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Cinetica_Enzimatica_2

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CATÁLISE ENZIMÁTICA
CINÉTICA
Equilíbrio e Estado Estacionário
Tempo
Velocidade: período inicial
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
 As medidas de velocidade inicial (v0) são obtidas 
com a variação da concentração de S 
 Obtenção de várias medidas de v0 para a 
construção de um gráfico
 Determinação da inclinação (tangente)
 A análise gráfica leva a determinação de vários
parâmetros cinéticos
P
R
O
D
U
T
O
F
O
R
M
A
D
O
P
R
O
D
U
T
O
F
O
R
M
A
D
O
P
R
O
D
U
T
O
F
O
R
M
A
D
O
Tempo
Velocidade: período inicial
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
 Vo refere-se a quantidade de produto 
formado na unidade de tempo
 O ensaio envolve a adição de todos os
componentes, incluindo S e E
 Após a adição da E, a absorbância (Abs) é 
monitorada em função do tempo 
 Abs vs tempo pode ser monitorada e a inclinação 
determinada
 Inclinação = Abs/unidade de tempo (min)
 Lembrar: A = cl (mudança [P])
Determinação da velocidade inicial de uma reação catalisada por enzima a 
partir da inclinação instantânea em t = 0 no consumo de substrato ou 
formação do produto
[
S
]
Tempo 
[
P
]
Tempo 
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
Gráfico da conversão de S em P, na reação catalisada por uma enzima
Considerações Importantes:
 A enzima deve permanecer estável no curso de tempo de todas as 
medidas cinéticas
 As taxas iniciais são usadas como medidas de velocidades de reação
 A velocidade de reação não pode ser dependente da concentração de 
enzima
 A produção de produto é linear com o tempo durante o tempo de 
intervalo usado
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
 A concentração de substrato excede em muitas vezes a concentração de 
enzima, ou seja, a concentração de S é praticamente constante durante 
o ensaio
 Uma única enzima é capaz de formar um produto
 Não existe produção considerável de produto na ausência de enzima
 Não existe cooperatividade. A ligação do substrato ao sítio de ligação na 
enzima não influencia a afinidade ou atividade de um sítio adjacente 
 Nem substrato nem produto atuam como moduladores alostéricos ou 
alteram a velocidade de reação enzimática
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Constantes Cinéticas
kcat
kcat/KM
KM
½Vmax
v0
MEDIDAS
CINÉTICAS
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Constantes Cinéticas
É a constante de Michaelis-Menten, que se refere à concentração
de substrato necessária para atingir a metade da Vmax na reação
enzimática, em condições de saturação de S. O KM representa a
concentração de S na qual metade dos sítios ativos da enzima
encontra-se saturado por moléculas de S, no estado
estacionário. KM é uma constante de dissociação aparente e está
relacionada com a afinidade da enzima pelo S, sendo o produto
de todas as constantes de equilíbrio e dissociação até a etapa
irreversível da reação. Quanto menor o valor de KM, maior será a
afinidade da enzima pelo S.
O valor de KM varia consideravelmente de uma enzima para
outra, e de uma enzima em particular, para S diferentes. Seu
valor é expresso em concentração molar (e.g., M, mM, µM).
KM
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Constantes Cinéticas
É uma constante de velocidade de primeira ordem que
corresponde à etapa mais lenta da reação catalítica. O valor de
kcat é referido como o número de ciclos ou renovação (termo do
inglês, turnover number), que corresponde ao número máximo
de mols de S convertidos em P por mols de enzima por unidade
de tempo (e.g., define o número de ciclos catalíticos que ocorre
por unidade de tempo). Esta condição é encontrada somente
quando a enzima está saturada pelo S.
O valor de Vmax é expresso em concentração molar de S ou P por
unidade de tempo (e.g., M/min, µM/min), ao passo que kcat em
tempo (e.g., min-1, s-1).
kcat
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Constantes Cinéticas
Essa razão define a eficiência catalítica de uma enzima e possui
unidades de velocidade de segunda ordem. É bastante utilizada
para avaliar a eficiência de diferentes enzimas, bem como para
comparar o emprego de diferentes S para uma enzima em
particular. A especificidade do S resulta preferencialmente de
diferenças no estado de transição da reação catalisada em
comparação as interações de ligação do estado fundamental. A
razão kcat/KM reflete os efeitos de S nas duas constantes
cinéticas e fornece um limite menor para a constante de
velocidade de segunda-ordem e ligação do S.
kcat/KM
Medida Direta da eficiência da enzima na transformação do substrato
Kcat/KM : Eficácia na transformação do substrato ligado
Eficiência na ligação do substrato 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Parâmetros Cinéticos
KM
kcat/KM
v0
Vmax
UNIDADES
µM s-1
µM
kcat s-1
µM-1s-1
µM s-1
A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração de
enzima
Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de
formação de P na presença de concentrações crescentes de enzima (onde
a concentração de S é mantida constante)
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Formação de P em função de concentrações crescentes de enzima
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial de reação catalisada por enzima
Verifica-se que vo cresce 
linearmente com a concentração 
de enzima em condições padrões 
de reação.
(no intervalo de [E] = 8 [E1])
O efeito da variação da concentração de S na velocidade de reação
também é um fator importante a ser considerado no controle de
reações enzimáticas.
Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de
progresso de formação de P em função de concentrações crescentes
de S, onde a concentração de enzima é mantida constante.
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Formação de P em função de concentrações crescentes de substrato
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Efeito da concentração de S na velocidade inicial de reação catalisada por enzima 
A variação de v0 em função da concentração de S é
mostrada na Figura, cuja representação
característica é de uma hipérbole. Cada medida de
v0 é determinada experimentalmente através das
inclinações dos gráficos de concentração de P em
função do tempo.
Podem ser identificadas três regiões distintas na
curva de progresso de reação. Na primeira região,
em concentrações muito baixas de S ([S] < 0,01
KM), a velocidade apresenta um perfil cinético de
primeira ordem. Com o aumento na concentração
de S, em uma região intermediária do gráfico, a
velocidade apresenta uma dependência curvilínea
em relação à concentração de S. Na terceira região
do gráfico, observa-se a ocorrência de um patamar
máximo caracterizado por altas concentrações de S,
com perfil cinético de ordem zero, no qual v0 é
independente da concentração de S. Neste ponto, a
enzima encontra-se saturada pelo S, e v0 torna-se
igual à velocidade máxima (Vmax).
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten demonstraram que as reações
enzimáticas ocorrem em duas etapas.
Na primeira etapa, ocorre a formação de um complexo E●S, ao passo que, em
uma segunda etapa, observa-se a dissociação deste complexo para a formação de
P e a liberação da enzima livre. Este modelo assume que as reações cinéticas são
conduzidas sob condições experimentais do chamado estado estacionário (do
inglês, steady-state), que se refere ao intervalo de tempo no qual o complexo E●S
é mantido em um nível constante elevado.
Em outras palavras, o equilíbrio entre enzima, S, e E●S é estabelecido de forma
muito rápida em relação à reação subsequentesofrida pela espécie de E●S. Assim,
o complexo E●S estará em equilíbrio com a enzima e S, o que significa que k1 >>
k-1 e k2.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Representação gráfica do equilíbrio rápido entre enzima, S, e E•S, no estado
estacionário (a corresponde ao período de indução e b a vo).
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
As análises cinéticas no estado estacionário permitem uma interpretação
conveniente do curso de reações enzimáticas, sendo alcançada no laboratório em
condições experimentais apropriadas, mantendo-se a concentração de S em
grande excesso em relação à concentração de enzima ([S] >> [E0]). Desta forma,
a enzima está presente em quantidades catalíticas e a variação da concentração
de S (consumo) pode ser considerada desprezível. O gráfico da figura anterior
mostra que as inclinações das curvas de progresso de enzima e E•S podem ser
consideradas desprezíveis (com exceção de um breve período de indução da
ordem de milésimos de segundo).
Isso indica que estas espécies podem ser consideradas constantes na unidade de
tempo (sendo [S] >> [E]T, onde [E]T é a concentração total de enzima).
A equação abaixo apresenta uma descrição quantitativa do esquema de Michaelis-
Menten sob condições do estado estacionário, que pode ser caracterizada
graficamente por uma curva de reação na forma de uma hipérbole.
Equação de Michaelis-Menten para a velocidade de reação catalisada por uma 
enzima.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Determinação experimental de KM e Vmax na cinética de Michaelis-Menten
Embora a interpretação deste
gráfico seja relativamente simples,
existem tratamentos matemáticos e
gráficos que permitem a obtenção
rápida dos parâmetros cinéticos. O
método tradicional baseia-se na
representação linear da equação de
Michaelis-Menten através de uma
reta do tipo y = ax + b
Gráfico da velocidade inicial versus concentração de substrato para uma reação catalisada 
por uma enzima. Regiões de reação de primeira ordem e de ordem zero apresentam 
dependência linear e independência da concentração de substrato, respectivamente
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
V
e
l
o
c
i
d
a
d
e
 
(
n
M
 
m
i
n
-
1
)
Região de ordem zero 
Região de primeira ordem 
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
Recíproco da equação de Michaelis-Menten
Este tratamento dá origem a um gráfico de 1/vo (em y) em função de 1/[S] (em x)
com uma reta de inclinação igual a KM/Vmax, que intercepta o eixo de ordenadas no
ponto 1/Vmax e o eixo das abcissas no ponto -1/KM
Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplo-recíproco (i.e., uma
representação gráfica dos recíprocos de vo e [S]), permite a determinação simples e
direta de Vmax e KM, parametros que só poderiam ser estimados por aproximação a
partir do gráfico de Michaelis-Menten. O valor de kcat, por sua vez, pode ser obtido
dividindo-se Vmax pela concentração de enzima empregada nos experimentos (kcat =
Vmax/[E]).
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Padronização de Ensaios
kcat = Vmax/[ET]
Este gráfico, chamado de
Lineweaver-Burk ou de duplo-
recíproco (i.e., uma
representação gráfica dos
recíprocos de vo e [S] de
acordo com a equação
anterior), permite a
determinação simples e direta
de Vmax e KM, parâmetros que
só poderiam ser estimados por
aproximação a partir do
gráfico de Michaelis-Menten. O
valor de kcat, por sua vez,
pode ser obtido dividindo-se
Vmax pela concentração de
enzima empregada nos
experimentos.

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