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CATÁLISE ENZIMÁTICA CINÉTICA Equilíbrio e Estado Estacionário Tempo Velocidade: período inicial CINÉTICA Controle da velocidade de reações As medidas de velocidade inicial (v0) são obtidas com a variação da concentração de S Obtenção de várias medidas de v0 para a construção de um gráfico Determinação da inclinação (tangente) A análise gráfica leva a determinação de vários parâmetros cinéticos P R O D U T O F O R M A D O P R O D U T O F O R M A D O P R O D U T O F O R M A D O Tempo Velocidade: período inicial CINÉTICA Controle da velocidade de reações Vo refere-se a quantidade de produto formado na unidade de tempo O ensaio envolve a adição de todos os componentes, incluindo S e E Após a adição da E, a absorbância (Abs) é monitorada em função do tempo Abs vs tempo pode ser monitorada e a inclinação determinada Inclinação = Abs/unidade de tempo (min) Lembrar: A = cl (mudança [P]) Determinação da velocidade inicial de uma reação catalisada por enzima a partir da inclinação instantânea em t = 0 no consumo de substrato ou formação do produto [ S ] Tempo [ P ] Tempo CINÉTICA Controle da velocidade de reações CINÉTICA Controle da velocidade de reações Gráfico da conversão de S em P, na reação catalisada por uma enzima Considerações Importantes: A enzima deve permanecer estável no curso de tempo de todas as medidas cinéticas As taxas iniciais são usadas como medidas de velocidades de reação A velocidade de reação não pode ser dependente da concentração de enzima A produção de produto é linear com o tempo durante o tempo de intervalo usado CINÉTICA Controle da velocidade de reações A concentração de substrato excede em muitas vezes a concentração de enzima, ou seja, a concentração de S é praticamente constante durante o ensaio Uma única enzima é capaz de formar um produto Não existe produção considerável de produto na ausência de enzima Não existe cooperatividade. A ligação do substrato ao sítio de ligação na enzima não influencia a afinidade ou atividade de um sítio adjacente Nem substrato nem produto atuam como moduladores alostéricos ou alteram a velocidade de reação enzimática CINÉTICA Controle da velocidade de reações CINÉTICA ENZIMÁTICA Constantes Cinéticas kcat kcat/KM KM ½Vmax v0 MEDIDAS CINÉTICAS CINÉTICA ENZIMÁTICA Constantes Cinéticas É a constante de Michaelis-Menten, que se refere à concentração de substrato necessária para atingir a metade da Vmax na reação enzimática, em condições de saturação de S. O KM representa a concentração de S na qual metade dos sítios ativos da enzima encontra-se saturado por moléculas de S, no estado estacionário. KM é uma constante de dissociação aparente e está relacionada com a afinidade da enzima pelo S, sendo o produto de todas as constantes de equilíbrio e dissociação até a etapa irreversível da reação. Quanto menor o valor de KM, maior será a afinidade da enzima pelo S. O valor de KM varia consideravelmente de uma enzima para outra, e de uma enzima em particular, para S diferentes. Seu valor é expresso em concentração molar (e.g., M, mM, µM). KM CINÉTICA ENZIMÁTICA Constantes Cinéticas É uma constante de velocidade de primeira ordem que corresponde à etapa mais lenta da reação catalítica. O valor de kcat é referido como o número de ciclos ou renovação (termo do inglês, turnover number), que corresponde ao número máximo de mols de S convertidos em P por mols de enzima por unidade de tempo (e.g., define o número de ciclos catalíticos que ocorre por unidade de tempo). Esta condição é encontrada somente quando a enzima está saturada pelo S. O valor de Vmax é expresso em concentração molar de S ou P por unidade de tempo (e.g., M/min, µM/min), ao passo que kcat em tempo (e.g., min-1, s-1). kcat CINÉTICA ENZIMÁTICA Constantes Cinéticas Essa razão define a eficiência catalítica de uma enzima e possui unidades de velocidade de segunda ordem. É bastante utilizada para avaliar a eficiência de diferentes enzimas, bem como para comparar o emprego de diferentes S para uma enzima em particular. A especificidade do S resulta preferencialmente de diferenças no estado de transição da reação catalisada em comparação as interações de ligação do estado fundamental. A razão kcat/KM reflete os efeitos de S nas duas constantes cinéticas e fornece um limite menor para a constante de velocidade de segunda-ordem e ligação do S. kcat/KM Medida Direta da eficiência da enzima na transformação do substrato Kcat/KM : Eficácia na transformação do substrato ligado Eficiência na ligação do substrato CINÉTICA ENZIMÁTICA Parâmetros Cinéticos KM kcat/KM v0 Vmax UNIDADES µM s-1 µM kcat s-1 µM-1s-1 µM s-1 A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração de enzima Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de formação de P na presença de concentrações crescentes de enzima (onde a concentração de S é mantida constante) CINÉTICA Controle da velocidade de reações CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Formação de P em função de concentrações crescentes de enzima CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial de reação catalisada por enzima Verifica-se que vo cresce linearmente com a concentração de enzima em condições padrões de reação. (no intervalo de [E] = 8 [E1]) O efeito da variação da concentração de S na velocidade de reação também é um fator importante a ser considerado no controle de reações enzimáticas. Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de progresso de formação de P em função de concentrações crescentes de S, onde a concentração de enzima é mantida constante. CINÉTICA Controle da velocidade de reações CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Formação de P em função de concentrações crescentes de substrato CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Efeito da concentração de S na velocidade inicial de reação catalisada por enzima A variação de v0 em função da concentração de S é mostrada na Figura, cuja representação característica é de uma hipérbole. Cada medida de v0 é determinada experimentalmente através das inclinações dos gráficos de concentração de P em função do tempo. Podem ser identificadas três regiões distintas na curva de progresso de reação. Na primeira região, em concentrações muito baixas de S ([S] < 0,01 KM), a velocidade apresenta um perfil cinético de primeira ordem. Com o aumento na concentração de S, em uma região intermediária do gráfico, a velocidade apresenta uma dependência curvilínea em relação à concentração de S. Na terceira região do gráfico, observa-se a ocorrência de um patamar máximo caracterizado por altas concentrações de S, com perfil cinético de ordem zero, no qual v0 é independente da concentração de S. Neste ponto, a enzima encontra-se saturada pelo S, e v0 torna-se igual à velocidade máxima (Vmax). CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten demonstraram que as reações enzimáticas ocorrem em duas etapas. Na primeira etapa, ocorre a formação de um complexo E●S, ao passo que, em uma segunda etapa, observa-se a dissociação deste complexo para a formação de P e a liberação da enzima livre. Este modelo assume que as reações cinéticas são conduzidas sob condições experimentais do chamado estado estacionário (do inglês, steady-state), que se refere ao intervalo de tempo no qual o complexo E●S é mantido em um nível constante elevado. Em outras palavras, o equilíbrio entre enzima, S, e E●S é estabelecido de forma muito rápida em relação à reação subsequentesofrida pela espécie de E●S. Assim, o complexo E●S estará em equilíbrio com a enzima e S, o que significa que k1 >> k-1 e k2. CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Representação gráfica do equilíbrio rápido entre enzima, S, e E•S, no estado estacionário (a corresponde ao período de indução e b a vo). CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios As análises cinéticas no estado estacionário permitem uma interpretação conveniente do curso de reações enzimáticas, sendo alcançada no laboratório em condições experimentais apropriadas, mantendo-se a concentração de S em grande excesso em relação à concentração de enzima ([S] >> [E0]). Desta forma, a enzima está presente em quantidades catalíticas e a variação da concentração de S (consumo) pode ser considerada desprezível. O gráfico da figura anterior mostra que as inclinações das curvas de progresso de enzima e E•S podem ser consideradas desprezíveis (com exceção de um breve período de indução da ordem de milésimos de segundo). Isso indica que estas espécies podem ser consideradas constantes na unidade de tempo (sendo [S] >> [E]T, onde [E]T é a concentração total de enzima). A equação abaixo apresenta uma descrição quantitativa do esquema de Michaelis- Menten sob condições do estado estacionário, que pode ser caracterizada graficamente por uma curva de reação na forma de uma hipérbole. Equação de Michaelis-Menten para a velocidade de reação catalisada por uma enzima. CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Determinação experimental de KM e Vmax na cinética de Michaelis-Menten Embora a interpretação deste gráfico seja relativamente simples, existem tratamentos matemáticos e gráficos que permitem a obtenção rápida dos parâmetros cinéticos. O método tradicional baseia-se na representação linear da equação de Michaelis-Menten através de uma reta do tipo y = ax + b Gráfico da velocidade inicial versus concentração de substrato para uma reação catalisada por uma enzima. Regiões de reação de primeira ordem e de ordem zero apresentam dependência linear e independência da concentração de substrato, respectivamente CINÉTICA Controle da velocidade de reações V e l o c i d a d e ( n M m i n - 1 ) Região de ordem zero Região de primeira ordem CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios Recíproco da equação de Michaelis-Menten Este tratamento dá origem a um gráfico de 1/vo (em y) em função de 1/[S] (em x) com uma reta de inclinação igual a KM/Vmax, que intercepta o eixo de ordenadas no ponto 1/Vmax e o eixo das abcissas no ponto -1/KM Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplo-recíproco (i.e., uma representação gráfica dos recíprocos de vo e [S]), permite a determinação simples e direta de Vmax e KM, parametros que só poderiam ser estimados por aproximação a partir do gráfico de Michaelis-Menten. O valor de kcat, por sua vez, pode ser obtido dividindo-se Vmax pela concentração de enzima empregada nos experimentos (kcat = Vmax/[E]). CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios kcat = Vmax/[ET] Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplo- recíproco (i.e., uma representação gráfica dos recíprocos de vo e [S] de acordo com a equação anterior), permite a determinação simples e direta de Vmax e KM, parâmetros que só poderiam ser estimados por aproximação a partir do gráfico de Michaelis-Menten. O valor de kcat, por sua vez, pode ser obtido dividindo-se Vmax pela concentração de enzima empregada nos experimentos.
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