O diagnóstico pre natal de toxoplasmose PCR

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O diagnóstico pré-natal da toxoplasmose fluido amniótico por PCR
Diagnóstico da toxoplasmose pré-natal não Líquido amniótico atraves da Técnica de PCR
 
Paula Vieira Teixeira Vidigal 1 , Daniel Vítor Vasconcelos Santos 1 , Flávia Cipriano Castro 2 , Júlio César de Faria Couto 3 , Ricardo Wagner de Almeida Vitor 4 e Geraldo Brasileiro Filho 1
 Abstract A ​​toxoplasmose é uma das infecções mais comuns em todo o mundo. A maioria dos casos é assintomática, exceto em indivíduos imunodeprimidos e fetos, que podem ser seriamente danificados. Diagnóstico pré-natal deve ser feita o mais rapidamente possível uma vez que o tratamento da mãe pode minimizar seqüelas fetal. Nosso objetivo neste estudo foi testar a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em 86 amostras de líquido amniótico de mulheres que apresentaram soroconversão durante a gravidez. O DNA foi amplificado utilizando iniciadores externos e, em uma segunda etapa, os iniciadores internos, num sistema de PCR aninhada. As amostras também foram inoculados em ratinhos e o recém-nascido foram avaliadas por T. gondii sorologia, crânio de raios-x, ultra-som transfontanelar, exame de fundo de olho, punção lombar e exame clínico. PCR foi positiva em sete casos e negativa em 79. Entre os casos de PCR-positivo, dois foram negativos por inoculação em camundongos e pela avaliação clínica; entre os de PCR-negativos, três tinham evidência clínica de toxoplasmose e um foi positivo após a inoculação em camundongos. PCR apresentou valores de sensibilidade = 62,5% e especificidade = 97,4%; os valores de inoculação em ratinhos, onde 42,9% e 100%, respectivamente. Embora PCR não deve ser utilizado como único teste diagnóstico da toxoplasmose congênita, é um método promissor e merece mais estudos para aumentar a sua eficácia. 
Palavras-chaves : A toxoplasmose congênita. PCR. O líquido amniótico .
Resumo A toxoplasmose E Infecção Frequente em Todo o Mundo, MAS na maioria dos Casos NÃO Traz repercussões IMPORTANTES PARA O Paciente, EXCETO indivíduos imunodeprimidos e Fetos, PODEM OS Quais apresentar seqüelas sepulturas. O diagnóstico precoce Durante a Gravidez E Altamente desejável, JA Que o Tratamento da gestante reduz a Freqüência e Gravidade da Infecção fetal. Neste Estudo aplicou-se a Técnica de PCR em 86 Amostras de Líquido amniótico de gestantes apresentaram soroconversão that during a Gravidez. O DNA foi amplificado usando-se iniciadores Externos e Internos, num Sistema de nested PCR. Como Amostras were also inoculadas em Camundongos e Os recém-Nascidos acompanhados clinicamente atraves de sorologia, RX de crânio, ultrassom transfontanela, Exame de Fundo de olho e punção lombar. Pela PCR, sete Casos Positivos e were 79 Negativos. Entre Positivos OS, Dois NÃO se confirmaram Pela inoculação em camundongo NEM Pela Avaliação Clínica da Criança; DOS Negativos, Três apresentaram clínica de toxoplasmose congênita, E UM DELES em o Exame de inoculação em camundongo foi positivo. A Sensibilidade e especificidade da PCR were 62,5% e 97,4%, respectively; uma inoculação em Camundongos mostrou 42,9% de Sensibilidade e 100% de especificidade. . Embora a PCR NÃO deva Ser Usada Como Único teste diagnóstico da toxoplasmose congênita, Trata-se de Método promissor e merece Mais ESTUDOS parágrafo Aumentar SUA efficacy 
Palavras-chaves : Toxoplasmose congênita. PCR. Líquido amniótico.
 A toxoplasmose congênita é o resultado de transmissão transplacentária de Toxoplasma gondii de uma mãe com infecção aguda.O risco de infecção fetal varia de acordo com a idade gestacional no momento da infecção materna. Quando isso ocorre nas 11-14 semanas de gestação, a incidência de infecção fetal é de 7,2%, enquanto que durante o período de 31-34 semanas, é de 67%; a taxa global de infecção fetal é de 7,4% 12 .
Crianças infectadas congenitamente pode apresentar, no momento do nascimento, os sinais e sintomas clássicos de toxoplasmose congênita, tais como hidrocefalia, coriorretinite, calcificações cerebrais e acidente vascular cerebral, ou eles podem ser livres de sintomas e desenvolver sequelas a longo prazo durante a infância ou na vida adulta 15 .
A toxoplasmose pode ser diagnosticada por: 1) perfil serológico, embora isso possa não ser fiáveis ​​no aqueles que são imunodeficientes, como no feto; 2) isolamento do parasita por inoculação de animais ou de cultura celular, o que é demorado; 3) manifestação do genoma do parasita pela reação em cadeia da polimerase (PCR), um método promissor, devido à sua boa sensibilidade e alta especificidade relatada 12 .
Tratamento anti-parasitário precoce de mães infectadas tem sido demonstrado que tanto a diminuir a taxa de transmissão para o feto e para reduzir as sequelas infecção intra-uterina quando já ocorreu 17 . Uma vez que a escolha do tratamento anti-parasitário depende ou não está infectado o feto, a detecção precoce do parasita é muito importante 10 .
O objetivo deste estudo foi aplicar a técnica de PCR para o líquido amniótico para o diagnóstico pré-natal de toxoplasmose congênita e comparar estes resultados com o diagnóstico clínico pós-natal. 
PACIENTES E MÉTODOS
Foram estudadas 86 amostras de líquido amniótico de mulheres nas quais adquiridos T. gondii infecção durante a gravidez ocorreu. A infecção foi detectada durante um programa de triagem sorológica de rotina realizada na Unidade de pré-natal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (HC-UFMG) e Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, Minas Gerais. Inicialmente sorologia (ELISA, ELIFA, imunofluorescência) foi realizada em cada trimestre de gestação. No caso de um resultado positivo, era então realizada mensal. Para o diagnóstico de infecção do feto, parte do fluido amniótico foi submetido a PCR e a outra parte foi inoculada em ratinhos. Após o nascimento, os bebês foram acompanhados periodicamente pela equipe do infectologista do HC-UFMG, e T. gondii sorologia, crânio de raios-x, ultra-som transfontanelar, exame de fundo de olho, punção lombar e avaliação clínica foram realizadas. A infecção congênita foi confirmada (sinais e / ou sorologia clínicos) ou descartados (sinais clínicos sorologia ausente e negativo) após pelo menos seis meses de follow-up.
A extracção do ADN. A partir das amostras de líquido amniótico, 1 ml foi usada para extracção de ADN. Este consistiu de centrifugação a 5,000rpm durante 10 minutos, seguido por descarga de 800  L do sobrenadante. A 200  L esquerda foram incubadas a 100 o C durante 15 minutos; 450  L de etanol e 20  L de acetato de amónio foram então adicionados e o tubo foi mantido a -80 o C durante 60 minutos ou a -20 o C durante a noite. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 15.000 rpm, a 4 o C durante 30 minutos, o sobrenadante foi descarregado e o pelete foi ressuspendido em 50  L de água desionizada.
T. gondii a amplificação de ADN. Realizou-se PCR utilizando dois pares de iniciadores que se ligam ao gene B1 2 doToxoplasma gondii, levando a amplificação de fragmentos de 690 pb e 178 ( Tabela 1 ). A mistura de reacção para a primeira amplificação consistiu em: 1) 10  L da suspensão de ADN molde; 2) 25 pmol de cada um dos primários exteriores 1 e 4; 3) 3  L de dNTP 2 mM (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); 4) 1.5U de polimerase Taq; 5) 2  L de tampão de PCR 10X (15 mM de MgCl 2 , 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH = 8); 6) de água desionizada para obter um volume final de 20  L. A amplificação de ADN foi realizada em um termociclador MJ Research MiniCycler TM (25 ciclos de um minuto de desnaturação a 95- O C, de um minuto, emparelhamento a 55 o C, de 1,5 minutos de extensão a 72- O C e no final do programa um de sete minutos finais-extensão-a 72o C).
 
 
Após a primeira amplificação, 1  L (10x diluída) do produto foi novamente amplificado, agora utilizando primários interiores 2 e 3. O programa de amplificação foi o mesmo, excepto a temperatura de annealing (60 o C).
Todas as reacções de amplificação continham uma positiva (um microlitro de ADN extraído a partir de um T. gondii cultura) e negativo (10 L) DDW controlos. Os produtos foram submetidos a electroforese e analisadas em 6% de gel de poliacrilamida corado com prata.
. Rato inoculação 2-5ml do líquido amniótico foram centrifugadas a 2.000 rpm durante 10 minutos; depois de descarregar o sobrenadante, 1 ml de PBS (solução de tampão fosfato) foi adicionado ao sedimento e o produto foi inoculado por via intraperitoneal em dois ratinhos. Os animais foram avaliados clinicamente por dia; quando a morte ocorreu, o líquido peritoneal foi analisado ao microscópio (procurando taquizoítas). Se depois de 30 dias, os animais ainda estavam vivos, eles foram sacrificados; sorologia para T. gondii foi realizada eo cérebro foi examinado para cistos teciduais.
A análise estatística foi realizada em Epi-Info Software 5 Versão 6.04, usando qui-quadrado (comparação de frequências), ANOVA (comparação de médias) e de Kruskal-Wallis (comparação das medianas) testes, dependendo do perfil de dados e distribuição.
 
RESULTADOS
A partir dos 86 casos de toxoplasmose aguda gestacional estudada, a transmissão materno-fetal ocorreu em 8 (9,3%). As manifestações clínicas dos recém-nascidos infectados eram variáveis, como mostrado na Tabela 2 .
 
 
A média de idade da mãe no grupo com infecção congênita foi de 19,2 ± 3,0 (mediana = 19 anos) e no grupo sem toxoplasmose congênita foi de 23,9 ± 5,4 (mediana = 24 anos) (p = 0,02). Não houve diferença na história gestacional da mãe, a idade gestacional (mediana = 37,5 semanas no grupo com infecção congênita e mediana de 38 semanas no grupo sem infecção, p = 0,21) e sexo recém-nascido (p = 0,26). A média de peso ao nascer foi menor no grupo infectado (média = 2,236.2 ± 922g; mediana = 2,470g) do que em um não-infectado (média = 3.023 ± 495 g; mediana = 3,045g) (p = 0,01). Uma pontuação minuto-Apgar mostrou medianas semelhantes nos dois grupos (8 e 8; p = 0,49); No entanto, cinco minutos a pontuação-Apgar foi estatisticamente diferentes (medianas 8 e 9 nos grupos infectados e não-infectados, respectivamente; p = 0,04) ( Tabela 3 ).Exceto para os escores de Apgar, os dados em falta (que não poderiam ser obtidos a partir dos registros disponíveis) foram inferiores a 10%, o que significa boa confiança estatística.
 
Exames de pré-natal. Em cinco dos oito casos de infecção congênita, ultra-som pré-natal (EUA) mostrou alguma alteração (quatro hidrocefalia, dois dilatação ventricular, dois calcificações hepáticas e uma calcificações intracerebrais e crescimento intra-uterino restrito). Em quatro casos do grupo sem toxoplasmose congênita, algumas mudanças foram detectadas por US (hepática e calcificações intracerebrais, hidrocefalia e polidrâmnio). US mostrou valores de sensibilidade = 62,5% (IC 95% 25,9-89,8), especificidade = 94,8% (IC 95% 86,5-98,3), valor preditivo positivo = 55,6% (IC 95% 22,7-84,7), valor preditivo negativo = 96,1% (IC 95% 88,1 -99,0%) ( Tabela 7 ).
 
 
 
 
 
PCR no líquido amniótico foi positiva em cinco dos oito casos de transmissão materno-fetal (três casos falso-negativos). No grupo sem transmissão fetal, a PCR foi positivo em duas (dois falsos-positivos) ( Tabela 4 ). Sensibilidade = 62,5% (IC 95% 25,9-89,8), especificidade = 97,44% (IC 95% 90,2-99,6), valor preditivo positivo = 71,4% (IC 95% 30,3-94,9), valor preditivo negativo = 96,2% (IC 95 % 88,6-99) ( Tabela 7 ). Nas amostras positivas por PCR (cinco resultados correctos e duas falso-positivo), em apenas um caso o resultado foi alcançado após a primeira amplificação; em todos os outros, o segundo passo foi necessário. Isto ocorreu quando o mesmo par de iniciadores (internas) foi utilizada para ambas as amplificações ou quando o sistema exterior e interior (nested PCR) foi aplicado.
Inoculação de líquido amniótico em ratos foi realizado em sete casos no grupo com toxoplasmose congênita; os resultados foram positivos em três e negativa nos outros quatro casos. Não havia nenhum resultado falso-positivo ( Tabela 5 ). Sensibilidade = 42,9% (CI 95% 11,8-79,8), especificidade = 100% (IC 95% 92,4-100), valor preditivo positivo de 100% = (IC 95% 31,0-100), valor preditivo negativo = 93,7% (IC 95 % 83,7-97,9) ( Tabela 7 ).
Quando PCR foi associada à inoculação do rato, os resultados foram ligeiramente diferente ( Tabela 6 ): sensibilidade = 75% (IC95% 35,6-95,5), especificidade = 96,6% (CI 95% 87,3-99,4), valor preditivo positivo = 75% ( CI 95% 35,6-95,6), valor preditivo negativo = 96,6% (CI 95% 87,3-99,4) ( Tabela 7 ).
Tabela 8 mostra uma comparação entre os pré-natal e pós-natal e exames de diagnóstico clínico final da toxoplasmose congênita.
 
 
DISCUSSÃO
A toxoplasmose congênita, uma infecção em todo o mundo, pode variar de assintomático a seqüelas graves. Prevenção de danos recém-nascido pode ser alcançado por informações das mães, o tratamento de mulheres grávidas já infectados e tratamento precoce dos recém-nascidos. O tratamento é conhecida a reduzir as taxas de transmissão e manifestações clínicas 9 . Quanto mais cedo o diagnóstico é feito, melhor o resultado.
A taxa de transmissão materno-fetal encontrada neste estudo foi de 9,3%, superior 7,4% obtido por Hohlfeld et al 12 e inferior a 38,7% e 29% a partir de Foulon et al 8 e Dunn et al 6 , respectivamente. No entanto, não foi possível determinar a taxa de transmissão de acordo com o período de seroconversão materna, que pode variar amplamente.
Existem muitos estudos que descrevem a utilização de PCR para diagnosticar a toxoplasmose, usando gene P30 2 , DNA ribossomal 3 ou TGR1E 4 (uma sequência de ADN original é repetitivo) como alvo para amplificação. Em nosso estudo, usando gene B1 como alvo 1 , obteve-se 62,5% de sensibilidade e 97,4% de especificidade (dois resultados falso-positivos e três falso-negativos), valores inferiores aos obtidos por Hohlfeld et al 12 , Cazenave et al 3 e Gratzl et al 11 . Resultados semelhantes foram a sensibilidade de 76,2% de Gangneux et al 16 e 55% de Jenum et al 13 .
Os dois casos falso-positivos podem ser explicados: 1) PCR pode detectar T. gondii ADN já danificado por drogas usadas no tratamento, que é incapaz de infectar rato, cultura de células ou o feto; 2) embora tenham sido tomadas todas as medidas para evitar a contaminação da amostra, isso não pode ser descartada; 3) após o nascimento, as crianças foram acompanhados clinicamente durante pelo menos seis meses, quando o tratamento foi interrompido e os doentes não foram mais vistos. Uma vez que existem casos de seqüelas que aparecem 15-20 anos depois, podemos ser misdiagnosing alguns casos 14 ; 4) uma ligeira possibilidade é a contaminação da amostra por sangue materno.
Para melhorar a sensibilidade ao número de ciclos de amplificação pode ser aumentada, mas esta aumenta o risco de contaminação. Do mesmo modo, para melhorar a especificidade de amplificação pode ser feito em dois passos, embora isto também aumenta a contaminação e, por conseguinte, resultados positivos falsos.
Os três resultados falso-negativos poderia ser explicado por: 1) curto espaço de tempo entre a infecção materna e amniocentese, transmissão fetal ocorre após a amniocentese; 2) de armazenamento inadequada das amostras e degradação de ADN; 3) embora gene B1 é repetido 35 vezes no genoma do toxoplasma, a PCR foi realizada normalmente em 1 mL de fluido amniótico, o que poderá não ser representativa; 4) a presença de células, o DNA humano e, especialmente, no sangue pode interferir na reacção de PCR de 17 . Com o objetivo de excluir a inibição da PCR, que apresentou todas as amostras a uma extracção com fenol-clorofórmio; os resultados, no entanto, não foram diferentes (dados não mostrados).
Amniótico rato inoculação fluido deu 42,9% de sensibilidade e especificidade de 100%, os resultados mais baixos do que os obtidos por Foulon et al 8 (58% e 98%) e Gangneux et al 16 (52,9% e 100%). Rato inoculação é um bom teste, mas desde que é necessário para a infecção ratos, atraso na inoculação a presença de parasitas viáveis, problemas no armazenamento ou mesmo tratamento da mãe antes de amniocentese podeinterferir nos resultados.
PCR e inoculação em camundongos diferentes métodos que têm diferentes performances. Neste estudo, a combinação de ambos os testes melhorou ligeiramente sensibilidade (75%), passando de 62,5% para sozinho PCR e 42,9% para sozinho inoculação em camundongos.
Tomados em conjunto, os nossos resultados mostraram que o diagnóstico pré-natal negativa baseado em PCR sozinho nem sempre exclui a possibilidade de infecção congénita, bem como resultados positivos nem sempre confirmar. A avaliação clínica dos recém-nascidos durante o primeiro ano de vida é, obviamente, necessário. O diagnóstico final de toxoplasmose congênita deve ser baseada em dados clínicos, avaliação sorológica, PCR e inoculação em camundongos.
 
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1 . Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). 2 . Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da UFMG. 3 . Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte. 4 . Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. 
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas  UFMG (processo # 95/99). Endereço para: Prof.Geraldo Brasileiro Filho. Dept ° de Anatomia Patológica e Medicina Legal / FM / UFMG. Av. Alfredo Balena 190, 30310-100 Belo Horizonte, MG, Brasil. 
Tel: 55 31 3248-9632; Fax: 55 31 3248-9664 
e-mail: gbrasil@medicina.ufmg.br 
Recebido parágrafo Publicação em 23/2/2001.