Hemoglobina glicada

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HEMOGLOBINA GLICADA
INDICAÇÃO MÉDICA DO EXAME
A determinação da hemoglobina glicada em amostras de sangue é útil no controle do diabetes.
PRINCÍPIO
A resina de troca iônica, carregada negativamente, exibe uma afinidade para molécula com carga positiva. Em força iônica e pH selecionados, a hemoglobina glicada (Hb-G) tem carga positiva menor que a hemoglobina A e se liga mais fracamente à resina. A aplicação do tampão Hb-Rápida (nº 1) promove a eluição da hemoglobina glicada, ficando as outras hemoglobinas retidas na resina.
A medida espectrofotométrica do eluato (Hb-G) e da hemoglobina total (Hg-total) permite o cálculo da percentagem de Hb-G na amostra.
AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Tipos de amostra
Usar sangue total colhido com EDTA. Pode-se obter resultado falsamente elevado quando a amostra é colhida em heparina.
Armazenamento e estabilidade da amostra
O analito é estável no sangue total por 5 dias entre 2 – 8 ºC. 
Volume mínimo
(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise)
Volume ideal
(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise)
Fazer referência ao manual ou POP de colheita, separação e distribuição de material.
PRODUTO UTILIZADO
Hemoglobina Glicada, Catálogo 17		ANVISA - 10009010016
Labtest Diagnóstica
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600
Lagoa Santa, MG, 33400-000
Tampão Hb-Rápida: Armazenar entre 15 – 25 ºC.
Contém tampão fosfato 36 mmol/L pH 6,7 e biocida não tóxico.
Hemolisante: Armazenar entre 15 – 25 ºC.
Contém íons borato e azida sódica 14,6 mmol/L.
Colunas para cromatografia: Armazenar entre 15 – 25 ºC.
Contém resina de troca iônica equilibrada com tampão fosfato pH 6,7.
Precauções e cuidados especiais
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. O laboratório deve estabelecer a estabilidade em suas condições operacionais.
O hemolisante contêm azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os olhos, lavá-los imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança.
Não misturar reagentes de lotes diferentes.
EQUIPAMENTOS 
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 415 nm ou filtro azul (405 a 430).
Pipetas para medir amostras e reagentes. 
Termômetro.
CONTROLE DA QUALIDADE
Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, número de catálogo), instruções de preparo e frequência da utilização dos mesmos.
Limites de tolerância
Descrever o procedimento para definição dos limites de tolerância, o sistema adotado para utilização do mapa de Levey-Jennings e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante de valores que ultrapassem tais limites. Fazer referência ao manual ou POP para utilização dos materiais de controle.
Verificação de novo lote de controles e/ou reagentes
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e de reagentes.
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle da qualidade são arquivados e gerenciados.
Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.
PROCEDIMENTO
Minimização da ação de interferentes
Este procedimento deve ser aplicado somente quando a amostra estiver turva, lipêmica ou ictérica.
Pipetar em um tubo 1,0 mL da amostra bem homogeneizada. Marcar o nível de 1,0 mL no tubo.
Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender as hemácias.
Adicionar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%). Centrifugar. Acertar o volume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso do sobrenadante.
Homogeneizar bem e utilizar para preparar o hemolisado.
Preparo do hemolisado
Em um tubo 12 x 75 adicionar 0,4 mL de hemolisante (nº 2) e 0,1 mL da amostra. Agitar fortemente por 20 segundos e esperar 5 minutos. Se a hemólise for incompleta (o líquido no tubo se mostra turvo), centrifugar e usar o sobrenadante. Antes de iniciar a cromatografia, assegurar-se de que o hemolisado, o tampão e as colunas tenham a mesma temperatura ambiente. Nunca realizar a cromatografia se o hemolisado, tampão e coluna tiverem temperaturas diferentes do ambiente no qual se realizará a cromatografia.
Preparo da coluna
A presença de bolhas de ar no filtro ou na resina interfere na drenagem do tampão, aumentando o tempo de eluição da hemoglobina glicada.
Retirar a tampa superior da coluna, introduzir o bastão fazendo movimentos giratórios descendentes a ascendentes para ressuspender a resina. Remover imediatamente a tampa inferior, colocar a coluna em um tubo de ensaio e esperar que todo o líquido penetre na resina. A partir daí, a coluna estará pronta para uso e a cromatografia deverá ser iniciada imediatamente. Jamais iniciar a cromatografia em temperatura inferior a 16 ºC ou superior a 30 ºC.
Medir a temperatura do líquido que drenou da coluna para correção do resultado.
Cromatografia
Adicionar 0,05 mL do hemolisado sobre a resina, de modo que não haja ressuspensão da mesma, evitando a formação de bolhas de ar. Esperar que o hemolisado penetre na resina.
Transferir a coluna para um tubo de ensaio limpo e seco, marcado com o número 1 e adicionar lentamente, com a ponta da pipeta tocando a parede da coluna, 3,5 mL de Tampão Hb-Rápida (nº 1). A eluição da Hb-G se completa quando todo o tampão penetra na resina.
Desprezar a coluna.
Colorimetria
Homogeneizar o conteúdo do tubo número 1 (Hb-G) e usá-lo para a colorimetria sem qualquer tratamento adicional.
Para um tubo limpo e seco, marcado com o número 2 (Hb-total) pipetar 7,0 mL de água destilada, adicionar 0,02 mL do hemolisado e misturar.
Determinar as absorbâncias dos tubos número 1 (Hb-G) e número 2 (Hb.total) em 415 nm ou filtro azul (405 a 430 nm) acertando o zero com água destilada.
A cor é estável por 4 horas.
Precauções e cuidados especiais
Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas estabelecidas de segurança. Fazer referência ao manual ou POP de segurança.
A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. Fazer referência ao manual ou POP de limpeza e verificação da qualidade da limpeza dos materiais.
A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e usar nas medições, deve ter resistividade (1 megaohm ou condutividade (1 microsiemens e concentração de silicatos (0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água pode ser do tipo III, com resistividade (0,1 megaohms ou condutividade (10 microsiemens. No enxágüe final utilizar água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Fazer referência ao manual ou POP de água reagente.
CÁLCULOS
Ver linearidade.
 A1			A1
Hemoglobina Glicada (%) = 	 x 100	ou 	 	x 20		
 5 x A2			A2
A1 = Absorbância do tubonúmero 1 (Hb-G)
A2 = Absorbância do tubo número 2 (Hb-Total)
Efeito da temperatura
A cromatografia deve ser realizada a 22 °C. Se for realizada em temperatura diferente, corrigir o resultado para a temperatura de 22 °C, multiplicando-se o resultado encontrado pelo fator de correção correspondente à temperatura de trabalho.
	Temperatura de trabalho (ºC)
	Fator de correção
	16
	1,16
	17
	1,13
	18
	1,10
	19
	1,08
	20
	1,05
	21
	1,03
	22
	1,00
	23
	0,98
	24
	0,95
	25
	0,93
	26
	0,90
	27
	0,88
	28
	0,86
	29
	0,84
	30
	0,82
RESULTADOS
Unidade de medida
%
Valores de referência
Hemoglobina Glicada: 5,3 a 8,0%
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Linearidade
O sistema é linear até 30%. Valor superior a 30% não foi relatado na literatura.
Interferências
1- Em amostras lipêmicas ou ictéricas obtêm-se resultados falsamente elevados. 
2- A presença de hemoglobina F na amostra leva à obtenção de resultados falsamente elevados, enquanto a presença das hemoglobinas S e C produzem resultados falsamente diminuídos. A anemia ferropriva produz resultados falsamente elevados. Em todas as condições onde a meia-vida das hemácias está modificada, podem ocorrer alterações nos valores da hemoglobina glicada.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Um número importante de trabalhos confirma a utilidade da determinação da Hb-G na avaliação do estado de controle da glicemia em pacientes diabéticos e está definitivamente provado que a elevação da Hb-G é influenciado somente por fatores ligados ao diabetes. Portanto, a Hb-G se eleva com a deterioração da tolerância à glicose e com todos os fatores de risco como idade, obesidade, história familiar e história de recém nascido de grande peso.
O grau de glicosilação é diretamente proporcional ao valor da glicemia e sua duração varia também de paciente a paciente. Pequenas elevações dos valores da glicose em reduzidos intervalos de tempo não são capazes de produzir modificações significativas na Hb-G.
Quando pacientes diabéticos em estado de descontrole são submetidos ao tratamento e passam a apresentar valores da glicemia em níveis ótimos, observa-se redução progressiva da Hb-G que atinge o ponto de equilíbrio depois de 6 – 8 semanas. Assim, o conceito de que uma determinação de Hb-G reflete os níveis glicêmicos da sexta ou oitava semana precedente ao teste está definitivamente comprovado.
Um resultado de Hb-G próximo ao valor superior referente indica que o paciente diabético tem estado sob controle metabólico adequado por várias semanas e exclui uma perda temporária do controle durante o período avaliado. Os estudos da cinética da glicosilação da hemoglobina têm demonstrado que quando há perda do controle glicêmico os valores da Hb-G começam a se elevar logo na primeira semana de descontrole e a velocidade do aumento é muito maior que a velocidade de queda quando um paciente diabético é colocado em níveis desejáveis de glicemia. Portanto, um resultado elevado de Hb-G pode ocorrer na presença de um controle metabólico adequado quando a Hb-G ainda não atingiu o novo ponto de equilíbrio.
Estudos recentes do DCCT (Diabetes Control and Clinical Trial) demonstram que a morbidade ou mortalidade do diabetes estão diminuídos quando ocorre um controle adequado da glicemia e que a dosagem de Hb-G é muito importante para informar o estado de controle da glicemia.
Existem muitas dúvidas sobre os níveis de controle metabólico adequado relacionados aos valores de Hb-G. É bastante razoável admitir que os valores da Hb-G em diabéticos bem controlados devem estar o mais próximo possível dos valores de referência. Entretanto, as tentativas de se obter estes valores esbarram em uma complicação bastante grave: a hipoglicemia. A tabela abaixo mostra um sumário de alguns dos valores alvo recomendados. Os níveis metabólicos alvo foram definidos como ótimos, aceitáveis e comprometidos, e os valores da Hb-G são expressos em termos percentuais do limite superior de referência do método (LSR). Assim, em um método com LSR igual a 8,0%, um diabético com níveis ótimos de controle metabólico terá resultados de Hb-G menores que 8,8%, enquanto um valor maior que 11,2% significa estado metabólico comprometido.
REFERÊNCIAS 
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Daneman D. The Endocrinologist 1994; 4: 33-43.
Gabbay KH et al. J Cli Endocrinol Metab 1977; 44: 859-864.
Koenig RJ et al. Diabetes 1976; 25: 230-232.
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Paulsen EP. Metabolism 1973; 22: 269-271.
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Schellekens APM et al. Clin Chem 1981; 27: 94-99.
Schnek AG and Schroeder WA. J Am Chem Soc 1961; 83: 1472-1478.
Trivelli LA, Ranney HÁ, Lai HT. New Engl J Med 1971; 284: 353-357.
Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
Hemoglobina Glicada, Instruções de Uso, Labtest Diagnóstica.
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	Elaborado por:
	
	
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	Aprovado por:
	
	
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	Implantado por:
	
	
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	Substitui POP:
	
	Revisado por:
	
	
	___/___/___
	Revisado por:
	
	
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	Revisado por:
	
	
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	Desativado por:
	
	
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