posta em suspensão em meio aquoso e os lipídios ao flutuarem na superfície recobriram uma área 2 vezes maior que a superfície da hemácea, assim postularam que a membrana plasmática era formada por uma bicapa lipídica. Figura: 01 ±1930 - Dawson + Danielli - lançaram o primeiro modelo molecular para a membrana plasmática. Todos os lipídios em solução aquosa tendem a formar micelas, onde suas caudas hidrófobas associam-se ao centro deixando suas cabeças hidrofílicas voltadas para o meio aquoso, assim postularam um modelo para as capas lipídicas em que os lipídios de uma e de outra camada estariam associados por suas caudas hidrófobas enquanto suas cabeças hidrofílicas ficariam voltadas para o meio extracelular ou para o meio citoplasmático - bicapa lipídica com cerne hidrófobo e superfícies hidrofílicas. Figura: 02,03 1931 - 1933 - surge o ME. Figura: 05 ±1962 - Robertson - presença de proteínas. Ao observar que determinadas estruturas solúveis em proteínas também penetravam nas células propôs um modelo de membrana acrescido de proteínas, porém todas extrínsecas, formando uma capa externa nas duas faces da membrana - proteínas extrínsecas. Figura: 04 ±1972 - Singer + Nicolson - membrana em mosaico. Reestruturam o modelo anterior, onde a membrana plasmática passa a ser uma bicapa lipídica com macromoléculas protéicas incrustadas nestas capas (interna e externa) ou atravessando-as totalmente, onde há associações com glicídios na superfície externa da membrana, assim substâncias menos solúveis em lipídios passariam através das proteínas - proteínas incrustadas nas capas lipídicas e associação com glicídios na superfície externa. Figura:05 Modelos Atuais: atualmente se reconhece dois modelos de estrutura para a MP. A)MODELO DE MEMBRANA UNITÁRIA OU UNIDADE DE MEMBRANA - U.M. Este modelo só é visível em ME, onde se observa uma estrutura trilaminar, característica à qualquer biomembrana, com duas lâminas externas eletrondensas e uma lâmina clara central, este aspecto deve-se ao depósito de metais pesados, como o ósmio (OsO4), nas superfícies da membrana, nas técnicas preparatórias para a ME. Figuras: 07-09 B)MODELO MOLECULAR - "MOSAICO FLUIDO" Este modelo baseia-se em estudos: bioquímicos, criofratura, "capping". 1.Lipídios = formando bicapa molecular, e dotadas de mobilidade (participação do colesterol = lipídio da classe dos esteróides) 2.Proteínas = incrustadas nas capas lipídicas, e dotadas de mobilidade 3.Glicídios = polissacarídeos(oligossacarídeos ou monossacarídeos) ligados às proteínas e lipídios 5. Proteoglicanas = eventualmente integradas nas capas lipídicas Figuras: 10-15 NOTA: A membrana plasmática possui 50% de proteínas e 50% de lipídios, porém, devido ao alto peso molecular das proteínas, faz-se uma correspondência: 50 lipídios para 1 proteína de membrana. MEMBRANAS LIPÍDIOS PROTEÍNAS mielina 80% 20% lamelas cloroplastidiais 50% 50% eritrócitos 40% 60% membranas internas das mitocôndrias 25% 75% vacúolos gasosos - + Os elementos que integram as biomembranas se posicionam nesta estrutura em resposta às características de seus componentes, quanto a sua afinidade com o meio aquoso (efeito hidrofóbico), intra ou extracelular. REGIÕES HIDRÓFOBAS: CADEIAS HIDROCARBONADAS (C-H) REGIÕES HIDROFÍLICAS: RADICAIS NITROGENADOS RADICAIS FOSFATO AÇÚCARES HIDROXILA (OH) CARBOXILA (COOH) 4.1. Técnicas de Estudo das Membranas: LIPÍDIOS TÉCNICA OBJETIVO 1.solventes orgânicos (solubilização) quantidade 2.marcadores (grupo nitroxyl) mobilidade 3.biofísico (alteração da temperatura) fluidez da MP função do colesterol 4.genético (cepas de células mutantes) importância do colesterol PROTEÍNAS TÉCNICA OBJETIVO 1.marcação (imunocitoquímica) presença e posição 2.lise celular (solução hipotônica ou sonicação) fragmentação formação de “fantasmas” (seguido de marcação, solubilização ou digestão) 3.digestão proteolítica posição 4.exposição à solução salina proteínas periféricas 5.solventes orgânicos ou detergentes (solubilização) proteínas integrais 6.eletroforese identificação 7.criofratura presença e posição 8.heterocárions mobilidade passiva das proteínas da MP 9."capping" mobilidade ativa das proteínas da MP importância do citoesqueleto 10.campos magnéticos mobilidade Figuras: 40-53 GLICÍDIOS TÉCNICA OBJETIVO 1.bioquímico presença e posição 2.marcação (imunocitoquímica) presença e posição 4.2. Componentes da MP 4.2.1. Lipídios: - Fosfolipídios (fosfoglicerídeos com radicais nitrogenados): * fosfatidilcolina (=lecitina) – derivado do GLICEROL * fosfatidilserina – derivado do GLICEROL * fosfatidiletanolamina – derivado do GLICEROL * esfingomielina – derivado da SERINA Figuras: 16-18 - Esteróides : * colesterol Figuras:19-20 - Glicolipídios (glicídio (açúcar neutro ou dotado de carga) + lipídio): Representam cerca de 5% das moléculas lipídicas na capa lipídica externa das membranas plasmáticas das células animais. * glicolipídeo neutro – sem resíduo de NANA (ácido N-acetilneuramínico) - galactocerebrosídeos - mielina - 40% dos lipídios * glicolipídeo carregado – com resíduo de NANA (ácido N-acetilneuramínico) - gangliosídeos (=glicoesfingolipídios) - MP de neurônios, 5 –10% dos lipídios - gangliosídeo GM1 - MP dos enterócitos, receptor das toxinas da bactéria do cólera NOTA: quase todas as moléculas glicolipídicas da capa externa das bactérias e plantas, deriva do glicerol + açúcar, enquanto nas células animais derivam da serina. Figuras: 21-24 TÉCNICAS DE ESTUDO DAS MEMBRANASTÉCNICAS DE ESTUDO DAS MEMBRANAS LIPÍDIOSLIPÍDIOS TÉCNICA OBJETIVO 1.solventes orgânicos (solubilização) quantidade 2.marcadores (grupo nitroxyl) mobilidade 3.biofísico (alteração da temperatura) fluidez da MP função do colesterol 4.genético (cepas de células mutantes) importância do colesterol Formas de estudo dos lipídios de MP: 1.Solventes Orgânicos (QUANTIDADE): membrana plasmática de hemáceas lisadas e solubilizadas; lipídios flutuamem meio aquoso e recobrem uma superfície duas vezes (2 X) maior que a da MP da hemácea. CONCLUSÃO: lipídios arranjados em uma bicapa - BICAPA LIPÍDICA 2.Marcadores (MOBILIDADE): sintetiza-se um lipídio com a cabeça marcada por exemplo, com um grupo nitroxyl, que possui um elétron não pareado, e que emite sinais paramagnéticos detectados pelo eletroespectroscópio de ressonância (ESR), que capta assim os movimentos e orientação do lipídio na capa lipídica. CONCLUSÃO: movimentos de "flip - flop" (alternância nas capas da membrana); mobilidade lateral; rotação; flexão. Figura:25 3.Físico (FLUIDEZ E FUNÇÃO DO COLESTEROL): alteração da temperatura ambiente produz dois estados físicos diferentes na MP: FLUIDO E VISCOSO (GEL) (transição de fase). CONCLUSÃO: a constância do estado fluido (NORMAL) da MP depende de: - comprimento da cadeia de ácidos graxos - presença de liga dupla (insaturada) nas caudas (cadeias hidrocarbonadas), o que impede as ligações com as cadeias de lipídios vizinhos (da outra capa) - presença de colesterol que dá estabilidade mecânica, porque a cadeia de esteróides é que fixa as porções das cadeias dos ácidos graxos próximos, impedindo que se liguem com as caudas de lipídios vizinhos, o que provocaria o estado gel (cristalizado), com uma conseqüente queda da permeabilidade da membrana. 4.Genético (IMPORTÂNCIA DO COLESTEROL): criação de uma cepa de células animais mutantes, incapazes de sintetizar colesterol, tendo rapidamente suas membranas lisadas e morte, no entanto se fôr adicionado ao meio o colesterol, elas são capazes de adicioná-lo às membranas e sobrevivem. CONCLUSÃO: a presença do colesterol é fundamental à manutenção da integridade da membrana plasmática. Obs.: outras biomembranas podem não apresentar colesterol como a da bactéria que usa outros recursos para a estabilidade, por exemplo, a capa lipídica acessória à parede celular bacteriana. NOTA: VER TAMBÉM DADOS SOBRE A IMPORTÂNCIA DOS LIPÍDIOS DA MEMBRANA NO TÓPICO SOBRE GLICÍDIOS 4.2.2. Proteínas: A associação com a capa lipídica pode ser: Total proteína intrínseca ou integrante ectoproteína endoproteína integral ou transmembrana Superficial proteína extrínseca ou periférica externa Interna Figura: 11 1 -PROTEÍNAS INTRÍNSECAS ou INTEGRANTES = são aquelas total ou parcialmente imersas nas capas lipídicas da membrana. São moléculas de natureza anfipática, com porções: hidrofílicas - (-NH2) e (-COOH) voltadas para a superfície protoplasmática(SP) ou superfície externa(SE) da membrana hidrofóbicas - voltadas para a proteção do centro das duas lâminas lipídicas da membrana, interagindo através de ligações covalentes com as caudas dos lipídios. De acordo com o tipo de associação com as capas lipídicas podem ser classificadas em: ECTOPROTEÍNAS Receptor do complexo de ativação do metabolismo celular ENDOPROTEÍNAS Adenilato-ciclase (hepatócito), Proteína G INTEGRAL ou Glicoforina (hemácea) TRANSMEMBRANA Conexina - 6 subunidades (junção GAP) Banda III Receptora da Acetilcolina Figura: 28 ECTOPROTEÍNA = na capa lipídica externa, em contato com o meio extracelular. Receptor de membrana - modelo do complexo de ativação do metabolismo celular. ENDOPROTEÍNA = na capa lipídica interna, em contato com o citoplasma. • Adenilato ciclase (ou Adenilciclase) = é uma proteína ATPásica, chamada de efetora pois integra um dos modelos de complexos de ativação do metabolismo interno celular, ativado por receptores de membrana. • Proteína G = assim chamada por sua afinidade com GTP, também atua como integrante de um dos modelos de ativação celular INTEGRAL OU TRANSMEMBRANA = atravessa as duas capas lipídicas entrando em contato com as duas superfícies da membrana, SE e SP. • Receptor de membrana = modelo do complexo de ativação do metabolismo celular. • Glicoforina = presente na membrana das hemáceas e até agora sua função é desconhecida. Seu radical NH2 está voltado para fora da célula e o radical COOH, para dentro; enquanto que a cadeia hidrofóbica de aminoácidos (AA) permanece dentro da membrana. • Banda III = proteína que forma um poro iônico da membrana das hemáceas, fazendo a troca do ácido carbônico (HCO3-) pelo íon Cl- nos tecidos do pulmão, liberando o CO2. • Conexina = são seis subunidades protéicas compondo um poro iônico, presente nas junções GAP (ou eletrotônicas) e nos locais de sinápse elétrica. • Integrina = sítio de ligação para a porção central da fibronectina, conetando a MP à LB. • Caderinas = responsável por uniões célula a célula (desmossomos, zônulas aderentes) • Selectina P = proteína com domínio lectina (AA) expressa na membrana de células endoteliais em locais onde o conjuntivo foi lesado ou invadido por corpo estranho e é responsável pelo reconhecimento e ligação com seqüência de açúcares da superfície celular do leucócito. Figuras: 29-32 2-PROTEÍNAS EXTRÍNSECAS ou PERIFÉRICAS = são aquelas que não penetram nas capas lipídicas, permanecendo fracamente associadas aos constituintes da membrana na sua SE ou SP. As proteínas se valem de dois mecanismos para sua ancoragem: 1.ancoragem a partir de parte parte de sua cadeia terminal (3AA) que é substituída(substituição) pela ligação (acetilação) à um lipídio do grupo prenil (prenilação), farnesil ou miristil de lipídios parentes do colesterol, que se integram à bicapa lipídica ancorando a proteína; 2.associação ,não covalente, à outras proteínas integrais da MP; 3. Ou lainda a associação pelos açúcares da proteína periférica aos açúcares dos elementos da biomembrana Figura: 33 De acordo com a face da membrana à qual estão associadas , as proteínas periféricas ou extrínsecas são classificadas em: Figuras: 34 PERIFÉRICAS EXTERNAS = associadas à SE da membrana, banhadas pelo fluido extracelular. 1)Acetilcolinesterase = proteína enzimática, responsável pela degradação do mediador acetilcolina em acetato + colina (acetato é perdido - recuperado pelas mitocôndrias, e a colina - composto nitrogenado é reaproveitado); presente nas membranas pré e pós sináptica. PERIFÉRICAS INTERNAS = associadas à SP da membrana, banhadas pelo citoplasma. 1)Espectrina = proteína fibrosa formada pela associação lateral de duas cadeias polipeptídicas, presente na membrana da hemácea de mamíferos, onde constitui cerca de 30% das proteínas da MP desta célula. Dispõe-se numa rede justaposta à SP da membrana, sendo que a proteína citoplasmática actina também participa desta rede. Possui duas funções conhecidas: a)associada à proteína citoplasmática ACTINA compõem uma rede protéica justaposta à SP da membrana que ancora-se às proteínas integrais da MP, permitindo assim, a manutenção da morfologia celular, um disco bicôncavo. b)auxilia no ancoramento da proteína integral Banda III ao citoesqueleto (o que restringe a mobilidade da proteína na camada lipídica) função esta que é intermediada por outra proteína periférica interna, a ANKIRINA, presente junto de cada Banda III. 2)Anquirina Figuras 35-38 PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS Tipo celular Enzimas ---------------------------------------------------------------------------- hemáceas adenosina-tri-fosfatase glicose-6-fosfatase (REL) anidrase carbônica mielina nenhuma enterócitos di-sacaridases di-peptidases fosfatases hepatócitos adenilciclase adenosina-tri-fosfatase glicose-6-fosfatase (REL) 4.2.3. Glicídios (poli ou oligossacarídeos): São açúcares, quimicamente neutros ou dotados de cargas iônicas (normalmente pela presença do resíduo de ácido siálico, conhecido como ácidoN-acetilneuramínico ou NANA, que confere carga negativa ao glicídio), e que se apresentam associados aos constituintes da membrana plasmática, somente na sua superfície externa (SE): * glicídio + proteína = glicoproteína * glicídio + lipídio = glicolipídio A função dos glicídios, propriamente ditos é desconhecida, as únicas funções associadas à presença dos glicídios, é na verdade de complexos glicoprotéicos ou glicolipídicos, como por exemplo: 1) Gangliosídeo GM1 = glicolipídios com carga negativa, receptor da toxina da bactéria do cólera presente na membrana plasmática dos enterócitos, e só difere na sua constituição dos TÉCNICAS DE ESTUDO DAS MEMBRANAS PROTEÍNASPROTEÍNAS TÉCNICA OBJETIVO 1.marcação (imunocitoquímica) presença e posição 2.lise celular (solução hipotônica fragmentação ou sonicação) formação de “fantasmas” ou lipossomos (seguido de marcação, solubilização e/ou digestão) 3.digestão proteolítica posição 4.exposição à solução salina proteínas periféricas 5.solventes orgânicos ou detergentes (solubilização) proteínas integrais 6.eletroforese identificação 7.criofratura presença e posição 8.heterocárions mobilidade passiva das proteínas de MP 9."capping" mobilidade ativa das proteínas de MP importância do citoesqueleto 10.campos magnéticos mobilidade passiva das proteínas de MP demais glicolipídios de membrana pela sua seqüência de açúcares. Porém não se acredita que seja esta sua função normal, apenas coincidente. 2) Galactocerebrosídeos = glicolipídios neutros, compondo cerca de 40% da capa lipídica externa da membrana plasmática das células que fazem a mielina, e que não está presente com estas concentrações em nenhum outro tipo conhecido de célula animal, portanto sugere-se que tenha importante função no processo de mielinização. 3)Gangliosídeos = glicolipídios com carga negativa, compondo cerca de 6% do total de lipídios da membrana plasmática de neurônios, enquanto que em outros tipos celulares ele é encontrado em pequeníssimas quantidades. Desta forma acredita-se que deva ter importante participação na fisiologia destas células. 4)Glicocálix = lembrar de todas as funções do glicocálix e que na verdade não se pode dizer que é dos glicídios, mas sim dos constituintes da MP, tanto lipídicos como protéicos, já discutidos, porém sempre, e obrigatoriamente associados á glicídios na sua porção voltada para a superfície externa da membrana, e que devem contribuir para sua funcionalidade. 5)Glicoproteínas = ex. Banda III 4.3. Modelo para o Complexo Receptor-Efetor de ativação do metabolismo celular e/ou início de fenômenos de MP A)Complexo receptor-efetor de ativação na membrana da célula-alvo: R = proteína receptora da membrana PG = proteína G (neste caso PGs-estimuladora) E = proteína efetora (enzimática ou poro de membrana) Figura: re01 B)Ativação do receptor: Um hormônio ou neurotransmissor denominado de 1º MENSAGEIRO ou simplesmente de AGONISTA, alcança o RECEPTOR, uma proteína transmembrana ou ectoproteína, na membrana da célula-alvo. A união do hormônio com o receptor faz com que esta proteína receptora mude de conformação e atue sobre um outro constituinte desta membrana, a PROTEÍNA G (assim denominada por ter afinidade com o nucleotídeo Guanina das moléculas de GTP ou GDP do citoplasma). Figura: re02 C)Ativação da proteína G: A proteína G, que até então estava inerte e ligada a uma molécula de GDP, é ativada pelo complexo receptor-agonista, liberando este GDP para o citoplasma e trocando-o por um GTP. Figura: re03 B e C)Inativação do receptor: A PG ativada (ligada à um GTP) associa-se ao receptor e induz a liberação do agonista e inativação do receptor por um curto período de refratariedade, ou seja, enquanto a proteína G estiver ligada à uma molécula de GTP. Figura: re04 C)Ativação do efetor: A seguir, a proteína G dissocia-se do receptor e liga-se à proteína efetora (uma endoproteína ou uma proteína transmembrana). Imediatamente após a formação do complexo PG-Efetor, ocorre a quebra da molécula de GTP em GDP, produzindo a ativação da proteína efetora. Figura: re05 C)Ação da proteína efetora: 1 - Ativação do metabolismo celular: A proteína efetora (proteína enzimática), ativada, quebra no citoplasma uma molécula de ATP em uma molécula de AMPc. A MOLÉCULA DE AMPc no citoplasma é denominada de 2o MENSAGEIRO, pois cumprirá a função de atuar sobre as proteínas K ou QUINASAS, capazes de fosforilar (adicionar fosfatos) em enzimas do metabolismo celular, estas por sua vez quando fosforiladas podem ser ativadas ou inibidas e por conseqüência ativarem ou inibirem as rotas metabólicas, alterando a produção do produto final. No caso do fígado uma quinase pode: ativar a enzima glicogênio fosforilase que ativa a glicogenólise, quebrando o glicogênio armazenado no citoplasma, e ao mesmo tempo inibir a enzima glicogênio sintetase responsável pela glicogênese no fígado. Figura: re06 2 - Início de fenômenos de membrana: Estes fenômenos de membrana podem ser interpretados como alterações momentâneas na permeabilidade à determinadas substâncias (freqüentemente íons), que produzem alterações localizadas no potencial da membrana, ou ainda esta alteração da permeabilidade permite a entrada massiva, também temporária, de um determinado íon que, no citoplasma, vai atuar sobre algum constituinte celular, ativando-o, desta forma temos aqui um segundo mecanismo de ativação do metabolismo celular. Para qualquer destes casos, é necessário que a proteína efetora seja também um PORO DE MEMBRANA, freqüentemente uma proteína transmembrana ou um complexo de várias subunidades protéicas, que quando ativada pela PG, abre-se permitindo momentaneamente a passagem massiva de um determinado íon. Figura: re07 C e D)Inativação da proteína G e reativação do receptor: Imediatamente após a ativação do efetor, a proteína G, ainda ligada à uma molécula de GDP, separa-se do efetor. Desta forma têm-se a inativação automática da PG, que só será ativada novamente em um novo ciclo, e a reativação do receptor, até então inativado. O complexo receptor-efetor de ativação está apto a reiniciar novo ciclo. Figura re:08 Figura: 39 MODULAÇÕES DOS EFEITOS DO COMPLEXO A ação de um único efetor pode estar sujeita à interação com mais de um complexo de membrana. Além disto é preciso lembrar que: *Existem dezenas de tipos de agonistas (1os mensageiros) *Existem cerca de 80 tipos de receptores conhecidos; *Existem dois tipos de proteínas G (PG): PG+ ou PGs = estimuladoras, capazes de ativar o efetor PG- ou PGi = inibidoras, capazes de inibir a ação do efetor *Existem cerca de 8-10 tipos de efetores conhecidos. Figura: md01 Exemplo no fígado: No caso do fígado necessitar fornecer açúcar para a corrente sanguínea, um hormônio (glucagon ou adrenalina), denominado 1º mensageiro ou agonista, alcança o receptor na MP dos hepatócitos, uma proteína transmembrana, que inicia a cascata de eventos e ativa, no citoplasma, uma quinase, que ao adicionar fosfatos em enzimas do metabolismo celular pode: ⇒ativar a glicogênio fosforilase que ativa a glicogenólise, quebrando o glicogênio armazenado no citoplasma, e ao mesmo tempo ⇒inibir a enzima glicogênio sintetase responsável pela glicogênese no fígado. NOTA: * insulina = absorção de açúcar circulante no sangue; * glucagon = mobilização do glicogênio armazenado nas células. Ambos são secretados pelas células das Ilhotas do Pâncreas – sua porção endócrina. TÉCNICAS DE ESTUDODAS MEMBRANAS LIPÍDIOS TÉCNICAS DE ESTUDO DAS MEMBRANAS PROTEÍNAS
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