Introdução aos Métodos Cromatográficos

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26/03/2013 
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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
CROMATOGRÁFICOS 
Classificação dos métodos analíticos 
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS 
Baseados em propriedades 
físicas (químicas em alguns casos ) 
Chamados de métodos 
de via úmida 
Gravimetria Volumetria Eletroanalítico 
Propriedades 
elétricas 
Espectrométrico 
Propriedades 
ópticas 
Cromatográfico 
Propriedades 
mistas* 
*Separação: interações físico-químicas. 
 Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas. 
Histórico 
Cromatografia 
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: 
Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com 
adsorventes sólidos e solventes variados. 
éter de 
petróleo 
CaCO
3 
mistura de 
pigmentos 
pigmentos 
separados 
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego) 
Definição - Princípio Básico 
 
Cromatografia é um método físico-químico de 
separação de misturas, identificação e 
quantificação de seus componentes. 
• A separação depende da interação dos componentes da 
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. 
A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é 
influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo 
iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e 
solubilidade. 
• A identificação se dá mediante a comparação da 
interação de padrões com as fases estacionárias. 
• A quantificação é feita também pela comparação com 
padrões de concentrações conhecidas, através de 
curvas analíticas. 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
 
• De acordo com o sistema cromatográfico 
 
• Em Coluna 
•Cromatografia Líquida 
•Cromatografia Gasosa 
•Cromatografia Supercrítica 
 
• Planar 
•Centrífuga (Chromatotron®) 
•Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
•Cromatografia em Papel (CP) 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
 
• De acordo com a fase móvel 
 
• Utilização de Gás 
•Cromatografia Gasosa (CG) 
•Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) 
 
• Utilização de Líquido 
•Cromatografia Líquida Clássica (CLC) 
•Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
 
• Utilização de Gás Pressurizado 
•Cromatografia Supercrítica (CSC) 
Cromatografia 
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Classificação das técnicas cromatográficas 
 
• De acordo com a Fase Estacionária 
 
• Líquida 
• Sólida 
• Quimicamente Ligadas 
 
• De acordo com o modo de separação 
 
• Por Adsorção 
• Por Partição 
• Por Troca Iônica 
• Por Afinidade 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
Cromatografia 
Técnica Planar Coluna 
FM 
FE 
Líquido 
Líq Sól 
Gás Líquido 
Líq Sól 
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE 
Exclusão Fase 
Ligada 
Troca 
Iônica 
Sól Líq Afinidade 
Tipo de 
cromato-
grafia 
Analogia 
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo 
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. 
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as 
moscas e abelhas. 
Cromatografia 
Fase estacionária Analitos 
Analogia 
 
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase 
estacionária pode ser suficiente para alterar completamente 
a ordem de eluição de componentes da mistura. 
Cromatografia 
Fase estacionária Analitos 
Cromatografia 
Princípio Básico 
Separação de misturas por interação diferencial dos seus 
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou 
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). 
Cromatografia em papel - CP 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Fase estacionária líquida suportada na celulose. 
Fase móvel 
Separação 
Cromatografia 
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos 
(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom 
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível 
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela. 
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Cromatografia em papel - CP 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Cromatografia 
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem 
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na 
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis. 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser 
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está 
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases 
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Termos e parâmetros técnicos 
Cromatografia solvente
mancha
f ΔS
ΔS
R
s
a
R
af

s
b
R
bf

s
c
R
cf

c 
b 
a 
s 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
FASES ESTACIONÁRIAS 
Sílica (SiO2) 
Alumina (Al2O3) 
Celulose 
Poliamida 
Ativação de 30 a 60 min 
de 105 a 110 oC 
Ativação de 10 min 
a 105 oC 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
ANÁLISE QUALITATIVA 
- Comparação com valores de Rf tabelados 
 
- Comparação com padrão eluído em conjunto 
 
- Extração e aplicação de métodos instrumentais 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
A B Após 
 Eluição 
Amostra não contém a espécie B 
Amostra pode conter a espécie A 
Para se certificar da presença, 
eluir em outros solventes 
Conclusões: 
Amostra 
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Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Solvente 1 Solvente 2 
Cromatografia 
Bi-dimensional 
Cromatografia planar 
Cromatografia 
Chromatotron é uma 
cromatografia de camada 
fina preparativa acelerada 
centrifugamente. Pode 
substituir pequenas colunas e 
HPLC. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO 
Exclusão 
 
 
 
Adsorção 
 
 
Partição 
 
 
 
Troca Iônica 
 
Afinidade 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
ADSORÇÃO 
- Fase Móvel Líq. ou Gás 
- Fase Estacionária Sólida 
Processos de 
Adsorção/Dessorção 
Ligações de hidrogênio; 
Forças de Van der Waals 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Diferença entre Absorção e Adsorção 
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Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
ADSORÇÃO 
Fase Estacionária Sólida: 
Polar 
Aumento da Atividade 
-CO2H > -OH > -NH2 > 
-SH > -CHO > -C=O > 
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH- 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < 
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < 
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < 
Acetato de Etila < Acetona < Etanol < 
Metanol < Ácido Acético 
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente 
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção 
tem sentido amplo: 
a) Função solvente 
• Solubilizar os componentes 
• Ter baixo ponto de ebulição 
b) Função eluente 
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna 
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Usos: 
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar 
reagentes e materiais obtidos em síntese. 
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa 
e analítica. 
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de 
esteróides de urina ou de sangue, etc. 
ADSORÇÃO 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PARTIÇÃO 
Fase Móvel Gasosa 
Fase Estacionária Líquida 
Processos de Solubilidade 
O processo de partição é 
intrafacial e a volta de cada 
componente para a fase móvel 
dependeda sua volatilidade. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PARTIÇÃO 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Líquida 
Processos de Solubilidade 
O processo de partição é 
intrafacial e a volta de cada 
componente para a fase móvel 
depende da sua solubilidade. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
TROCA IÔNICA 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Sólida 
Processos de Troca Iônica 
Adsorção reversível e 
diferencial dos íons da fase 
móvel pelo grupo trocador 
da matriz 
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica 
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de 
extraordinário valor em processos analíticos. 
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Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Maior Interação 
• Íons de alta carga 
• Íons de menor tamanho 
TROCA IÔNICA 
Resinas Catiônicas 
e Aniônicas 
FE altamente carregada 
F
lux
o d
a F
M
 
A diferença de afinidade entre 
os íons da FM pode ser 
controlada por pH e força iônica 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária em Gel 
Enquanto as partículas menores penetram nas 
cavidades, as maiores vão sendo eluídas 
contornando as estruturas moleculares da FE. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, 
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de 
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado 
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, 
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. 
- Separação de tamanhos específicos 
- Separação de polímeros e proteínas 
- Determinação de Massa Molar 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Características 
desejáveis para os Géis 
-Inércia Química: 
Não pode haver uma interação 
química entre a matriz e o soluto. 
-Estabilidade: 
O gel deve suportar uso contínuo 
quanto mantido em condições 
brandas de temperatura e pH. 
-Baixo teor de íons: 
Grupos carregados interferem no 
processo de separação. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Tipos de Géis 
Dextrano (Sephadex) 
Poliacrilamida 
Ágar e Agarose 
F
lux
o d
a F
M
 
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Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Sólida 
Propriedades 
Biológicas e 
Funcionais 
AFINIDADE 
Cromatografia 
Teoria Básica 
SOLUTO 
FASE 
ESTACIONÁRIA 
FASE 
MÓVEL 
Teoria Básica 
Cromatografia 
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o 
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase 
móvel: 
 
 FM
FE
C A
A
K 
KC = Constante de Distribuição 
[A]FE = concentração do analito na FE 
[A]FM = concentração do analito na FM 
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito 
sorvido na FE e dissolvido na FM. 
MENOR RETENÇÃO !!! 
Volatilidade [A]FM 
Afinidade pela FE [A]FE 
Quantificação da eficiência 
Cromatografia 
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados 
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: 
Cada “estágio” de equilíbrio é 
chamado de PRATO TEÓRICO 
O número de pratos teóricos 
de uma coluna (N) pode ser 
calculado por: 
Coluna mais 
eficiente 
tR 
wb 
N 
Quantificação da eficiência 
Cromatografia 
ALTURA EQUIVALENTE A UM 
PRATO TEÓRICO (H) 
“Tamanho” de cada estágio de 
equilíbrio 
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas 
como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais 
eficientes 
(L = comprimento da coluna) 
Valores típicos de H e N: 
dC df H N
0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
2,16 5% 0,500 4000
Capilares, L = 30 m 
Empacotadas, L = 2 m 
dc = diâmetro da coluna em mm 
df = espessura da fase estacionária em m 
Cromatografia em fase gasosa 
Fase estacionária 
Fase móvel Separação 
Cromatografia 
Detecção 
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Cromatografia em fase gasosa 
Cromatografia 
Coluna: contendo a 
fase estacionária está 
submetida à 
temperaturas 
controladas 
Fase móvel: 
gás inerte 
Detector: 
submetido à 
temperatura 
controlada 
Injetor: submetido 
à temperatura 
controlada 
Cromatografia Gasosa 
Aplicabilidade 
Quais misturas podem ser 
separadas por CG ? 
Misturas cujos constituintes sejam 
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) 
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de 
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. 
DE FORMA GERAL: 
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos 
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que 
sejam termicamente estáveis. 
Requisitos - Gás de arraste (FM) 
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem 
com a fase estacionária ou superfícies do 
instrumento. 
PURO: Deve ser isento de impurezas que 
possam degradar a fase estacionária. 
Impurezas típicas em 
gases e seus efeitos: 
oxida / hidrolisa algumas FE 
incompatíveis com DCE 
H2O, O2 
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC 
Cromatografia Gasosa 
Requisitos - Gás de arraste (FM) 
CUSTO: Gases de 
altíssima pureza 
podem ser muito 
caros. 
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda 
um gás de arraste específico para melhor funcionamento. 
Seleção de Gases de 
Arraste em Função 
do Detector: 
He , H2 DCT 
DIC N2 , H2 
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4 
C
U
S
T
O
 
PUREZA 
A 
B 
C 
A = 99,995 % (4.5) 
B = 99,999 % (5.0) 
C = 99,9999 % (6.0) 
Cromatografia Gasosa 
Injetor 
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou 
VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução 
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica 
Injeção instantânea: 
Injeção lenta: 
t = 0 
t = x 
t = 0 
t = x 
Cromatografia Gasosa 
Injetor “on column” 
1 
2 
3 
4 
1 - Septo (silicone) 
 
2 - Alimentação de gás de 
arraste) 
 
3 - Bloco metálico aquecido 
 
4 - Ponta da coluna 
cromatográfica 
Cromatografia Gasosa 
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Injetor “on column” 
1 2 3 
1 - Ponta da agulha 
da microsseringa é 
introduzida no início 
da coluna. 
2 - Amostra injetada 
e vaporizada 
instantaneamente no 
início da coluna. 
3 - “Plug” de vapor 
de amostra forçado 
pelo gás de arraste a 
fluir pela coluna. 
Cromatografia Gasosa 
Parâmetros de injeção 
Cromatografia Gasosa 
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente 
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem 
decomposição. 
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do 
componente menos volátil. 
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado 
físico da amostra. 
COLUNA 
Amostras 
Gasosas 
Amostras 
Líquidas 
empacotada 
 = 3,2 mm (1/4”) 
0,1 mL ... 50 mL 0,2 L ... 20 L 
capilar 
 = 0,25 mm 1 L ... 100 L 0,01 L ... 3 L 
Sólidos: 
convencionalmente 
se dissolve em um 
solvente adequado e 
injeta-se a solução 
Cromatografia Gasosa 
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L 
êmbolo 
corpo (pirex) 
agulha (inox 316) 
Microsseringa de 
10  L: 
Microsseringa de 1  L (seção 
ampliada): 
corpo 
guia 
êmbolo (fio de aço 
soldado ao guia) 
agulha 
Microsseringas para injeção 
Cromatografia Gasosa 
Colunas 
EMPACOTADA 
 = 3 a 6 mm 
L = 0,5 m a 5 m 
Recheada com sólido pulverizado 
(FE sólida ouFE líquida 
depositada sobre as partículas do 
recheio) 
CAPILAR 
 = 0,1 a 0,5 mm 
L = 5 m a 100 m 
Paredes internas recobertas com 
um filme fino (fração de m) de 
FE líquida ou sólida 
Cromatografia Gasosa 
Temperatura da coluna 
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora 
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE 
VAPOR (p0). 
p0 = f 
Estrutura química do analito 
Temperatura da coluna 
Temperatura 
da 
coluna 
Pressão 
de 
vapor 
Velocidade 
de 
migração 
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE 
(MENOR RETENÇÃO) 
Cromatografia Gasosa 
Temperatura da coluna 
AUMENTO DA 
TEMPERATURA DA COLUNA 
CONTROLE CONFIÁVEL 
DA TEMPERATURA DA 
COLUNA É ESSENCIAL 
PARA OBTER BOA 
SEPARAÇÃO EM CG 
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Cromatografia Gasosa 
Programação linear de temperatura 
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito 
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: 
TCOL 
BAIXA: 
- Componentes mais voláteis são 
separados 
- Componentes menos voláteis 
demoram a eluir, saindo como 
picos mal definidos 
TCOL ALTA: 
- Componentes mais voláteis não 
são separados 
- Componentes menos voláteis 
eluem mais rapidamente 
Cromatografia Gasosa 
Programação linear de temperatura 
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: 
Consegue-se boa 
separação dos 
componentes da 
amostra em menor 
tempo 
TEMPO 
T
E
M
PE
R
A
T
U
R
A
 
tINI tFIM 
TINI 
TFIM 
R 
TINI - Temperatura Inicial 
TFIM - Temperatura Final 
tINI - Tempo Isotérmico Inicial 
tFIM - Tempo Final do Programa 
R - Velocidade de Aquecimento 
Cromatografia Gasosa 
P
r
o
g
r
a
m
a
ç
ã
o
 
l
i
n
e
a
r
 
d
e
 
t
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a 
 
 
a) I
s
o
t
é
r
m
i
c
o
 
a
 
4
5
 
º
C
; 
b) i
s
o
t
é
r
m
i
c
o
 
a
 
1
4
5
 
°
C
;
 
c) p
r
o
g
r
a
m
a
d
o
 
d
e
 
3
0
 
º
C
 
a
 
1
8
0
 
º
C 
Cromatografia Gasosa 
Programação linear de temperatura 
VARIAÇÕES DE VAZÃO 
DO GÁS DE ARRASTE: A 
viscosidade de um gás 
aumenta com a temperatura. 
viscosidade vazão 
DERIVA (“DRIFT”) NA 
LINHA DE BASE: Devido ao 
aumento de volatilização de 
FE líquida 
Possíveis problemas associados à PLT: 
Cromatografia Gasosa 
Fase Estacionária 
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível 
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) 
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente 
com os componentes da amostra. 
FE Seletiva: 
separação adequada dos constituintes 
da amostra 
FE pouco Seletiva: 
má resolução mesmo com coluna de 
boa eficiência 
Cromatografia Gasosa 
Fase estacionária sólida 
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE 
sólida é a ADSORÇÃO 
A adsorção ocorre na 
interface entre o gás de 
arraste e a FE sólida 
• Sólidos com grandes áreas superficiais 
(partículas finas, poros) 
• Solutos polares 
• Sólidos com grande número de sítios 
ativos (hidroxilas, pares de elétrons...) 
ADSORÇÃO 
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Cromatografia Gasosa 
Fase estacionária líquida 
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE 
líquida é a ABSORÇÃO 
A absorção ocorre no interior 
do filme de FE líquida 
(fenômeno INTRAfacial) 
• Filmes espessos de FE líquida 
• Grande superfície líquida exposta ao gás 
de arraste 
• Interação forte entre a FE líquida e o 
analito (grande solubilidade) 
ABSORÇÃO 
Cromatografia Gasosa 
Fase estacionária quirais 
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO 
SIMILARES  FE convencionais não interagem diferencialmente com os 
isômeros óticos. 
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos 
têm atividade farmacológica. 
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de 
origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias 
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas). 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal 
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. 
Características ideais: 
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias 
ordens de grandeza. 
4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 
400 ºC. 
5.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 
7.Similaridade de resposta para todos os solutos. 
8.Não destrutivo. 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA 
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. 
REGISTRO 
DE 
SINAL 
ANALÓGICO 
Registradores XY 
DIGITAL 
Integradores 
Computadores 
Cromatografia Gasosa 
Detectores 
UNIVERSAIS: 
Geram sinal para 
qualquer 
substância eluída. 
SELETIVOS: 
Detectam apenas 
substâncias 
com determinada 
propriedade 
físico-química. 
ESPECÍFICOS: 
Detectam 
substâncias que 
possuam 
determinado 
elemento 
ou grupo 
funcional em suas 
estruturas 
DCT DCE DNP 
Cromatografia Gasosa 
Detectores - Funcionamento 
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): 
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por 
eluatos altamente eletrofílicos. 
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU 
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. 
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): 
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de 
H2 + ar. 
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação 
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por 
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de 
moléculas com N e P. 
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Cromatografia Gasosa 
Detectores – Limites de detecção 
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): 
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos 
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 
a 1 pg com linearidade até ng. (104) 
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU 
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. 
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104). 
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): 
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha 
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. 
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108). 
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico. 
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg 
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105) 
Cromatografia Gasosa 
Detectores – Espectrometria de massas 
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos 
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o 
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância 
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. 
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de 
determinada razão m/z. 
Detecção 
TIC 
Universal 
Similar a DCT 
SIM 
Seletivo 
Maior Sensibilidade 
Cromatografia Gasosa 
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. 
T
E
M
PO
 
CONTAGENS 
M
A
S
S
A
 / C
A
R
G
A
 
CONTAGENS 
Cromatograma de íons totais: 
TIM ou TIC 
Em cada posição do 
cromatograma tem-se 
um espectro de massa. 
Detectores – Espectrometria de massas 
Cromatografia Gasosa 
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. 
T
E
M
PO
 
CONTAGENS 
Cromatograma de íons 
selecionados: SIM 
Em cadaposição do 
cromatograma tem-se 
o sinal somente da m/z 
selecionada. MASSA / CARGA 
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 
Oferece a vantagem 
de registrar 
somente o sinal do 
constituinte de 
interesse, sendo 
“cego” para os 
demais. 
Detectores – Espectrometria de massas 
Cromatografia Gasosa 
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM. 
CG EM 
Vácuo 
Separador Molecular 
O gás de arraste leve 
(He) difunde mais 
rapidamente que o analito 
e tende a ser drenado 
para o vácuo. 
Câmara 
de Ionização 
Coluna 
Capilar 
Interface Capilar Direta 
Com colunas capilares a 
vazão baixa de gás de 
arraste pode ser drenada 
pelo sistema de vácuo. 
Detectores – Espectrometria de massas 
Cromatografia Gasosa 
Análise qualitativa 
t
R
 
t
M
 
t
R ’ =
 t
R
 - t
M
 
T
E
M
P
O
 
SINAL 
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o 
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: 
tR = Tempo de Retenção (tempo 
decorrido entre a injeção e o ápice 
do pico cromatográfico) 
tM = Tempo de Retenção do 
Composto Não-Retido (tempo 
mínimo para um composto que não 
interaja com a FE atravesse a 
coluna) 
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado 
(tempo médio que as moléculas do 
analito passam sorvidas na FE) 
26/03/2013 
13 
Cromatografia Gasosa 
Análise qualitativa 
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m 
Detector FID: 250 ºC 
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC 
Volume injetado: 1 L 
Como se explica esta 
ordem de eluição? Mistura de benzeno, n-propanona, 
n-propanol, n-butanol, isobutanol e 
n-pentanol. A n-propanona elui primeiro 
devido à sua maior volatilidade. 
 O benzeno em segundo devido sua 
natureza apolar (menor ). 
 Para os demais compostos, cujas 
diferenças de polaridade não são 
elevadas, a volatilidade se torna o 
principal parâmetro que define a 
ordem de eluição. 
Cromatografia Gasosa 
Análise quantitativa 
T
E
M
P
O
 
SINAL 
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: 
 
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois 
a banda necessita ser perfeitamente simétrica. 
• Área da banda cromatográfica. 
Altura Área 
Cromatografia Gasosa 
Análise quantitativa 
tempo 
C
oncentração 
Área 
amostra 
Cromatografia Gasosa 
Análise quantitativa 
MASSA 
Á
R
E
A
 
A partir de certo 
ponto o sinal não 
aumenta mais 
linearmente 
O fim da zona de linearidade pode 
ser detectado quando a razão 
(Área / Massa) diverge em mais de 
5 % da inclinação da reta na 
região linear: 
MASSA 
Á
R
E
A
 / M
A
S
S
A
 0,95 S 
1,05 S 
Cromatografia Gasosa 
tempo 
amostra 
C
oncentração A
d
icionad
a 
Área 
concentração 
na amostra 
Análise quantitativa Cromatografia em fase líquida 
Cromatografia Líquida 
26/03/2013 
14 
Cromatografia Líquida - CLAE 
Aplicabilidade 
Quais misturas podem ser 
separadas por CLAE ? 
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar 
de 32 até 4000000. 
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um 
líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. 
DE FORMA GERAL: 
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos 
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de 
volatilidade ou de estabilidade térmica. 
Cromatografia Líquida 
Tipos e 
Aplicações da 
Cromatografia 
Líquida 
Insolúvel em água 
Solúvel em água 
Aumento de 
p o l a r i d a d e 
Polar não iônico 
Apolar 
Iônico 
M
assa m
ole
cular 
102 
103 
104 
105 
106 
Troca 
iônica 
Partição 
Partição 
em fase 
reversa 
Partição 
em fase 
normal 
Exclusão 
Permeação em 
gel 
Filtração em gel 
Adsorção 
Componentes 
típicos - CLAE 
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida 
Esquema de um equipamento para CLAE 
Cromatografia Líquida 
Requisitos dos sistemas de bombeamento 
1 – Geração de pressões até 6.000 psi 
2 – Saída com ausência de pulsos 
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 
0,5% ou melhor 
5 – Componentes resistentes à corrosão 
Bomba recíproca (também são chamadas de 
bombas de pistão ou de diafragma) 
Cromatografia Líquida 
Suportam pressões de até 7.000 psi 
Volumes típicos: 5 a 500 L 
Microamostragem: 0,5 a 5 L 
Sistemas de injeção de amostras 
26/03/2013 
15 
Cromatografia Líquida 
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos 
produzidos pela programação de temperatura na CG. 
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a 
polaridade requerida na separação. 
Fase móvel para CLAE 
 Eluição isocrática: Quando a separação é feita utilizando um 
único solvente de composição constante. 
 Eluição com gradiente: São utilizados dois ou três sistemas de 
solventes que diferem bastante entre si em polaridade. 
Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é 
variada de modo programado, de forma contínua ou em 
passos. 
Cromatografia Líquida 
Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa 
Detector fluorescência: 
excit. 334 nm – emis. 425 nm 
Cromatografia Líquida 
Colunas para CLAE 
As colunas geralmente são 
construídas de aço inox, embora 
tubos de vidro com paredes 
resistentes sejam encontrados 
ocasionalmente. No entanto, estes 
últimos são restritos a pressões 
mais baixas do que 600 psi. 
Existem comercialmente centenas de colunas 
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase 
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares. 
Cromatografia Líquida 
Colunas para CLAE 
Pré-coluna 
•Remoção de material particulado 
•Contaminantes do solvente 
•Contaminantes da amostra 
•Saturar a FM com a FE 
Aumenta a vida útil da coluna 
COLUNAS TÍPICAS 
•Material: aço inox 
•Comprimento: 10 a 30 cm 
•Diâmetro: 4 a 10 mm 
•FE: Partículas de 5 a 10 m 
•Eficiência: 40 mil a 60 mil 
pratos/metro 
Cromatografia Líquida 
Separação isocrática de alta velocidade 
1– p-xileno 
2- anisol 
3- acetato de benzila 
4- dioctil-ftalato 
5- dipentil-ftalato 
6- dibutil-ftalato 
7- dipropil-ftalato 
8- dietil-ftalato 
- 4 cm de comprimento 
- 0,4 cm d.i. 
- FE: spherisorb 3 m 
Coluna de alta 
velocidade e 
alta eficiência 
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 
100.000 pratos/metro 
• Pelicular: 
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros 
típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: 
• Sílica 
• Alumina 
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno 
• Resina trocadora de íons 
 
• Partícula porosa: 
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As 
partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular. 
Cromatografia Líquida 
Basicamente são dois tipos de FE: 
Fase estacionária para CLAE 
26/03/2013 
16 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
As características desejáveis para os detectores para 
CLAE não são diferentes daquelas para CG. 
Existem dois tipos de detectores: 
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou 
constante dielétrica). 
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). 
 
Características ideais: 
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de 
grandeza. 
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 
6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 
7.Não destrutivo. 
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão. 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
• Absorbância• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105 
• IV 
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103 
• Índice de refração (universal) – 
S: 10-7 g/mL – FL: 104 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. 
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores 
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta 
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. 
• Amperométricos 
• Coulométricos 
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104 
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
• Espectrometria de massa - universal 
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa 
potencializa a técnica de separação e quantificação 
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente 
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. 
Interface CL-EM 
Cromatografia Líquida 
Detectores 
• Espectrometria de massa 
T
E
M
PO
 
CONTAGENS 
M
A
S
S
A
 / C
A
R
G
A
 
CONTAGENS 
TEMPO 
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 
MASSA / CARGA 
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 
TIC 
SIM 
Cromatografia Líquida 
Tipos de CLAE 
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como 
um gás ideal e não contribui para o processo de 
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto 
quanto a FE com os componentes da amostra. 
 
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em 
CLAE um tanto mais complexo que na CG. 
26/03/2013 
17 
Cromatografia Líquida 
Tipos de CLAE 
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre 
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do 
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química. 
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase 
reversa. 
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água) 
 FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) 
 O componente menos polar é eluído primeiro por ser o 
mais solúvel na fase móvel. 
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) 
 FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) 
 O componente mais polar aparece primeiro e o aumento 
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição. 
Cromatografia Líquida 
Tipos de CLAE 
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase 
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses 
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil) 
Cromatografia Líquida 
Tipos de CLAE 
Campo Misturas típicas 
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, 
analgésicos 
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios 
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, 
aflatoxinas, aditivos 
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, 
propelentes, corantes industriais 
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas 
policloradas) 
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, 
narcóticos 
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, 
extratos de urina, estrógenos 
Cromatografia Líquida 
Tipos de CLAE 
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma 
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu 
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de 
HPLC. 
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade 
de troca iônica. 
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, 
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, 
são capazes de promover a separação de acordo com os 
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o 
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a 
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS. 
Para refletir e responder: 
Duas substâncias diferentes com a mesma concentração 
apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? 
 
Cromatografia 
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam 
com o aumento da concentração. A área sob a banda 
cromatográfica de duas substâncias diferentes 
dependerá da resposta do detector para aquele tipo 
de substância, independentemente do tipo de 
detector utilizado. 
Para refletir e responder: 
A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de 
analito? 
 
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os 
casos em que isto ocorre? 
Cromatografia