Aula 6 - Imunologia Clínica - Técnica & Aplicações

Prévia do material em texto

INSTRUMENTAÇÃO 
BIOMÉDICA 
Imunologia Clínica – Técnicas & 
Aplicações 
Prof. Jannison Ribeiro 
 Definir os princípios dos exames 
imunológicos; 
 
 Principais tecnologias envolvidas 
nos exames Imunológicos. 
Imunologia no laboratório clínico 
• Ensaios baseados em princípios imunológicos 
são utilizados em praticamente TODOS os 
departamentos do laboratório clínico. 
Hematopoiese 
Plasmócitos – Produção Anticorpos 
• Precursor dos Linfócitos B; 
• Células responsáveis pela imunidade 
adquirida Humoral  Produção de Anticorpos 
Característica dos Anticorpos 
• Reconhecimento; 
• Especificidade; 
• Ativam vias 
complemento; 
• Auxiliam na 
fagocitose. 
Imunologia no laboratório clínico 
• Auxiliar no diagnóstico de doenças 
infecciosas pela detecção de 
anticorpos séricos contra bactérias, 
vírus e parasitas; 
 
• Detectar ou identificar 
microrganismos utilizando 
anticorpos comerciais; 
 
• Detectar substâncias como drogas 
ou hormônios, utilizando reações 
de antígeno – anticorpo; 
 
Imunologia no laboratório clínico 
• Tipagem de sangue e tecidos; 
• Identificar/diferenciar 
marcadores e tipos celulares; 
• Avaliar a função imunológica em 
casos de resposta perante 
infecções (Doença & Vacinação) 
Principais testes com antígeno-anticorpo 
• Testes de aglutinação; 
• Testes de precipitação; 
• Testes com nefelômetro; 
• Testes de fixação de 
complemento 
• Testes de anticorpo 
fluorescentes (AF) 
 
 
Principais testes com antígeno-anticorpo 
• Imunoensaio Enzimático 
(EIAs) 
• Imunoensaios 
Cromatográficos 
• Radioimunoensaios (RIAs) 
• Técnicas de citometria de 
fluxo 
 
 
• As reações de aglutinação decorrem da ligação entre o Ac e Ag 
particulado. 
• É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac, que 
se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. 
 
• Agregação visível de partículas 
 
Eritrócitos 
Bactérias 
Fungos 
Látex 
o Fatores que influenciam a 
formação dos agregados 
• Classe do anticorpo 
envolvido. 
• Concentração iônica e pH do 
meio. 
• Tempo e temperatura. 
• Concentração ótima de 
antígeno ou Ac a ser fixado 
nas micropartículas ou 
células. 
 
o Vantagens: 
 • Baixo Đusto. 
 • Boa espeĐifiĐidade. 
 • Leitura visual. 
 • FaĐilidade de exeĐução. 
 
o Desvantagens: 
 • Baixa sensibilidade. 
 • Reprodutiďilidade dos lotes de reageŶtes. 
 • AĐessiďilidade ŵoleĐular para iŶteração Ag-Ac. 
 • Estaďilidade da ligação do Ag/AĐ Ŷo suporte. 
 
• Neste teste, o antígeno faz parte naturalmente da célula, e 
haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpo 
contra esses antígenos (antígeno é naturalmente insolúvel). 
Ex: Identificação de antígenos eritrocitários na tipagem 
sanguínea, reação de Widal (febre tifóide - Salmonella typhi). 
• Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas 
insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. 
• Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados 
diretamente por anticorpo. 
• Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados 
empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma 
quantidade constante de antígeno (a máxima diluição em que 
ocorre a aglutinação). 
1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 
• Tipagem ABO • VDRL - Venereal Disease 
Research Laboratory (Sífilis) 
 - Causas de falso positivo: 
• Gravidez; 
• Coinfecção pelo HIV (10x ↑????) 
• Uso de drogas endovenosas; 
• Tuberculose; 
• Infecção por ricketsia; 
• Infecção por outras espiroquetas; 
• Endocardite bacteriana; 
• Alterações da produção de Ig. 
HIV - 
VDRL 
 reagente e < 1/32 
FTA-abs 
positivo 
Tratamento 
FTA-abs 
negativo 
VDRL falso 
positivo, se 
títulos1/1 e 1/2 
VDRL 
não reagente 
Nova testagem em 30 dias, 
se epidemiologia 
VDRL FTA-ABS SÍFILIS 
+ + + 
+ - - 
- + Inicial/Curada 
- - - 
• Esse método emprega a adsorção de anticorpos ou antígenos protéicos 
solúveis na superfície de micropartículas inertes (suporte). 
• Para o teste, as hemácias e as partículas inertes (látex, leveduras, etc.) 
podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto 
com os antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos. 
• Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células 
ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito 
variada. 
+ 
• Teste de gravidez 
Positivo não aglutina, pois os Ac 
se ligaram ao hCG da urina na 
incubação 
+ Urina Soro anti hCG 
POSITIVO NEGATIVO 
+ Soro anti hCG Urina 
Incubados e 
colocados em 
placa 
Particulas 
revestidas 
com hCG 
Ac 
hCG 
+ + 
Incubados e 
colocados em 
placa 
Ac 
Negativo aglutina 
• Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs). 
• Doença Hemolítica do Recém Nato – mãe produz IgG anti-Rh (DHRN) 
• Não aglutinam os eritrócitos. 
• Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais. 
• Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. 
• Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN (Terapia), 
anemias hemolíticas autoimunes. 
TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento 
em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. 
Brasilia, Junho de 2008. 
 
• Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos 
em fluidos corporais; 
 
• A formação do complexo ag/ac e sua precipitação permite a 
visualização do teste; 
 
• Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido, 
interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que 
indica a presença do anticorpo no soro. 
 
S 
S 
o Elementos necessários para a realização: 
 
Placas Imunodifusão 
Placa de Petri 
Cuba de eletroforese horizontal 
o Vantagens 
• É um método de fácil execução; 
• Não necessita de aparato sofisticado; 
• Teste com boa especificidade (característica que indica que o teste em 
questão identificará somente o ag ou ac desejado) – menor risco de 
falsos-positivos; 
• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo; 
• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em 
comparação com outras técnicas. 
o Desvantagens 
• O tempo de incubação pode ir de 24 h até 72 h (Boa visualização); 
• É um teste que apresenta alguns problemas com a reprodutibilidade, 
• Difícil peservação do gel; 
• Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas (IgM); 
1) A placa se encontra cheia de 
gel impregnado com um 
anticorpo específico, 
2) Coloca-se os controles 
positivos e as amostras a serem 
testadas nos poços perfurados 
no gel, 
3) Incuba-se a placa por 48 
horas, 
4) Os halos (zona de 
equivalência) formados em 
tono dos poços são medidos, 
o Interpretação dos resultados: 
• Durante a incubação ocorre a difusão do 
antígeno na agarose e a formação de 
complexos ag-ac., 
• Os complexos precipitam e formam um 
halo ao redor do orifício, 
• Existe uma relação linear entre o 
quadrado do diâmetro do halo (d2) e a 
concentração do antígeno, 
 
 
 
http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg 
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de 
Apoio Didático – UCG –Go. 
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –
Go. 
1) O gel de agarose ou agar é 
preparado e colocado na 
placa, 
2) Após a solidificação do gel, 
poços são perfurados com um 
molde (perfurador ou roseta), 
3) adiciona-se antígeno e a 
amostra a ser testada nos 
poços perfurados, 
4) Incuba-se a placa por 48 
horas.5) Os complexos ac/ag se 
formam e precipitam 
formando linhas de 
precipitação que indicam o 
resultado. 
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go. 
 
o Interpretação dos resultados: 
• A formação e localização da banda de precipitação indicam a presença de ac bem 
como sua concentração em relação ao ag; 
• Quanto mais perto do ag maior a concentração de ac na amostra . 
• O teste de fixação do complemento (FC) é um método sorológico usado 
para determinar a presença ou semi-quantificar anticorpos (Ac) ou 
antígenos (Ag) (Inibição da Fixação do Complemento) em uma amostra, 
utilizando a ação do Sistema do Complemento. 
• O complexo Ag-Ac: Quando moléculas de anticorpos ligam-se ao antígeno, 
os sítios ativos da região Fc tornam-se disponíveis para a ligação do 
complemento. 
• Anticorpo aderido a membrana  rompimento e lesão na membrana 
celular! 
FC C1 
FC 
C2a/C4b 
Soro do Paciente com 
Anticorpos Reativos 
para o Teste 
Adiciona-se o Ag; 
Formação 
Complexo Ag/Ac 
Complemento liga-
se aos anticorpos 
(Ag/Ac/Comp.) 
Adiciona-se Hemácias 
com o Ag inespecífico 
aderido a membrana 
Não há 
hemólise! 
Reação Positiva 
Soro do Paciente sem 
Anticorpos Reativos 
para o Teste 
Adiciona-se o Ag; 
Antígeno Livre 
Sistema Complemento 
livre na solução (Não foi 
consumido) 
Adiciona-se Hemácias 
com o Ag inespecífico 
aderido a membrana 
Ativação Complemento. 
Ocorre Hemólise. 
Reação Negativa! 
Resultado Positivo 
(Existe Ac contra Ag pesquisado) 
Resultado Negativo (Não existe 
Ac contra Ag pesquisado) 
o VANTAGENS: 
• Baixo custo. 
• Boa especificidade. 
• Boa sensibilidade. 
• Boa visualização. 
 
o DESVANTAGENS: 
• Probabilidades para falso-negativos devido a: 
• Perda da atividade do complemento. 
• Sensibilização insuficiente de hemácias. 
• Probabilidades para falso-positivos devido a: 
• Hemácias fragilizadas (velhas). 
• Baixa especificidade (dependendo do antígeno 
adsorvido na hemácia). 
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 
ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de 
anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é usado 
no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de 
imunoglobulinas. 
APLICAÇÕES 
• Doenças infecciosas (HIV, Hepatites…); 
• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...); 
• Identificação de antígenos (hormônio da gravides, alergia a drogas...); 
• Doenças auto-imunes; 
• Concentração sérica de anticorpos. 
• Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) 
específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura. 
• Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma 
reação enzimática; 
• Uma enzima reage com um substrato o qual então desenvolverá coloração 
dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados. 
Vantagens 
• Teste com alta sensibilidade (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – 
menor risco de falsos-negativos; 
• Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão 
identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos; 
• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo; 
• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com 
outras técnicas de imunodiagnóstico. 
Desvantagens 
• Necessidade de mão de obra especializada; 
• Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a 
elevadas temperaturas. 
• Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de 
pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes. 
• ELISA Direto  Detecta o Antígeno; 
 
• ELISA Indireto  Detecta o Anticorpo; 
 
• ELISA Competição  Detecta Ag com baixo peso molecular 
(monovalentes) – Quantitativo; 
 
• ELISA Captura  Detecção de Acs IgM/IgG, infecção 
primária/secundária (Testes rápidos) 
 
• Os testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. São testes de 
triagem, portanto de elevada sensibilidade, e consequentemente elevado custo. 
• A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e após a migração por 
cromatografia a formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante 
coloidal na linha de captura. 
Amostra 
ANTICORPOS 
CONJUGADOS 
 COM NANOPARTÍCULAS 
Fluxo na fita teste 
ANTICORPOS P/ 
ANTÍGENO 
ESPECÍFICO 
ANTICORPOS ANTI 
IgG/IgM (INESPECÍFICOS 
P/ ANTÍGENO) 
• A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e 
tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a 
localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência. 
• De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos 
biológicos usando seu antígeno correspondente. 
• Método de alta sensibilidade e alta especificidade. 
• Diferetemente do ELISA, utiliza-se anticorpos conjugados com Fluorocromos e não à 
enzimas! 
 
o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA 
• A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência 
ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto 
comprimento de onda (UV); 
• Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros 
apropriados dependendo da cor do fluorocromo. 
 
o VANTAGENS 
• Sensibilidade; 
• Especificidade; 
• Reprodutibilidade; 
• De simples padronização e execução; 
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes. 
 
o DESVANTAGENS 
• Necessidade de microscópio de fluorescência; 
• Subjetividade na leitura; 
• Não-automação; 
• Custo elevado $$$$. 
DIRETA 
INDIRETA 
Detecção de Ag 
• O anticorpo específico marcado 
com Fluorocromo (conjugado) é 
adicionado e se fixa ao antígeno, 
formando um imunocomplexo 
estável. 
• O anticorpo não ligado é 
removido por lavagens. 
• O preparado é observado em 
microscópio de fluorescência. 
Y Y 
Y 
Y 
Y 
Y 
Y 
Antígeno pesquisado 
Conjugado 
Y Y Y 
Y 
Y 
Y 
Y Y Y Y 
Antígeno padronizado 
Conjugado 
Anticorpo pesquisado 
Y 
Y 
• Antígenos padronizados são fixados 
a lâminas de vidro. 
PARA A PESQUISA DE 
ANTICORPOS/ANTÍGENOS 
• Realizam-se lavagens para a retirada 
dos anticorpos não ligados. 
• O soro do paciente é diluído, 
colocado sobre o antígeno e 
incubado para permitir a formação 
do complexo antígeno-anticorpo. 
• A preparação é incubada com o 
conjugado fluorescente e, se houver 
anticorpo no soro, o conjugado 
reage com o anticorpo específico 
para o antígeno. 
 • Observa-se o preparado em 
microscópio de fluorescência. 
 
• Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar 
partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. 
• Através de um aparelho de detecção 
óptico-eletrônico são possíveis análises 
de características físicas e/ou químicas 
de uma simples célula. 
• Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente: 
 Volume e complexidade celular (presença grânulos citoplasmáticos); 
 DNA/RNA (Fases divisão celular, apoptose); 
 Classificação cromossomos; 
 Proteínas e antígenos de superfície ( Marcadores CD); 
 Antígenos intracelulares (Citocinas e mediadores) e fármacos. 
Células variadas 
 fontes 
Adição de Ac 
marcados 
Resultados 
• Aplicações: 
Quantificação Hemácias, Plaquetas e 
leucócitos, diagnóstico e terapêutica de 
distúrbios hematológicos; 
Quantidade DNA celular, detecção de mutações de 
mau prognóstico, diferenciação de células imaturas; 
Uso de marcadorespara tipos celulares distintos, 
dosagem citocinas, toxinas e hormônios, detecção e 
quantificação de microorganismos. 
Prof. Jannison Ribeiro 
INSTRUMENTAÇÃO 
BIOMÉDICA 
Imunologia Clínica – Técnicas & 
Aplicações