Métodos de Identificação de Microrganismos

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Métodos para classificação e identificação de microrganismos
Os microrganismos são identificados com propósitos práticos, por exemplo, para
determinar um tratamento apropriado para uma infecção. A maioria dos procedimentos de
identificação é facilmente realizada em laboratório e utiliza o menor número possível de
testes. 
A classificação de microrganismos é um esquema de agrupamento de organismos
de acordo com as características similares. O sistema de classificação mais amplamente
aceito atualmente é o sistema de três domínios proposto por Carl Woese em 1977 que
agrupa os organismos nos domínios Bacteria, Archaea e Eukarya e que baseia-se em
análises filogenéticas, principalmente relacionadas à similaridade na sequência do RNA
ribossomal 16S (procariotos) e 18S (eucariotos) como cronômetro evolutivo.
Os métodos usados na identificação e/ou classificação podem ser divididos nos de
taxonomia clássica quando baseados em avaliação de caracterśticas fenotípicas e
aqueles de taxonomia molecular quando estudam-se moléculas.
Taxonomia clássica:
1. Características morfológicas (estruturais)
A observação de características morfológicas são utilizadas para a identificação de
procariotos, bactérias e archaeas, mas são muito importantes na classificação de
microrganismos eucariotos, como protozoários, algas e fungos.
Em bactérias, por exemplo, características como forma e arranjo celulares, a
presença de flagelo ou de cápsula e a capacidade de formação de endosporos são
importantes características morofológicas usadas para a identificação.
2. Coloração diferencial
A resposta à coloração diferencial de Gram ou de Ziehl-Neelsen é uma
característica usada tanto na identificação como na classificação de bactérias. A
importância na classificação explica-se porque alguns filos de bactérias são Gram
positivos, enquanto outros filos são exclusivamente de bactérias Gram negativas.
Diferentemente de aspectos morfológicos que estão espalhados em diferentes grupos
taxonômicos.
3. Características metabólicas
As capacidades metabólicas são investigadas pela realização de diversos testes
bioquímicos que visam detectar a capacidade de utilização de certos substratos, a
produção de determinados metabólitos e a presença de determinadas enzimas. Os testes
bioquímicos são muito usados na identificação de bactérias e leveduras. 
As várias provas bioquímicas podem ser realizadas por meio de kits miniaturizados
disponíveis comercialmente com o Enterotube e API. 
4. Características antigênicas
Os testes baseados na reação antígeno-anticorpo são denominados testes
sorológicos ou sorologia. Os microrganismos, em especial, os patogênicos apresentam
várias estruturas antigênicas, como porções da parede celular, flagelos e cápsula, que
podem estimular a produção de anticorpos específicos por animais. Os testes sorológicos
se baseiam na especificidade da reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac). Assim,
microrganismos podem ser identificados em uma amostra quando a reação Ag-Ac é
detectada por diferentes técnicas que variam desde testes simples de aglutinação em
lâmina como técnicas mais sofisticadas tais como ELISA e Western blotting.
Os testes sorológicos podem também diferenciar sorovares numa mesma espécie
bacteriana o que faz parte da classificação de algumas espécies patogênicas importantes
como Salmonella, Shigella, Escherichia coli, dentre outras.
Teste de Aglutinação em lâmina Técnica de Western Blotting
5. Fagotipagem
A identificação de bactérias pode também incluir a avaliação da susceptibilidade da
bactéria a diferentes bacteriófagos. Neste método, a bactéria é exposta a diferentes
suspensões de fagos que sendo capazes de infectar a bactéria provocam a lise celular
que é observada pela formação de placas de lise. A determinação do fagotipo é
especialmente importante do ponto de vista epidemiológico para o caso de bactérias
patogências.
Taxonomia molecular:
1. Perfil de ácidos graxos
A avaliação dos ácidos graxos presentes na membrana citoplasmática de uma
cultura microbiana pode ser utilizada para a identificação microbiana por meio de
cromatografia gasosa. Este método permite separar identificar e quantificar os ácidos
graxos, assim cada espécie microbiana apresenta um perfil de ácidos graxos
característico que quando comparado a um banco de dados de diferentes espécies de
referência possibilita a identificação da cultura.
 - Cada pico representa um ácido 
graxo diferente (tempo de retenção);
- A área do pico indica a quantidade 
do ácido graxo 
- Compara-se o cromatograma 
obtido com um banco de dados
Tempo de retenção
Quantidade
2. Sequenciamento de proteínas
A análise da sequência de resíduos de aminoácidos em determinada proteína entre
diferentes organismos permitem a classificação. As proteínas neste caso funcionam como
cronômetros evolutivos como, por exemplo, citocromos, proteínas de ferro-enxofre
presentes na cadeia transportadora de elétrons. Após o sequenciamento, compara-se a
similaridade das sequências e os dados gerados permitem a construção de cladogramas.
Cladograma é uma ferramenta usada para a apresentação do agrupamento dos
organismos estudados indicando a divergência filogenética.
3. Fingerprinting de DNA
Os metodos baseados na análise de ácidos nucleicos revelam características
genotípicas como o Fingerprinting de DNA, a reação da poimerase em cadeia (PCR)
seguida do sequenciamento e a hibridização.
O método de Fingerprinting de DNA consiste na extração do DNA de uma cultura
microbiana que é tratada com uma enzima de restrição o que resulta em um conjunto de
fragmentos de restrição de diferentes tamanhos que são separados por eletroforese. A
comparação do número e do tamanho dos fragmentos de DNA gerados pelos diferentes
organismos com organismos de referência permite a identificação.
4. PCR e sequenciamento do DNA
A reação de PCR permite gerar várias cópias de uma determinada região do DNA.
A amplificação de uma região do DNA de interesse baseia-se na separação da dupla fita
de DNA por desnaturação térmica, seguida da adição de primers, pequenos
oligonucleotídeos flaqueadores da região do DNA de interesse. Posteriormente, adiciona-
se a DNA polimerase (Taq polimerase) que permite a extensão a partir dos primers
formando duas cópias do DNA de interesse. Ciclos de amplificação são repetidos várias
vezes e o DNA amplificado é, então, separado em eletroforece e sequenciado e baseado
na porcentagem de similaridade na sequência do DNA de diferentes organismos propõe-
se o agrupamento, isto é, permite a classificação destes organismos.
O método de PCR e sequenciamento pode ser utilizado para a identificação
quando se utiliza as chamadas sequências-assinaturas que são determinadas sequências
que ocorrem em determinado taxon e a detecção destas sequências-assinatura em
determinada amostra permite a identificação do taxon na amostra. Estas sequências-
assinatura podem ser referentes aos diferentes domínios ou a uma família específica ou
até mesmo a uma espécie em particular. Esta técnica permite, inclusive, a determinação
de determinado(s) taxon(taxa) em uma amostra natural sem o cultivo de nenhum dos
organismos presentes, somente a partir da extração de DNA da amostra. 
A ribotipagem atualmente é utilizada para determinar as relações filogenéticas
entre os organismos e consiste no PCR seguida do sequenciamento do DNA
correspondente ao RNA ribossômico.
5. Hibridização de ácidos nucleicos
A hibridização do DNA permite classificar ou identificar organismos. Esta técnica
baseia-se na separação dadupla fita do DNA pelo calor de diferentes organismos que irão
se unir novamente (hibridizar) de acordo com a similaridade na sequência devido ao
pareamento de bases, timina com adenina e guanina com citosina. O método mede a
habilidade das fitas de DNA de um organismo em hibridizar (ligar-se por pareamento de
bases complementares) com as fitas de DNA de outro organismo. Quanto maior o grau de
hibridização, maior o grau de parentesco. Esta abordagem resulta na classificação dos
organismos baseada na taxa de hibridização.
A técnica de hibridização do DNA também possibilita a identificação pelo uso de
sondas de DNA. Sonda de DNA é uma fita simples de DNA específica de determinado
taxon marcada. A marcação da sonda pode ser com radioatvidade ou por fluorescência.
Assim a identificação de um organismo em uma amostra ocorrerá pela extração do DNA,
separação da dupla fita e a hibridização com a sonda. A constatação da hibridização da
amostra com a sonda revelada pela radioatvidade ou fluorescência resulta na
identificação da cultura microbiana como ilustrado a seguir para identificação da bactéria
Salmonella. 
Considerações finais
As características morfológicas, as colorações diferenciais e os testes bioquímicos
eram as únicas ferramentas de identificação disponíveis até pouco tempo atrás. Avanços
tecnológicos estão tornando possível a utilização das técnicas de análise de ácidos
nucleicos, antes reservadas para a classificação, como rotina para a identificação.
Na identificação de organismos são comumente utilizadas as chaves dicotômicas.
Em uma chave dicotômica, a identificação tem como base perguntas sucessivas, e a cada
pergunta tem duas respostas possíveis. Após responder uma das questões, o pesuisador
é direcionado a outra questão até que o organismo seja identificado. Por exemplo, na
identficação de bactérias, a chave dicotômica poderia começar com determinação da form
da célula (bacilo ou cocos), resposta à coloração de Gram (gram positiva ou gram
negativa) e ir para a capacidade de fermentação de um açúcar e outros testes bioquímcos
até a identficação no nível de gênero ou espécie.
A classificação utiliza-se da ferramenta da construção de cladogramas.
Cladogramas são mapas que mostram as relações evolutivas entre os organismos. Cada
bifurcação do rao é definida por uma característica compartilhada por várias espécies
daquele ramo. Os cladogramas de vertebrados são feitos utilizando evidências de
registros fósseis. No entanto, a maioria dos microrganismos não deixou fósseis, portanto,
utiliza-se o sequenciamento do rRNA para montar cladogramas. Os ramos hoizontais de
cladogramas sãoo desenhados em um comprimento proporcional à porcentagem de
similardade calculada. Todas as espécies além da ramificação (bifurcação) têm
sequências de rRNA similares, sugerindo que são provenientes de um ancestral
posiionado nesta ramificação.