Bibliotecas e Sequenciamento Genético

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Bibliotecas, sequenciamento e transformação 
genética
Instituto de Biologia
Departamento de Genética
Disciplina: Genética molecular
Profa. Marilene
marilene.ufrrj@gmail.com
• Fagos - partículas virais que invadem e destroem bactérias
• Na década de 40 
• "tesouras" moleculares, que a bactéria emprega para se defender dos 
bacteriófagos
• Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus 
invasores
Enzimas de restrição
• O fenômeno, conhecido como restrição controlada pelo hospedeiro, 
foi descrito pela primeira vez no início da década de 50. 
• Werner Arber, um microbiologista suíço, encontrou uma explicação 
molecular para o fenômeno. 
• Ele sugeriu que as bactérias controlam os fagos com um sistema de 
reações geneticamente controladas que ele designou restrição -
modificação.
• Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, 
geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases - palíndromas
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia coli 1º enzima a ser 
descoberta nesta 
bactéria
Gênero
Estirpe Espécie
Ordem de 
descoberta
Corte com Eco RI Corte com Eco RI
Fragmentos com 
Extremidades coesivas
vazio
vazio
Anelamento permite que moléculas de
DNA recombinante realizem um 
pareamento complementar.
As duas fitas não estão ligadas
covalentemente como pode ser visto 
nas 
áreas circuladas (vazio)
• Quando os bacteriófagos entram numa bactéria da linhagem A, são em 
sua maioria mortos no interior da bactéria, que corta (cliva) o DNA em um 
ou mais pontos. Os poucos fagos que se replicam no interior da bactéria, 
contudo, parecem "aprender" a evitar o ataque da bactéria e, numa 
segunda infecção, já produzem um grande número de partículas virais 
novas. Quando estes fagos procuram infectar uma bactéria da mesma 
espécie, porém de uma outra linhagem (digamos, B), inicialmente produz 
uma progênie pequena e apenas na segunda infecção na mesma linhagem 
bacteriana é que se adapta e produz um grande número de partículas virais 
novas. Se transportado a um tubo de ensaio com a bactéria A original, o 
fenômeno se repete, como se o fago tivesse "desaprendido" a infectar a 
bactéria do tipo A. 
Bibliotecas
• São coleções de sequências de DNA
• Genes recombinantes
• Utilização diversa
• Isolamento de um gene
• Sequenciamento
• Clonagem....
Biblioteca
Genômica
cDNA
Biblioteca genômica
• Coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie
• Fragmentos obtidos por meio da ação de enzimas de restrição, 
clonados e ligados a vetores
• Representa o genoma do organismo
Bibliotecas
Vetores
Vetores de clonagem molecular
• Pequenas moléculas de DNA
• são moléculas de DNA capazes de amplificar, 
em centenas de cópias, a informação 
genética que nelas foi inserida.
Biblioteca genômica
Plasmídeos
• DNA circular, bifilamentar extracromossômico; 
presente em microorganismos, principalmente 
bactérias; 
• De 1 a 200 kb de tamanho. 
• Acomodam fragmentos de até 30 mil pares de bases
Vetores
Vetores de clonagem molecular
Biblioteca genômica
YACs (Yeast Artificials Cromossomes) – acomodam de 300 mil a 1 milhão de pb
BAC (bacterial artificial chromosome ) - até 300 mil pb
Sítio de replicação
Resistência a 
ampicilina 1. Uma origem de 
replicação; 
2.Um gene marcador 
selecionável (em geral 
confere resistência a 
drogas); 
3.Sítio de clivagem única. 
Beta-lacmatase –
resistência a ampicilina
Lac Z – beta galoctosidade
Beta-lacmatase –
resistência a ampicilina
Lac Z – beta galoctosidade
• A enzima cliva também o composto 
Xgal em galactose e 5-bromo-4-
cloroindigo 
2. Fragmentos gerados enzimas de restrição
3. Fragmentos são ligados ao DNA 
4. Transfecção
Biblioteca genômica
1. Extração do DNA genômico total
2. Clivar o DNA do vetor 
5. Seleção das bactérias transformadas
• Como identificar os clones transformados?
• Células de E. coli, sensíveis a ampicilina, são transformadas com 
plasmídeos que conferem resistência ao antibiótico. Apenas as células 
transformadas serão capazes de crescer na presença de ampicilina.
• Os plasmídeos de clonagem têm uma segunda marca de resistência a 
antibióticos (em geral, tetraciclina), que é perdida quando o 
plasmídeo é aberto e o inserto é clonado. 
DNA recombinante
• Complementary DNA
• Construída pela cópia de um mRNA presente em um determinado 
tecido e possui apenas a informação funcional
Biblioteca cDNA
1. Extração do RNA total
2. Transcriptase reversa
3. Dupla hélice híbrida 3. RNase
4. Síntese cDNA
5. Transfecção, seleção de vetores transformados
• Método de Sanger, 1975
• Terminação por dideoxinucleotídeo
• Síntese de cópias parciais de DNA
• Terminação prematura ao acaso e em bases específicas
• Produção de fragmentos de diferentes tamanhos, terminado em cada 
uma das diferentes bases
Sequenciamento
Sequenciamento
• Dideoxinucleotídeo trifosfasto, ou ddNTP.
• dNTP, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato - apresenta uma hidroxila 
na posição 3´.
• ddNTP - não tem esta hidroxila. 
• Se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a incorporação de 
outros nucleotídeos a partir dele. 
• Marcar o ddNTP - radiação ou fluorescência,
• Logo, fita interrompida ficará radiativa ou fluorescente e poderá ser 
detectada mais facilmente. 
• Vamos admitir que cada didesoxibase está marcada com uma 
florescência diferente. 
• As fitas terminadas em A, T, G ou C vão emitir cores diferentes
quando excitadas com luz de um determinado comprimento (em
geral, de um feixe laser).
Sequenciamento
Como a reação de sequenciamento pode começar sempre
exatamente da mesma base?
• A partir do DNA molde que adicionamos à reação. 
• Uma nova fita simples só é sintetizada se tivermos:
• DNA molde,
• DNA polimerase, 
• dNTPs (e neste caso, um pouco de ddNTPs fluorescentes) 
• um primer
O primer sempre pareia exatamente na posição esperada, jamais uma base antes
ou uma depois.
Dessa forma, todas as fitas estendidas a partir deste primer iniciam rigorosamente
na mesma base, a partir do primer e copiando a fita molde.
Sequenciamento
• As fitas produzidas podem ser separadas pelo tamanho em 
eletroforese de poliacrilamida, e a base final da sequência da fita 
identificada pela fluorescência emitida quando a banda eletroforética
correspondente à fita cruza o ponto do gel que é iluminado por um 
feixe de laser.
• Neste sistema de detecção a eletroforese não pára, as bandas 
passando no fim (em baixo) do gel é que são detectadas em 
movimento. Com isto, podemos identificar com precisão 600 a 700 
bases a partir do primer.
Sequenciamento
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGT
ATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGG
GTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCT
GGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGT
TCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNA
CCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCC
CACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCG
GCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAG
GGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAG
GGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGAC
ACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNA
CANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANC
CCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNN
CCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNN
NNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNN
NNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN
Formato de saída – SEQ
Transformação genética
1. Clonagem e isolamento do gene
• Identificar o gene responsável
• Desenvolver bibliotecas genômicas• Sondas apropriadas para reconhecer o gene
Transformação mediada por Agrobacterium
• Início do séc. XIX
• Agrobacterium tumefasciens
• Plasmídeo Ti
• Causa galha
• Infecta cerca de 600 espécies vegetais
• Plasmídeo Ti
• 200kb
• Genes ligados a transferência e integração desse plasmídeo
• Capaz de introduzir parte do seu genoma na planta hospedeira
• T-DNA
• Bordas 25pb
• Opinas e genes indutores de tumor
Transformação mediada por 
Agrobacterium
• Sendo assim, qualquer sequênia que for colocada nessa região será 
transferida junto com o plasmídeoc
• Região de virulência 
Transformação mediada por 
Agrobacterium
Etapas básicas
• Obtenção do plasmídeo Ti desarmado
• Gene de interesse e um gene marcador
• Resistência a antibiótico
Transformação mediada por 
Agrobacterium
• Ferimento do tecido 
• A bactéria penetra na célula
• Expressão dos genes de vir
• O T-DNA começa a ser preparado
• As bordas 25pb são reconhecidas- VirD1/D2 e clivadas
• T-DNA em associação com proteínas é exportado
• Direcionado para o núcleo VirD2 e VirE2
• Se integra ao genoma da planta
n
Biobalistica
• John Sanforf, 1987
• Aceleração de micropartículas
• Ouro ou tungstênio
• Atravessam a parede celular e a membrana plasmática, carreando o 
DNA para o interior do célula
• As partículas de outro com 
o DNA de interesse
• Complexo partícula-DNA 
acelerado sob vácuo 
atingindo o tecido alvo
• 1.500 km/h
• Regeneração
• Gene marcadores
• Gene hpt – antibiótico higromicina
• Gene aro A- resistência herbicida glifosato
• Genes repórteres
• Gene gus – precipitado azul
• Gene luc – produz luz verde-amarelada