6E- Meios de cultura - técnicas de semeadura

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Meio de Cultura e Técnicas de 
Semeadura
Professora: Erica Pacheco Caetano
 Meios de Cultura
◦ Conjunto de substâncias, formuladas de maneira
adequada, capazes de promover o crescimento
bacteriano, em condições de laboratório.
◦ A maioria das bactérias pode ser cultivada em
laboratório, utilizando-se meios nutrientes;
◦ Diferentes espécies de bactérias, variam extensivamente
quanto as exigências mínimas de substâncias nutrientes;
Introdução
Meio de Cultivo 
 Sobrevivência microbiana
 Crescimento microbiano
 Semear- proporcionar o crescimento do microrganismo 
em meio de cultura
 Estéril
 Composição química 
◦ Varia;
◦ Substâncias: orgânicas e inorgânicas 
Introdução
Meio de Cultivo 
Introdução
Líquidos Sólidos: ágar 1 a 2%
Semi-sólidos
0,5% de ágar
Ágar
100°C- fusão
30° a 40°C- sólido
•Em tensões variadas de oxigênio;
•Verificação da motilidade;
•Conservação de culturas; 
•Ativação das culturas
•Repiques de microrganismos
•Provas bioquímicas.
 Distribuição de meio de cultura
Meio de cultura
Tipos de Meios de Cultivo
 Artificiais ou sintéticos
◦ Quimicamente definidos
◦ Utilizados para trabalhos experimentais em laboratório
◦ EX:
Introdução
Componente QTDE
Glicose 5,0 g
Fosfato de Amônia (NH4N2PO4) 1,0 g
Cloreto de Sódio 5,0 g
Sulfato de Magnésio (MgSO4) 0,2 g
Fosfato Dibásico de Potássio (K2HPO4) 1,0 g
Água 1,0 litro
Tipos de Meios de Cultivo
 Naturais ou Complexo
◦ Componentes: fonte de C, N, vitamina, sais minerais
◦ Utilizados para trabalhos experimentais em laboratório
◦ EX:
Introdução
Componente QTDE
Peptona 5,0 g
Extrato de Carne 3,0 g
Cloreto de Sódio 8,0 g
Ágar 15,0 g
Água 1,0 litro
Classificação dos meios de cultura
 Simples – sem exigência nutricional
◦ Ex: Caldo e ágar nutriente
 Especiais – cumprem exigências vitais
 Ex: ágar sangue
Introdução
Classificação dos meios de cultura
 Enriquecimento – estimula o crescimento de determinado 
microrgansimo:
◦ Crescimento lento;
◦ Exigentes;
◦ Fastidiosos (dificuldade de nutrição)
Introdução
Caldo tioglicolato (aneróbios)
Caldo Tetrationato (Salmonella)
Classificação dos meios de cultura
 Diferencial – separa os grupos de microrganismos:
◦ Facilita identificação das colônias
◦ Ex: ágar sangue
Introdução
Beta-hemólise Alfa-hemólise Gama-hemólise
Classificação dos meios de cultura
 Seletivo – Impede o crescimento de bactérias não desejadas e 
favorece o crescimento dos bactérias de interesse
◦ Ex: ágar Salmonella-Shigella
Introdução
Favorece o crescimento de 
Salmonella-Shigella
Agar Sangue
 A base deste meio é altamente nutritiva e promove um 
ótimo crescimento de todos os microrganismos 
relevantes;
 Meio base: ágar Columbia ou ágar BHI;
 Acrescer o suplemento de sangue desfibrinado. O sangue 
utilizado pode ser de carneiro ou de cavalo, para 
visualização da hemólise; 
Meios Cultura
Agar Sangue
 O agar sangue é utilizado em laboratórios de análises 
clínicas como cultivo primário para o isolamento de 
Streptococcus spp e Staphylococcus spp.;
 O sangue deve estar estéril, pois ele é adicionado ao ágar 
após sua autoclavação. Tal adição deve ocorrer quando a 
solução estiver a 45-50ºC para evitar a hemólise do 
sangue. 
Meios Cultura
Agar Sangue
 As placas prontas devem ser armazenadas sob refrigeração 
(2º a 8ºC) por 1 mês.
 Cor: vermelho opaco.
Meios Cultura
Agar Sangue
Meios Cultura
Ex: Staphylococcus
aureus, 
Streptococcus
pyogenes
Ex: Streptococcus
pneumoniae
Ex: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae
Agar Sangue
Meios Cultura
Streptococcus pneumoniae
Agar Sangue
Meios Cultura
Micrococcus
Staphylococcus
epidermidis
Agar Sangue
Meios Cultura
Streptococcus
pyogenes
Staphylococcus
aureus
Ágar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) 
 Não seletivo, porém é diferencial;
 Destinado ao isolamento, cultivo e contagem de colônias 
em amostras de urina. 
 Permite a identificação de bactérias fermentadoras da 
lactose devido a mudança de coloração do meio de verde 
para amarelo.
 Inibe o crescimento de Proteus sp.
Meios Cultura
Ágar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) 
 Aparência: verde
 Armazenamento: Invertidas entre 2 a 8ºC; armazenar de 
forma a permitir a circulação de ar entre as placas
Meios Cultura
Mac Conkey
 É um meio seletivo e diferencial para isolamento de 
Enterobacteriaceae e bacilos Gram negativos entéricos;
 Sais biliares e cristal violeta: inibição de gram(+) e gram(-) 
fastidiosos
 Lactose é o único carboidrato.
Meios Cultura
Mac Conkey
 Nesse meio podemos diferenciar:
◦ Bactérias fermentadoras de lactose - colônias rosa com halos de 
precipitação como: E. coli, Klebsiella, Enterobacter; 
◦ Não fermentadoras de lactose - colônias transparentes ou 
incolores como: Salmonella, Shigella, Proteus.
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella 
 Altamente Seletivo
 Formulado para inibir a maioria dos coliformes e permitir 
o crescimento de Salmonella e Shigella a partir de fezes, 
urina e alimentos frescos ou enlatados.
 As concentrações de sais biliares e citrato de sódio inibem 
todas as bactérias g (+) e coliformes;
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella 
 Vermelho Neutro = indicador de pH ácido
 Tiossulfato = fonte de enxofre;
 Produção de gás sulfeto de hidrogênio = precipitado 
negro, formado com citrato férrico
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella 
 Salmonella = colônias transparentes com centro negro.
 Shiguella = colônias incolores, sem enegrecimento;
 Aparência: Rosa Alaranjado
 Armazenamento: 
Invertidas entre 2 a 8ºC; armazenar de forma a permitir a 
circulação de ar entre os pacotes. pH= 7,4
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella
Meios Cultura
Ágar Salmonella Shigella 
Meios Cultura
Klebsiella
pneumoniae
Escherichia coli
Proteus
mirabilis
Salmonella sp.
Pseudomonas aeruginosa
Ágar Chocolate
 Meio Enriquecido
 Cultivo de organismos fastidiosos, como Neisseria sp., 
Haemophilus sp.e outros germes exigentes. 
 Para o isolamento de Haemophilus adiciona-se antibióticos 
(ex: bacitracina);
 Aparência: marrom
 Adicionado de sangue 80ºC
Meios Cultura
Ágar Chocolate
Meios Cultura
Ágar Müeller Hinton
 Finalidade: 
Realização de antibiograma (teste de sensibilidade) pela 
técnica de difusão de discos segundo o CLSI. 
 É rico em proteínas e carboidratos que fornece o substrato 
ideal para o desenvolvimento e crescimento de cepas 
bacterianas de interesse clínico.
 Aparência: 
Âmbar claro
Meios Cultura
Ágar Müeller Hinton
Meios Cultura
Ágar Müeller Hinton + Sangue 
 Finalidade: Facilitar o crescimento de microrganismos 
fastidiosos. 
 Streptococcus sp. 
Meios Cultura
Lowenstein-Jensen
 Componentes: ovos inteiros 
coagulados, sais definidos, 
glicerol e fécula de batata;
 Agente inibidor = verde 
malaquita (Gram +);
 Meio para o isolamento de 
Mycobacterium tuberculosis.
Meios Cultura
Meios Cromogênicos A identificação presuntiva é baseada nas diferentes
colorações das colônias bacterianas, causada pelas reações
enzimáticas espécie ou gênero específico com substratos
incorporados no meio de cultura
Meios Cultura
Meios Cromogênicos 
Meios Cultura
Meios 
Cromogênicos
Meios Cultura
Caldo BHI
 Meio de enriquecimento;
 Permite o crescimento da maioria das bactérias.
Meios Cultura
Caldo Tioglicolato
 Meio enriquecido, adicionado de hemina e vitamina K;
 Não inibidor;
 Permite um bom desenvolvimento de todos anaeróbios 
encontrados com frequência em amostras biológicas.
Meios Cultura
Meios Cultura
Transporte
 Impede a multiplicação/mantém a sobrevivência;
 Conserva espécies de Haemophilus, Neisseria, Salmonella, 
Pneumococos e outros;
Meios Cultura
Meio Amies com carvão
Meio de cultura
 Critérios para crescimento:
◦ Nutrientes corretos
◦ pH ajustado
◦ Quantidade específica de oxigênio ou ausência
◦ Inicialmente ser estéril
◦ Incubado em temperatura adequada
 Bactérias não cultiváveis in vitro
◦ Mycobacterium leprae
◦ Treponema pallidum
 Semeio
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
 Semeio
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Fazer estrias
 Semeio
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Semeio por esgotamento = obtenção de colônias isoladas
 Semeio 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Contagem semi-quantitativas = 
alça calibrada de 0,001 
 Semeio 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Semeadura 
em tapete 
para teste de 
sensibilidade
 Cultura...
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Meio de cultura
Estufa Bacteriológia
35-37°C por 24-48h
Avaliação do Crescimento Bacteriano
(Passo 1)
 Meios de cultura sólidos: crescimento de colônias que 
podem estar separadas ou não, dependendo do tipo de 
semeio utilizado.
 Placas de Petri ou tubo:
◦ Cor
◦ Aspecto (mucosas ou não)
◦ Forma 
◦ Tamanho. 
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Avaliação do Crescimento Bacteriano
 Cada colônia (em princípio) = multiplicação de uma só 
bactéria. 
 Diferentes espécies = diferenças mais visíveis em meios 
seletivos.
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
 Passo 2: as colônias isoladas são coradas pelo método de 
Gram e células individuais de bactérias são observadas ao 
microscópio.
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
Coloração de Gram em 
Corynebacterium diphtheriae
Coloração de Gram em Streptococcus
Coloração de Gram em Bacillus anthracis
Coloração de Gram em Escherichia coli
Observa-se a aparência das bactérias sob microscópio. 
Pergunta-se:
 Elas são Gram positivas ou negativas ou álcool-ácido resistentes?
 Qual a sua morfologia (bacilos, cocos, espiraladas, etc.)?
 As células ocorrem de forma isolada, em cadeias ou em pares?
 Qual o tamanho das células?
 Intraleucocitárias?
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos
 Passo 3: As bactérias são identificadas usando-se colônias 
isoladas, as quais são submetidas a testes bioquímicos
Semeio , Isolamento e Identificação de Microorganismos