Aula 6 - PCR

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS 
INSTITUTO DE BIOLOGIA 
DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA E GENÉTICA 
 
 
LABORATÓRIO DE ENGENHARIA GENÉTICA ANIMAL 
 
CARLA MOREIRA – CARLAFARMA@GMAIL.COM 
DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
DNA é um ácido 
nucléico composto de 
duas cadeias 
antiparalelas 
complementares. 
 
Os nucleotídeos são 
compostos de um grupo 
fosfato, uma pentose e 
uma base nitrogenada 
DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
*Acúcar do DNA 
*Ácido Desoxirribonucleico 
 
*Açúcar do RNA 
*Ácido Ribonucleico 
 
 DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
Possui quatro bases nitrogenadas. 
 
*Duas são chamadas purinas 
*Adenina ( A ), Guanina ( G ) 
 
*Duas são pirimidinas 
*Citosina ( C ), Timina ( T ) 
 DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
Essas quatro bases são ligadas em um padrão 
repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases 
nitrogenadas 
 
A ligação de duas cadeias complementares é 
chamada de HIBRIDIZAÇÃO. 
 DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a 
estrutura do DNA. 
Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de 
hidrogênio. 
 
Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de 
hidrogênio. 
 
 Padrão de ligação. 
* Padrão primário 
 CCGAATGGGATGC 
 GGCTTACCCTACG 
* Padrão complementar 
 
 DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
 DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
 Diferenças entre DNA e RNA 
*
RECAPTULAÇÃO
Açúcar 
Desoxirribose Ribose 
Fita dupla Fita simples 
 DNA 
*Adenina 
*Guanina 
*Citosina 
*Timina 
 
 RNA 
*Adenina 
*Guanina 
*Citosina 
*Uracila 
Purinas 
Pirimidinas 
Bases Nitrogenadas 
 Genética Molecular: DNA 
*
RECAPTULAÇÃO
*Introdução ao PCR 
 
*Reação da Polimerase em Cadeia 
 
É a técnica de multiplicação de parte de uma fita de DNA 
(gene ) ou RNA. 
*Introdução ao PCR 
*Pai da técnica: 
 
Kary Banks Mullis - Lenoir, 28 de dezembro de 
1944 é um Bioquimico. 
Idéia em 1983 
Publicação em Outubro de 1985 American 
Society of Human Genetics 
 
Laureado com o premio nobel de Quimica em 
1993, pela invenção da da tecnica. 
 DNA 
*
INTRODUÇÃO
Bases que Kary Banks Mullis utilizou sou para esta técnica 
# Diferenças de temperatura – à 95°C desnatura (abre a fita de 
DNA) 
 
# Enzima que funcionasse à temperaturas altas 
 DNA polimerase que é termoestável. 
 O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez 
na bacteria Thermus aquaticus 
 Encontrada em fontes termais suporta por 40 minutos (a 94°C). 
Características do PCR 
 
Amplificação de Seqüências 
 
Processo Cíclico 
15 a 40 ciclos 
realizado por mudança de temperatura 
Produção de DNA por PCR 
Produção de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs 
específico = amplifica sequência-alvo na presença de DNA 
genômico 
sensível = detecta até apenas 1 sequência de molde 
flexível = muitas variações da técnica básica de PCR 
*Requerimentos Básicos do PCR 
 
1. Molde - DNA ou RNA 
2. DNA polimerase 
3. dNTPs 
4. Iniciadores de Oligonucleotídeos 
(Primers) 
Função dos Iniciadores 
Primers 
fragmento de fita simples 
fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de DNA 
definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser 
amplificado 
estabelecer especificidade 
Recaptulação sobre 
fragmento de fita 
simples- RNA 
Função dos Primers 
Oligos Iniciadores 
Primers 
sintetizados quimicamente 
tipicamente entre 15 a 25 bases 
define limites de alvo a amplificar 
prévio conhecimento da sequência alvo 
tradução reversa de uma sequência de PTN 
primer de seqüências aleatórias 
Ciclos de Temperatura no PCR 
 Anelamento 
 do Primer Tm 
 
 
Desnaturação Extensão 
 94oC do Primer 72oC 
Abertura 
das 2 
fitas de 
DNA 
Primer 
se liga 
Taq DNA 
polimerase faz a 
colocação dos 
nucleotídeos 
Desnaturação do DNA 
94 a 100oC 
 
Desnaturar DNA alvo 
Desnaturar produtos de ciclos prévios 
4 a 10 min de desnaturação inicial duração de 
30 s a 1 min 
 
Anelamento do Primer 
40 a 70oC 
Temperatura de “hibridização” 
otimização da temperatura para cada par de primer 
composição = %G+C 
Tm = 81.5 + 16.6(log10([M Na+])) + 0.41*(%GC) - 600/length 
determina especificidade do produto amplificado 
 tipicamente 30 s a 2 min 
Vide aula de Acidos Nucleicos-
Propriedade do DNA 
Anelamento do Primer 
%G+C 
*Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) - 
600/comprimento 
*[Na] em concentração Molar {PCR usa-se KCl} 
*%GC em percentual 
*comprimento em bases 
* Primer3 - 600/length 
*GCG - 674/length 
*formamida: subtrair 65*(% formamida) 
*Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR) 
 Tm = 59,9 + 0.41*(%GC) - 675/comprimento 
http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html 
Extensão do Primer 72oC 
 
Taq polimerase 
faixa de atividade: 20oC a 85oC 
atividade varia 100x nessa faixa 
 
Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do 
produto desejado 
 
Amplificação Geométrica 
 Ciclo Número Fita Duplas produzidas 
 1 0 
 5 8 
 10 256 
 15 8.192 
 20 262.144 
 25 8.388.608 
 30 268.435.456 
 35 8.589.934.589 
 40 274.877.906.800 
 
 
Objetivos: 
 Clonagem de Genes 
 Identificação de Mutação 
 Diagnóstico de Doenças 
 Controle de Qualidade 
 Taxonomia 
 Medicina forense 
 Variabilidade Genética 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Objetivo do uso da 
tecnica de PCR 
Usos da tecnica da PCR 
-Clonagen 
Técnica da PCR 
para multiplicar o 
fragmento de 
interesse 
Sequenciamento do gene MC1R 
Usos da tecnica da PCR 
-Mutação 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
Usos da tecnica da PCR 
-Diagnostico de doença 
Discriminação alélica do fator V da coagulação por PCR 
Discriminação alélica do fator V da coagulação por PCR em tempo real: diagnóstico simples e preciso Allelic discrimination of coagulation 
factor V by real time PCR: a simple and accurate diagnosis Aldemir B. Oliveira Filho1 Júlia F. Campos2 Magaly B. P. L. V. Lima3 Farida C. B. 
C. Melo3 Washington B. Neves4 Raul A. M. Melo5 José Alexandre R. Lemos6 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
Usos da tecnica da PCR 
-controle de qualidade 
Controle de qualidade de semem bovino 
Usos da tecnica da PCR 
-controle de qualidade 
Usos da tecnica da PCR 
-Taxonomia 
Usos da tecnica da PCR 
-Medicina forence 
Coleta de material no local de um crime por exemplo 
Usos da tecnica da PCR 
-Paternidade 
RT-PCR (Transcriptase reversa): Expressão Gênica 
 
Multiplex PCR: Sexagem embriões 
 
Nested PCR: Aumento sensibilidade e especificidade 
 
Hot-Start PCR: Amplificação inespecífica 
 
PCR em Tempo Real: Visualização do aumento da quantidade 
 
Nested Supression PCR (NSP): Sequências desconhecidas 
 
 
 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
 Reação de PCR é ativada quando a temperaturaatinge 940C. Esse 
procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois aDNA 
polimerase contém um anticorpo que se desnatura e ativa a 
enzima ao atingir a temperatura de 940C. 
 
DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar 
produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente. 
Hot start aumenta: especificidade, sensibilidade e rentabilidade do 
produto 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Variação da PCR 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
*Aparelhagem 
*
* Coleta do material 
 
 1 – Preparo do material 
 2 – Lise 
 3 – Purificação 
 4 – Precipitação 
 5 – hidratação 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 
* Extração do DNA 
 M1 M1 N1 N1 M2 M2 N2 N2 M3 M3 N3 N3 Marc 
PCR – Reação de Polimerização em Cadeia 
 
 Busca da região codificante 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
PRIMERS 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
PRIMERS 
 
*
 PCR 
 
Ciclo da reação 
 
 
1- Desnaturação 
 
 
 
 
2- Anelamento 
 
 
 
 
 
3 - Polimerização 
 
94 - 95°C 
 
 
 
 
50 – 65°C 
 
 
 
 
 
72°C 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
REAÇÃO 
 
 PCR 
 
Repetição do ciclo 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
REAÇÃO 
 
 Volume da Reação 
 
Vol. (µl)/tubo Vol. (µl)/6 tubos 
H2Odd 17,7 106,2 
10x Buffer 2,5 15,0 
Mgcl2 1,5 9,0 
dNTPs 0,5 3,0 
Primer 1,0 6,0 
Taq® 0,8 4,8 
DNA/ H2Odd 1,0 6,0 
Total 25,0 150,0 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
REAÇÃO 
 
 Tempo da Reação 
 
Temperatura (°C) Tempo 
Desnaturação inicial 94 5’ 
Desnaturação 94 30’’ 
Anelamento 56 60’’ 
Extensão 72 3’ 
Extensão final 72 7’ 
Em espera 15 - 
Ciclos: 35x 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
REAÇÃO 
 
 Eletroforese em gel de agarose 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Marc1 Marc2 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
 ANÁLISE 
 
 Obrigado 
 
 
 
 
 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase