CITOMETRIA DE FLUXO Aula prática

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CITOMETRIA DE FLUXO
Aplicações práticas
Patrícia Cisneiros dos Santos
Bióloga- UCSAL
Mestranda do curso de Imunologia-UFBa
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PRINCÍPIOS BÁSICOS DE 
CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA FLUXO 
 
 
 Célula Medida Movimento
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
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ANTICORPOS MONOCLONAIS
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ANTICORPOS MONOCLONAIS
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CITÔMETRO DE FLUXO
CITÔMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
SISTEMA ÓTICO
 SISTEMA ELETRÔNICO
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SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.
SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR. 
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CÂMARA DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
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Low Sample Pressure 12µl/min
Sample
Laminar Flow
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
Sheath
Sheath
Sample
FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH” 
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample Pressure 60µl/min
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SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
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FACSCalibur
FL1
 
Red Diode Laser ~635 nm
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
Fluorescence Collection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
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488 nm Blue Laser
FSC Diode
Focusing Lens
FL2
530/30
Beam Combiner
SISTEMA ÓTICO
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Filtros Ópticos – coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido.
Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico.
SP 500
LP 500
BP500/30
	Longpass	Shortpass	Bandpass
460 500 540
460 500 540
460 500 540
Filtro
Detector – célula fotoelétrica
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ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
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SISTEMA ELETRÔNICO
CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
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A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro
 Parâmetro 1 	FSC
 Parâmetro 2	SSC
 Parâmetro 3	FL1
 Parâmetro 4	FL2 
 Parâmetro 5	FL3
SISTEMA ELETRÔNICO
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FLUORESCÊNCIA
O que é a fluorescência ?
Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser
Luz Fluorescente emitida
 de menor energia e maior comprimento de onda
Fluoresceína
 = 530 nm
Luz Incidente de maior energía
Fluorocromo
 = 480 nm
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FLUORESCÊNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde.
O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja.
O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.
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SISTEMA ELETRÔNICO
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DISPERSÃO
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DISPERSÃO:
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Visão dos dados coletados
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ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos.
CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas
CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.
CD19- presente em mais de 95% das células B.
CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico.
CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.
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CD10
CD2
CD20
CD3
CD7
CD19
CD22
CD23
CD26
CD5 
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual mínima
CD3
CD7
HLA DR 
CD 42a 
CD 61
CD19 
CD33 
CD13 
CD14
 CD34 
Leucemias mielóides
CD3 
CD7 
CD2 
CD19 
CD5 
CD56
Linfomas e Mielomas 
LEUCEMIAS
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APLICAÇÕES CLÍNICAS
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima
- Análise de reticulócitos
- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Análise do conteúdo de DNA
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão
linfocitária
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OBRIGADA A TODOS!
OBRIGADA A TODOS!
	QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA: 
	A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO.
 	A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA.