As Diretrizes do MIQE

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As Diretrizes do MIQE: Informação Mínima para publicação de experimentos de PCR quantitativo em tempo real.
JUSTIFICATIVA: Atualmente, a falta de consenso existe sobre como melhor executar e interpretar os experimentos de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). O problema é exacerbado pela falta de detalhes experimentais suficientes em muitas publicações, o que impede a capacidade de um leitor avaliar criticamente a qualidade dos resultados apresentados ou para repetir os experimentos.
CONTEÚDO: As diretrizes (MIQE) direcionam a confiabilidade dos resultados para ajudar a garantir a integridade da literatura científica, promover consistência entre laboratórios e aumentar transparência. O MIQE é um conjunto de diretrizes que descreve as informações mínimas necessárias para avaliar os experimentos qPCR. Incluído é uma lista de verificação para acompanhar a submissão inicial de um manuscrito. Ao fornecer todos os dados experimentais relevantes condições e características do ensaio, os revisores podem avaliar a validade dos protocolos utilizados. Divulgação completa de todos os reagentes, sequências e métodos de análise são necessários para permitir que outros pesquisadores reproduzam os resultados. 
A PCR quantitativa em tempo real é baseada em fluorescência (qPCR), tem capacidade de detectar e medir quantidades mínimas de ácidos nucléicos em uma ampla gama de amostras de várias fontes. É conceitual e prática, juntamente com a sua combinação de velocidade, sensibilidade e especificidade. Além de seu uso como ferramenta de pesquisa, muitas aplicações de diagnóstico foram desenvolvidas, incluindo quantificação microbiana, determinação da dosagem gênica, identificação de transgenes em organismos geneticamente modificados alimentos, avaliação de risco de recorrência do câncer e aplicações para uso forense. Essa popularidade é refletida no prodigioso número de publicações que relatam dados qPCR, que invariavelmente usam diversos reagentes, protocolos, análises, métodos e formatos de relatório. Este notável falta de consenso sobre a melhor forma de realizar experimentos com qPCR tem a consequência adversa de perpetuar uma série de graves deficiências que oneram seu status como um critério independente. Deficiências técnicas que afetam o desempenho do ensaio incluem o seguinte:
Armazenamento inadequado da amostra, preparação, e qualidade do ácido nucleico, produzindo resultados variáveis; 
Má escolha dos primers de transcrição reversa e sondas para a PCR, levando a desempenho de ensaio ineficiente e menos robusto;
Dados inadequados e análises estatísticas, gerando resultados que podem ser altamente enganosos. 
Consequentemente, existe o perigo real da literatura científica sendo corrompido com uma infinidade de publicações relatando resultados inadequados e conflitantes. A publicação (14) e retração (15) de um relatório “Breakthrough of the Year 2005” fornece um aviso inquietante. O problema é exacerbado pela falta de informação que caracteriza a maioria dos relatórios de estudos que utilizaram essa tecnologia, com muitos publicações que não fornecem detalhe dos dados experimentais para permitir ao leitor avaliar criticamente qualidade dos resultados apresentados ou para repetir os experimentos. Especificamente, informação sobre aquisição de amostra e manuseio, qualidade e integridade do RNA, detalhes da transcrição reversa, eficiências de PCR e parâmetros análise são frequentemente omitidos, ao passo que normalização é habitualmente realizada contra genes de referência sem justificação adequada.
O objetivo deste documento é fornecer aos autores, revisores e editores de especificações informações, devem ser relatadas para um experimento qPCR para garantir sua relevância, precisão, interpretação correta e repetibilidade. As diretrizes visam a confiabilidade dos resultados para ajudar a garantir a integridade da literatura científica, promover a consistência entre laboratórios, e aumentar a transparência experimental. Eles devem ser lidos em conjunto com publicações recentes que lidam em profundidade com a questão da padronização qPCR.
Nomenclatura 
Alguns termos padronizados exigem para garantir o esclarecimento:
Propomos que a abreviação qPCR seja usada para PCR quantitativo em tempo real e que RT-qPCR ser usado para transcrição reversa. 
Os genes utilizados para normalização devem ser referidos como genes de referência, não como genes de manutenção
Sondas TaqMan devem ser referidas como sondas hidrólise.
O termo sonda FRET (energia de ressonância de fluorescência sonda de transferência) refere-se a um mecanismo genérico em que a emissão/depende da interação entre os estados de excitação de elétrons de 2 fluorescentes moléculas de corante. Sondas do tipo LightCycler devem ser referidos como sondas de hibridização dupla.
A nomenclatura que descreve o ciclo fracionário utilizado para quantificação é inconsistente, com ciclo limite (Ct), ponto de passagem (Cp) e ponto descolagem (TOP) atualmente utilizado na literatura. Estes termos todos se referem ao mesmo valor do instrumento tempo real e foram cunhados por fabricantes concorrentes de instrumentos em tempo real por razões de diferenciação do produto, não precisão científica ou clareza. Propomos o uso do ciclo de quantificação (Cq), de acordo com o RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) padrão de dados (http: //www.rdml.org) (27).
 Considerações conceituais
Para explicar e justificar as diretrizes, achamos útil para rever uma série de questões-chave em torno dos experimentos de qPCR. 
2.1 Sensibilidade analítica: refere-se ao número mínimo de cópias em uma amostra que pode ser medida com precisão em um ensaio. Sensibilidade clínica é a porcentagem de indivíduos com um determinado transtorno que o ensaio identifica como positivo para essa condição. Normalmente, a sensibilidade é expressa como limite de detecção (LOD), que é a concentração que pode ser detectado com razoável certeza (95% de probabilidade).
O LOD mais sensível teoricamente possível é de 3 cópias por PCR (28), supondo a distribuição de Poisson, 95% de chance de incluir pelo menos 1 cópia na detecção no PCR. Procedimentos experimentais incluem tipicamente etapas de processamento de amostra (ou seja, extração) e, quando necessário, transcrição reversa. Se as mudanças de volume e as eficiências dessas etapas são contabilizados, o LOD mais sensível teoricamente pode ser expresso em unidades relevantes para o experimento, como cópias por nanograma. As estimativas de LOD nas análises qPCR são complicadas pela natureza logarítmica de Cq, porque Cq é indefinido quando a concentração do modelo é zero. Determinação apropriada e modelagem do LOD no qPCR é o foco de pesquisa continuada (26).
2.2 Especificidade analítica refere-se à detecção do ensaio qPCR.
a sequência alvo apropriada em vez de outros alvos inespecíficos também presentes em uma amostra. Especificidade diagnóstica é a porcentagem de indivíduos sem uma determinada condição em que o ensaio identifica como negativo para essa condição.
2.3 Precisão refere-se à diferença entre concentrações medidas e reais, apresentado como alterações de dobra ou número de cópias estimativas.
2.4 Repetibilidade (precisão de curto prazo ou variância intra-ensaio) refere-se à precisão e robustez do ensaio com as mesmas amostras analisadas repetidamente no mesmo ensaio. Pode ser expresso como oSD para a variância Cq. Alternativamente, o SD ou o CV para número de cópias ou variação de concentração pode ser usado. CVs não devem ser usados com Cqs, entretanto (29).
2.5 Reprodutibilidade (precisão a longo prazo ou variância interensaio) refere-se à variação nos resultados entre corridas ou entre diferentes laboratórios e é tipicamente expressa como o SD ou CV de números de cópias ou concentrações. Valores Cq gerados de diferentes corridas estão sujeitos a inerente variação (30); daqui, relatando a variação Cq não é apropriada.
Publicações descrevendo concentrações de mRNA para os genes-alvo devem esclarecer com precisão quaissão os alvos. As transcrições da maioria dos genes humanos e muitos outros genes de organismos multicelulares são alternativamente spliced ​​(31, 32), especificar as isoformas de proteínas alternativas, com variação splicing padrões relatados em diferentes tecidos ou em diferentes estágios de desenvolvimento. 
Consequentemente, o único ensaios RT-qPCR baseados em exon podem detectar várias variantes de splicing, enquanto os primers intran-spanning podem ser mais seletivo, mas pode perder algumas variantes de emenda completamente. Mais recentemente, foram descritos genes autossômicos que exibem desequilíbrio alélico em sua expressão (33). 
Em conjunto, estas descobertas implicam que o uso de um ensaio RT-qPCR que simplesmente um ou no máximo 2 exons de um mRNA não é mais suficiente para descrever o nível de expressão de um determinado gene. Consequentemente, informações de sequência para primers devem ser fornecidos juntamente com uma avaliação da sua especificidade em relação às variantes de emenda conhecidas e posições de polimorfismo de nucleotídeo único documentadas em transcrição e polimorfismo de nucleotídeo único bases de dados. Para conjuntos de primers selecionados do Banco de dados RTprimerDB (34, 35) (http: // www.rtprimerdb.org), que contém todas as informações relevantes. Para ensaios comerciais, informações sobre lotes e os critérios de validação experimental dos provedores são obrigatórios. A comunicação de resultados para comercial não validado ensaios e ensaios que foram validados apenas in silico são fortemente desencorajados.
Deve ser lembrado que a detecção da presença de um mRNA não fornece informações sobre se esse mRNA será traduzido em uma proteína ou, na verdade, se uma proteína funcional é traduzida de todo. 
Imunohistoquímica, western blotting ou outros métodos de quantificação de proteínas nem sempre são capaz de corroborar com os dados quantitativos de mRNA celular. Agora está bem estabelecido que frequentemente falta concordância entre RNAm e concentração de proteínas (36), o que é particularmente verdadeiro é que os mRNAs especificam proteínas que fazem parte de complexos proteicos multifuncionais (37). Finalmente, tornou-se claro que o conhecimento da presença e função de microRNAs específicos é tão importante compreender a expressão gênica como sendo capaz de quantificar as espécies de ARNm (38).
Também é necessário estar ciente de que a maioria dos dados de RNA não são absolutos, mas relativos. Então, o genes de referência ou materiais utilizados para padronização são críticos e qualquer avaliação da validade de um experimento RT-qPCR também deve considerar a adequação a referência de quantificação relativa. Assim sendo, o desenvolvimento do DNA universal de referência e os materiais de calibração de RNA, embora muito úteis (39, 40), não será uma panacéia universal (41, 42).
Grande parte da variação nos valores relatados de expressão produzido em experimentos RT-qPCR não é simplesmente devido à variação nos protocolos experimentais, mas é causada por correções aplicadas por vários processamentos de dados algoritmos, cada um dos quais faz o seu próprio hipóteses sobre os dados. Consequentemente, embora qPCR tem sido frequentemente proclamado um marco ou um padrão ouro, na prática esse “padrão” é uma variável, e o relato dos resultados requer considerável sofisticação da análise e interpretação (43).
Aplicações de Pesquisa e Diagnóstico
Aplicações da tecnologia qPCR podem ser amplamente divididas em aplicações de pesquisa e diagnóstico. 
Pesquisa: Aplicações geralmente analisam uma ampla gama de alvos com um rendimento razoavelmente baixo e muitos tipos de amostra. Os principais parâmetros que precisam abordar referem-se à sensibilidade analítica do ensaio e especificidade, que neste contexto se referem a como muitas cópias alvo o ensaio pode detectar e se os controles sem modelo (NTCs) são negativos, respectivamente.
Diagnóstico: As aplicações geralmente analisam um número limitado de alvos, mas requerem alta taxa de transferência, protocolos que são direcionados a apenas alguns tipos de amostra. Apesar de todas as considerações de aplicações da pesquisa também se aplicam ao diagnóstico. 
Ensaios clínicos-diagnósticos têm um número adicional de requisitos que precisam ser considerados. Esses requisitos incluem informações sobre sensibilidade e especificidade que, neste contexto, se refere a com que frequência o ensaio retorna um resultado positivo e quantas vezes é negativo no ausência do alvo. Além disso, a precisão dentro e entre laboratórios é frequentemente monitorado por programas externos do controle de qualidade. Requisitos laboratoriais incluem critérios para gerar resultados reportáveis, sejam medições repetidas em amostras, dados sobre a resolução de dados falso-positivos/ falso-negativos e a similaridade de resultados de múltiplos laboratórios que usam o mesmo e diferentes tecnologias. 
Até agora, apenas um par de comparações interlaboratoriais foram realizadas, e ambos os estudos enfatizaram a necessidade de padronização de ensaios diagnósticos de qPCR (44, 45). Outro exercício interlaboratorial está planeado no âmbito do Projeto do Framework 7: SPIDIA (Padronização e Melhoria das Ferramentas Pré-analíticas Genéricas e Procedimentos para diagnósticos in vitro (http://www.spidia.eu)
Aquisição de amostras, Manipulação e Preparação
A aquisição da amostra constitui o primeiro potencial fonte de variabilidade experimental, especialmente para experimentos visando RNA, porque os perfis de mRNA são facilmente perturbado pela coleta de amostras e pelo métodos processamento. Há alguma sugestão de que tecido fresco pode ser armazenado no gelo sem grandes efeitos sobre a qualidade do RNA e concentração (46), mas embora essa suposição pode ser verdade para alguns ARNm e tecidos, pode não ser universalmente aplicável. Por isso, é melhor ser cauteloso.
Consequentemente, é importante relatar em detalhes onde a amostra de tecido foi obtida e se foi processada imediatamente. Se a amostra não foi processada imediatamente, é necessário relatar como foi preservado e por quanto tempo e sob que condições de armazenamento. Uma breve descrição da amostra também é essencial. Por exemplo, exame microscópico de um tumor a biópsia revelará qual porcentagem da biópsia é feita de células tumorais, e esta informação deve ser relatado. 
Extração de ácido nucleico é um segundo passo crítico: A eficiência de extração depende da homogeneização adequada e o tipo de amostra (por exemplo, tecido in situ versus fase células cultivadas), densidade alvo, estado fisiológico (por exemplo, saudável, cancerígeno ou necrótico), complexidade genética e quantidade de biomassa processada.
Portanto, é necessário que os detalhes do método de extração ácido nucleico sejam fornecidos e que os métodos usado para medir a concentração de ácido nucléico e avaliar sua qualidade seja descrita Tais detalhes são particularmente crucial para o RNA extraído das amostras congelados frescos de biópsia por microdissecção a laser, porque variações nos processos de preparação de tecidos têm um efeito na produção e qualidade de RNA (47).
CQ de Ácidos Nucleicos
AMOSTRAS DE RNA
A quantificação do RNA nas amostras extraídas é importante, porque é aconselhável que as mesmas quantidades de RNA podem ser usadas ao comparar amostras. Existem vários procedimentos de quantificação em uso comum, no entanto, incluindo espectrofotometria (NanoDrop; Thermo Scientific), microfluídica análise (Bioanalyzer da Agilent Technologies, Bio-Rad Laboratories ’Experion), eletroforese em gel capilar (QIAxcel da Qiagen) ou detecção de corante fluorescente (Ambion / RiboGreen da Applied Biosystems. Os métodos produz resultados diferentes, tornando imprudente tentar comparar os dados obtidos com os diferentes métodos (48). 
O método preferido para quantificar os usos de RNA corantes fluorescentes de ligação a RNA (por exemplo, RiboGreen), quais são os melhores para detectar baixas concentrações de alvo. Em qualquercaso, é aconselhável medir todas as amostras com um único método e para relatar esta informação. Também é importante testar e relatar a extensão de contaminação do DNA genômico e para registrar critérios de corte de limiar para as quantidades de tal contaminação que são toleráveis. 
É essencial relatar se a amostra de RNA foi tratada com DNase (incluindo o tipo de DNase usado e as condições da reação) e relatar os resultados de uma comparação de Cqs obtidas com transcrição positiva e não-reversa para cada alvo de ácido nucleico. Também é essencial documentar a avaliação da qualidade de modelos de RNA. A única situação em que este requisito não se aplica é quando a quantidade do RNA total extraído é muito baixo para permitir uma avaliação de qualidade. Esta situação surge quando o RNA é extraído de células individuais, plasma, outros fluidos corporais livres de células, alguns amostras capturadas a laser, ou meio de cultura de tecidos clarificado.
Aplica-se também nos casos em que a extração e as etapas RT-qPCR são executadas como um único e contínuo experimento. As principais informações a serem relatadas incluem dados sobre a quantidade de RNA, integridade e ausência de transcrição reversa ou inibidores de PCR. Vale a pena lembrar que o RNA degrada marcadamente in vivo, devendo à regulação natural de mRNAs em resposta a estímulos ambientais (49). Esta fonte de degradação de RNA está além do controle do pesquisador; um de suas manifestações é que mesmo amostras de RNA de alta qualidade pode mostrar degradação diferencial do indivíduo mRNAs.
A relação A260/A280 deve ser medida em um buffer de pH neutro, mas essa medida não é suficiente se o ácido nucleico deve ser usado para análise quantitativa, especialmente quando o objetivo é medir pequenas diferenças (~ 10 vezes) em concentrações de ARNm celular. A razão de absorbância fornece uma indicação de pureza do RNA, porque a presença de DNA ou fenol residual altera a relação. Em vez disso, deve-se fornecer evidência de eletroforese gel no mínimo ou, melhor ainda, da análise de rRNA baseada em amicrofluidics (50) ou um gene de referência / gene alvo e ensaio de integridade (51).
A vantagem do uso de um bioanalisador / sistema experimento para calcular um número de integridade de RNA ou número do indicador de qualidade do RNA é que essas medidas fornecer informações quantitativas sobre o estado da amostra de RNA. É importante ter em conta estes números se relacionem com qualidade rRNA e não se pode esperar que seja uma medida absoluta de qualidade. O ensaio também exige o estabelecimento de um critério limiar que delineia a qualidade do RNA suficiente para produzir resultados confiáveis. Idealmente, o ensaio deve ter como alvo painel de “genes de referência de integridade”, provavelmente sem introns, com um 3?: 5? relação de limiar de aproximadamente 0,2-5. 
Claramente, mais trabalho é necessário para gerar protocolo universalmente aplicável, econômico e simples para avaliar a integridade do RNA. Inibição da atividade de transcrição reversa ou PCR deve ser verificado por diluição da amostra (de preferência) ou uso de um ensaio de inibição universal, como o SPUD (52, 53). 
Se a amostra de RNA estiver parcialmente degradada, é essencial que essa informação seja relatada, porque a sensibilidade do ensaio para detectar um transcrição de baixo nível pode ser reduzida e diferenças relativas na degradação de transcrições pode produzir proporções alvo incorretas.
 AMOSTRAS DE DNA
Em geral, a degradação é muito menos um problema com DNA; no entanto, é importante poder avaliar a extensão da degradação do DNA para aplicações forenses, isto é, nos casos em que condições ambientais adversas em cenas de crimes ou desastres em massa ou em locais que envolvam casos de pessoas desaparecidas podem ter degradado o produto químico estrutura do DNA.
 O tamanho do amplicon do ensaios de qPCR ajuda a minimizar os problemas relacionados ao ensaio, mas foram desenvolvidos métodos que proporcionam uma medição da qualidade do DNA (54) e deve ser considerados para fins especializados. O potencial de inibição é geralmente variável e deve ser abordada em uma publicação, e é importante assegurar que nenhum inibidor co-purificado com o DNA irá distorcer os resultados, por exemplo, detecção de patógenos e sua quantificação (55).
 Apesar de tais abordagens, amostras de controles positivos como spiking (52) podem ser usados para detectar inibição, diferentes reações de PCR podem não ser igualmente suscetíveis a inibição por substâncias copurificadas em extratos ácido nucleico (56, 57). Consequentemente, é melhor rotineiramente
 usar diluições de ácidos nucleicos para demonstrar que diminuições em Cqs ou números de cópias são consistentes com o resultado esperado e para relatar esses dados.
Transcrição reversa
A etapa de transcrição reversa introduz substancial variação em um ensaio RT-qPCR (58, 59). Por isso, é essencial que uma descrição detalhada do protocolo e reagentes utilizados para converter RNA em cDNA. Esta documentação deve incluir a quantidade de RNA reverso-transcrito, estratégia de priming, tipo de enzima, volume, degrau de temperatura e duração da transcrição reversa. Recomenda-se que a transcrição reversão passa ser realizado em duplicata ou triplicata e que a concentração total de RNA seja a mesma em cada amostra (58).
qPCR
As seguintes informações devem ser fornecidas para Ensaios qPCR: números de acesso ao banco de dados de cada alvo e gene de referência, as localizações do exon de cada primer e qualquer sonda, as seqüências e concentrações de cada oligonucleótido, incluindo as identidades, posições e ligações de quaisquer corantes e / ou bases. 
Também são necessários a identidade e concentração da polimerase, a quantidade de modelo (DNA ou cDNA) em cada reação, a concentração de Mg2, as composições químicas exatas do tampão (sais, pH, aditivos) e o volume de reação. Os investigadores também devem identificar o instrumento que eles usaram e documentaram todos os ciclos de PCR e condições. Porque os consumíveis utilizados afetam ciclagem térmica, é necessário identificar o uso de tubos, tiras ou placas individuais e seus fabricantes. O grau de transparência do plasticware usado, por exemplo, branco ou claro, também é importante, porque plásticos diferentes exibem diferenças reflexão de substanciais e sensibilidade à fluorescência (60). Quando as placas são usadas, o método de selagem (ligação de calor vs adesivos) pode afetar a evaporação de amostras no perímetro da placa e, portanto, deve ser documentado. Porque a eficiência da PCR é altamente dependente dos primers usados, suas sequências devem ser publicadas. Este requisito é perfeitamente viável mesmo com primers, porque há um precedente para empresas para fazer suas seqüências de primer e sonda disponível (http://www.primerdesign.co.uk/research_with_integrity.asp). 
Além disso, a submissão a bases de dados públicas como RTprimerDB é fortemente encorajado; sobre tempo, essas bases de dados poderiam se tornar universaiscâmaras de com pensação.
 ESTRUTURA SECUNDÁRIA
A estrutura do alvo de ácido nucleico (por exemplo, haste e estrutura secundária de RNA do laço) tem um impacto substancial sobre a eficiência da transcrição reversa e da PCR. Portanto, as posições dos primers, sondas e os amplicons de PCR devem receber a dobra de modelos de RNA em consideração. Sequências devem ser verificadas com software de dobragem de ácidos nucleicos, por exemplo, mfold para DNA (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi) ou RNA (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold / cgi-bin / rna-form1-2.3.cgi). Idealmente, o dobramento estruturas devem ser disponibilizadas aos revisores. 
 ESPECIFICIDADE
Ferramentas in silico como BLAST ou especificidade equivalente as pesquisas são úteis para o desenho do ensaio. Qualquer apreciável homologia a pseudogenes ou outros alvos inesperados deve ser documentado e fornecido como sequências alinhadas para revisão; no entanto, a especificidade deveser validada empiricamente com evidência experimental direta (eletroforese em gel, perfil de fusão, sequenciamento de DNA, tamanho do fragmento amplificado e / ou digestão com enzimas de restrição).
Algoritmos para prever um oligonucleotídeo temperatura de fusão (Tm) são úteis para o projeto inicial. 
 CONTROLADORES E CALIBRADORES DE QUANTIFICAÇÃO
Além do controle de transcrição sem reversão em ensaios RT-qPCR mencionados acima, controles adicionais e / ou calibradores de quantificação são necessários para todas as reações qPCR. Os NTCs detectam contaminação por PCR quando sondas são usadas e também podem distinguir produtos de amplificação (por exemplo, dímeros de iniciadores) dos produtos de PCR pretendidos em reações SYBR Green I. Os NTCs devem ser incluídos em cada placa ou lote de amostras e as condições para a rejeição de dados estabelecido. 
Por exemplo, os NTCs com Cqs 40 poderiam ser ignorado se o Cq para a menor concentração desconhecida é 35.
Controles positivos na forma de ácidos nucleicos extraídos de amostras experimentais são úteis para monitorar variação do ensaio ao longo do tempo e são essenciais quando as curvas de calibração não são realizadas em cada execução. 
Calibradores de quantificação podem ser moléculas alvo purificadas, tais como RNA sintético ou oligonucleotídeos de DNA abrangendo o amplicon de PCR completo, plasmídeo construções de DNA, cDNA clonado em plasmídeos, RNA transcritos in vitro, conjuntos de RNA de referência, RNA e DNA de amostras biológicas específicas, ou internacionalmente padrões biológicos reconhecidos (à medida que se tornam acessível). 
As diluições devem ser realizadas em concentrações de RNAt transportador (levedura ou Escherichia coli a 10-100 ng/L). 
Para detecção de patógenos humanos, calibradores podem ser diluídos em controle negativo de amostra de RNA ou DNA, ou eles podem ser diluídos em plasma humano saudável, após o qual a lise pode ser na presença de RNAt transportador. 
Diluições em série de um modelo particular podem ser preparadas como soluções de estoque que resistem a vários ciclos de congelamento e descongelamento. 
Um lote novo deve ser preparado quando um deslocamento Cq de 0,5 a 1,0 é detectado.
Alternativamente, soluções para curvas de calibração pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e depois descartado.
Para ensaios diagnósticos, o qPCR deve incluir um calibrador verificado independentemente, se disponível, dentro do intervalo linear do ensaio. 
Controles positivo e negativo de extração também são recomendados.
 ENSAIO DE DESEMPENHO 
As seguintes características de desempenho do ensaio devem ser determinadas: eficiência de PCR, faixa dinâmica linear, LOD e precisão.
Eficiência de PCR. 
Nos ensaios robustos e precisos de qPCR são geralmente correlacionados com alta eficiência de PCR. A eficiência é particularmente importante ao relatar concentrações de mRNA para genes alvo em relação de genes de referência. O método ∆∆Cq é um dos meios mais populares de determinar as diferenças nas concentrações entre amostras e baseia-se na normalização com um único gene de referência. A diferença os valores Cq entre o gene-alvo e o valor de gene referência é calculado, e os Cqs dos diferentes as amostras são comparadas diretamente. Os 2 genes devem ser amplificado com eficiências comparáveis para ser exato. O método mais popular não é necessariamente o mais apropriado, porém, e alternativo, modelos quantitativos mais generalizados foram desenvolvidos para corrigir diferenças na eficiência amplificação (62) e permitir o uso de múltiplos genes de referência (30).
A eficiência de amplificação por PCR deve ser estabelecida por meio de curvas de calibração, porque essa calibração fornece uma indicação simples, rápida e reproduzível da eficiência média da PCR, a sensibilidade analítica, e a robustez do ensaio. 
A eficiência da amplificação deve ser determinada a partir da inclinação da porção log-linear da curva de calibração. 
Especificamente, eficiência de PCR= (10-1/slope-1), quando o logaritmo da concentração inicial do modelo é (independente de variável), é traçada no eixo x e Cq (o depende de variável) é traçada no eixo y. O máximo teórico de 1,00 (ou 100%) indica que a quantidade de produto duplica com cada ciclo.
Idealmente, os CIs ou SEs dos meios de eficiências de PCR estimadas são relatados a partir de curvas de calibração replicadas. As curvas de calibração para cada alvo quantificado devem ser incluídas no manuscrito submetido para que estas informações possam ser disponibilizadas aos revisores;
Diferenças de eficiência de PCR produzirá curvas de calibração com diferentes inclinações. Como conseqüência, as diferenças entre os valores Cq dos alvos e as referências não permanecerá constante como os valores dos modelos são variados, e cálculos de concentrações relativas serão imprecisas, produzindo resultados enganosos. 
Os valores Cq 40 são suspeitos devido à implicação da baixa eficiência e geralmente não devem ser relatados; no entanto, o uso de tais cortes Cq arbitrários não é ideal, porque eles podem ser muito baixos (eliminando resultados válidos) ou muito altos (aumentando os resultados falso-positivos) (26).
Faixa dinâmica linear. 
A faixa dinâmica sobre qual a reação é linear (o mais alto ao mais baixo número de cópias quantificáveis ​​estabelecido por meio de curva de calibração) deve ser descrita. Dependendo o modelo usado para gerar curvas de calibração, o faixa dinâmica deve cobrir pelo menos 3 ordens de magnitude e idealmente deve se estender a 5 ou 6 log10 concentrações. O intervalo linear da curva de calibração deve incluir o intervalo para os ácidos nucleicos alvos, sendo quantificado. Porque limites inferiores de quantificação são geralmente mal definidos, a variação na menor concentração afirmou estar dentro do intervalo linear deve ser determinado. Coeficientes de correlação (r2 valores) devem ser relatados e, idealmente, os ICs devem ser fornecidos através de toda a gama dinâmica linear.
LOD. 
O LOD é definido como a menor concentração em que 95% das amostras positivas são detectadas. Em outras palavras, dentro de um grupo de réplicas contendo o alvo em concentrações no LOD, não mais de 5% de reações falhas devem ocorrer. Cópia baixa PCRs são estocasticamente limitados e LODs de 3 cópias por PCR não são possíveis. Se múltiplas reações são realizadas, no entanto, quantificação precisa de menores concentrações e pode ser obtida via PCR digital (29, 63, 64). De fato, calibradores de concentração podem ser verificados por diluição limitante para mostrar que a de reações fracassadas e bem sucedidas segue a distribuição Poisson.
 Precisão. 
Existem muitas explicações para a variação nos resultados qPCR, incluindo diferenças de temperatura afetando a conclusão do anelamento e / ou desnaturação, diferença na concentração introduzida por erros de pipetagem e variação estocástica. Precisão em qPCR normalmente varia com a concentração, diminuindo com o número da cópia. Idealmente, a variação intra-ensaio (repetibilidade) deve ser exibido em números como erro SD barras ou como CIs nas curvas de calibração com amostras replicadas. CVs não devem ser usados ​​com Cqs (29), mas podem ser usado para expressar a variação nos números de cópias ou concentrações. Esta variação técnica deve ser distinguida da variação biológica. Réplicas biológicas pode abordar diretamente a significância estatística das diferenças em resultados de qPCR entre grupos ou tratamentos. Para testes diagnósticos, também pode ser necessário relatar precisão entre ensaios (reprodutibilidade) entre sites e diferentes operadores.
 QPCR MULTIPLEX
A capacidade do multiplex aumenta o poder de análise qPCR (65, 66), particularmente quando aplicado a a detecção simultânea de mutações pontuais ou polimorfismos (67). A Multiplex requer a apresentação de evidências que demonstram essa quantificação precisa de múltiplos alvos em um único tubo não é prejudicada, isto é, que a eficiência do ensaio e o LOD são os o mesmo quequando os ensaios são executados de maneira uniplex. Essa preocupação é de particular importância quando os alvos de abundância apreciavelmente menor são coamplificadas com alvos altamente abundantes.
 Análise de Dados
A análise de dados inclui análise dos dados brutos, uma avaliação de sua qualidade e confiabilidade, e a geração de resultados reportáveis. Vários datacollection as estratégias de processamento foram descritas, e uma avaliação sistemática revelou que os métodos de análise de dados qPCR diferem substancialmente do seu desempenho (68). As informações detalhadas sobre os métodos de análise de dados e a estimativa de confiança é necessária, em conjunto com especificação do software utilizado. Os métodos de identificação de outliers e a disposição de tais dados deve ser especificado. A documentação da precisão do ensaio requer a identificação dos métodos estatísticos utilizados para avaliar variâncias (por exemplo, 95% CIs) e apresentação de as concentrações correspondentes ou valores Cq. 
Tal informação deve incluir a repetibilidade e a reprodutibilidade dos dados, se disponível. como discutido acima, relatar os CVs para Cqs é inadequado (29), porque Cqs sempre será menor (e, portanto, potencialmente enganoso) de CVs calculados para números de cópias. Em formação devem ser fornecidos os métodos utilizados para avaliar a precisão, incluindo a significância estatística e diferenças relatadas entre os grupos.
8.1. NORMALIZAÇÃO
A normalização é um componente essencial de um ensaio qPCR porque este processo controla variações no rendimento de extração, rendimento de transcrição reversa e eficiência da amplificação, permitindo assim comparações de concentrações de RNAm em diferentes amostras. O uso de genes de referência como controles internos é o método mais comum para normalizar RNAm celular, no entanto, embora o uso de genes de referência seja comumente aceito, a normalização mais apropriada é a estratégia (69), sua utilidade deve ser validada experimentalmente para determinados tecidos ou tipos de células e os desenhos experimentais. Infelizmente, embora haja uma maior conscientização da importância da sistemática a validação e, embora o potencialmente altamente enganosa aos efeitos do uso de genes de referência inapropriados para normalização são amplamente conhecidos, estas considerações também ainda são amplamente desconsiderados (70). Consequentemente, muitas análises moleculares ainda contêm dados de qPCR mal normalizados.
A normalização envolve a comunicação dos rácios d concentrações de mRNA dos genes de interesse para aqueles dos genes de referência. Os mRNAs do gene de referência podem ser expressos de maneira estável, e sua abundância deve mostrar correlação forte com as quantidades totais de mRNA presente nas amostras. 
A normalização com um único gene de referência não é aceitável a menos que os investigadores apresentem provas claras para os revisores que confirmam sua expressão invariante nas condições experimentais descritas. O número ideal e escolha de genes de referência deve ser determinado experimentalmente e o método relatado (71-73).
8.2 VARIABILIDADE
A variabilidade inerente dos sistemas biológicos pode rivalizar ou exceder as diferenças experimentais entre os grupos. Esta variação é frequentemente observada quando muitas réplicas são usadas para aumentar a significância estatística do experimento. Embora diferenças entre biológica as réplicas podem ser grandes, números suficientes podem permitir diferenças experimentais menores a serem discernidas.
Uma publicação recente fornece um exemplo de livro didático para lidar com esses dados e como salvá-los biologicamente de ensaios sujeitos a altas taxas da variação biológicas (74). Muitos fatores contribuem para a variação e influenciam o número de réplicas biológicas necessário para atingir um dado poder estatístico. Consequentemente, a análise de potência é útil para determinar o número de amostras necessárias para conclusões válidas.
8.3. ANÁLISE QUALITATIVA
O uso da PCR para detectar apenas a presença de um modelo de ácido nucleico, ao invés de quantificá-lo com precisão, é referida como PCR qualitativa, que é amplamente usado em diagnósticos de patógenos. O problema com qualitativa/estratificação quantitativa de métodos de PCR é que uma resposta sim / não precisa requer informações sobre a sensibilidade de baixo custo do ensaio de PCR. Consequentemente, mesmo um ensaio qualitativo deve fornecer informações sobre as características de desempenho do ensaio, especialmente com relação aos pontos discutidos nas seções. 
Conclusões
A necessidade de garantir medidas de qualidade para os ensaios qPCR e RT-qPCR é bem reconhecido (25, 44, 75-86). A principal diferença entre qPCR e convencional (herdado) ensaios de PCR é a expectativa do potencial do primeiro para quantificar ácidos com precisão.
 Esta diferença deve ser claramente reconhecida, e não se pode assumir que os ensaios de PCR legado pode traduzir diretamente no formato qPCR, fornece uma lista de verificação para os autores que preparam um relatório de uma estudo qPCR. 
Itens considerados essenciais (E) são necessários para permitir que os revisores avaliem o trabalho dos outros pesquisadores para reproduzi-lo. Itens considerados desejáveis ​​(D) também são importantes e devem ser incluídos, se possível, mas eles podem não estar disponíveis em todos os casos. Certamente, é importante aplicar o senso comum: Conformidade com todos os itens da lista de verificação não são necessários para triagem de assinaturas de expressão visando centenas e alvos.
 Uma vez um conjunto mais limitado de alvos (menos de 20) foi identificado, no entanto, o desempenho do ensaio deve ser descrito como detalhado na lista de verificação, que está hospedado em http://www.rdml.org/miqe/.
Em resumo, o propósito destas diretrizes é 3 vezes:
1. Para permitir que os autores projetem e relatem experimentos de qPCR que têm maior valor inerente. 
2. Permitir que os revisores e editores meçam o conteúdo técnico qualidade dos manuscritos submetidos contra um bitola.
3. Facilitar a replicação mais fácil dos experimentos descritos em estudos publicados que seguem estas diretrizes. Como conseqüência, as investigações que usam este tecnologia amplamente aplicada irá produzir dados que são mais uniforme, mais comparável e, finalmente, mais confiável.