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1 Mutações e Danos no DNA Mecanismos de Reparo QBQ317N Aula 5 Mutações: modificações na sequência de bases no DNA 2 Danos no DNA podem gerar mutações ou bloqueio da replicação e morte celular Portanto, os danos precisam ser removidos Reparo Fontes de mutações no DNA Espécies reativas de oxigênio (ROS) troca/adição/perda de nucleotídeo(s) Mutação de ponto Um nucleotídeo alterado Inserção Nucleotídeos inseridos a mais no DNA Deleção Nucleotídeos retirados do DNA Mutações: modificações na sequência de bases no DNA 3 purina x purina pirimidina x pirimidina purina x pirimidina pirimidina x purina Mutações: Classificação quanto à substituição de bases Mutações podem resultar ou não na alteração da sequência proteica codificada 4 Erros de replicação inserção/deleção de bases por deslizes da DNA polimerase modificações tautoméricas das bases modificações químicas espontâneas Danos no DNA causados por agentes físicos (UV, raio- X) ou químicos (espécies reativas de oxigênio, agentes alquilantes, etc) Se os mecanismos de reparo falham, surgem mutações Como as mutações aparecem? Formas tautoméricas das bases do DNA 5 Pareamento errôneo na replicação implica em mutações nas próximas gerações Forma tautomérica (imino) de adeninacitosina 6 Pareamento errôneo na replicação implica em mutações nas próximas gerações Forma tautomérica (imino) de adeninacitosina Alterações químicas espontâneas (por hidrólise) nas bases também resultam em pareamento incorreto durante a replicação: • desaminação • despurinação 7 Desaminação espontânea de bases resulta em pareamento incorreto Despurinação (espontânea) do DNA 8 Sítio AP DNA polimerase pode inserir qualquer base na fita filha ou pode haver um bloqueio da replicação Despurinação (espontânea) do DNA Formas tautoméricas formas instáveis das bases Desaminação espontânea hidrólise e perda de um NH3 de A, C ou G Despurinação espontânea hidrólise do nucleotídeo, com perda de A ou G Resumindo: alterações espontâneas 9 Danos no DNA causados por agentes químicos ou físicos exógenos Agentes químicos: precursores de ácido nitroso Conservantes de alimentos Desaminação da citosina por ácido nitroso 10 Desaminação da citosina por ácido nitroso mutação CG TA Desaminação da adenina por ácido nitroso mutação AT CG 11 Guanina é alvo de diversas modificações químicas potencialmente mutagênicas Agentes alquilantes: Modificação de bases CnH2n+1 12 Metilação por metil- nitrosoguanidina (agente alquilante) mutação GC AT Mutação induzida pela incorporação de análogos das bases 5-bromouracila é um análogo da Timina, que normalmente pareia com a Adenina O tautômero enol da 5-BrU pareia com a guanina, causando a transição TA CG 5-Bromouracila Tautômero enólico Guanina 13 Moléculas que intercalam no DNA também são agentes mutagênicos: inserção ou deleção de bases Laranja de acridina 9-amino-(N-(2-dimetilamino etil)acridina-4-carboxamida Aflatoxina é produzida por fungo (Aspergillus flavus) que contamina sementes e cereais Metabolização no fígado gera um composto altamente reativo que alquila bases do DNA ou intercala-se no DNA 14 Como testar se um composto é mutagênico? http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40054/title/Mutagens-and-Multivitamins/ Junho 2014 Teste de Ames 15 Teste de Ames para agentes mutagênicos Teste de Ames para agentes mutagênicos Revertentes: Mutações espontâneas Concentrações decrescentes de agente mutagênico +++ ++ + Meio sem Histidina Disco de papel com composto a ser testado 16 Dímero de timinas: Luz UV induz a ligação covalente entre duas pirimidinas adjacentes Mutações induzidas por radiações ionizantes e não ionizantes (ex: UV) 17 Distorção na estrutura da dupla-hélice UV pode continuar causando dano horas após a exposição 18 Front. Physiol., 06 October 2015 | https://doi.org/10.3389/fphys.2015.00276 UV pode continuar causando dano horas após a exposição Diferentes agentes mutagênicos alteram o DNA e ocasionam diferentes tipos de danos. Cada dano pode levar a um tipo de mutação. DNA está sujeito a danos desaminação, alquilação e oxidação de bases ausência de purinas dímeros de timina bases mal- pareadas (mismatch) ligações covalentes entre as fitas quebras das fitas 19 Cada tipo de dano requer um mecanismo de reparo do DNA Por que é importante reparar os danos no DNA? 20 Deficiências no reparo do DNA: associadas a câncer, imunodeficiência e outras síndromes Replicação Reparo Recombinação Metabolismo do DNA 21 Etapas básicas dos processos de reparo: 1) Reconhecimento 2) Excisão 3) Síntese 4) Ligação Comuns a quase todos os sistemas! É a lógica geral destes processos! Exceção é o reparo direto • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo por excisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli 22 Logo após replicação Corrige erros que escaparam da atividade revisora da DNA polimerase Reparo para correção de mal-pareamento mismatch repair (MMR) Reparo de Mismatches 23 Reparo de Mismatches Como ocorre a discriminação entre a fita nova (tem o erro) e velha? 24 25 • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo por excisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli Reparo por excisão de bases (BER) Remoção da base modificada ex: Uracila no DNA Proteínas envolvidas: DNA glicosilases Retiram a base modificada específicas para cada modificação AP endonuclease Quebra ligação fosfodiéster DNA polimerase I Adiciona novos nucleotídeos DNA ligase Sela a fita 26 • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo por excisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli 27 Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) Lesões que causam mudanças estruturais no DNA ex: dímeros de pirimidina ABC exinuclease (UvrABC) Helicase (UvrD) DNA polimerase I DNA ligase helicase 28 NER: bacteriano x humano Deficiências no NER causam Xeroderma pigmentoso e Síndrome de Cockayne Doenças autossômicas recessivas Hipersensibilidade a luz solar (luz ultravioleta) Lesões cutâneas, incluindo câncer de pele Alterações oftalmológicas Alterações neurológicas Aumento do risco de neoplasias malignas http://revistapesquisa.fapesp.br/2012/09/14/luta-contra-o-sol/ http://g1.globo.com/goias/noticia/2014/05/povoado-em-goias-tem-maior- taxa-mundial-de-doenca-rara-de-pele.html 29 Genes mutados em XP e SC DNA Repair Crème provides a concentrated amount of Gen IV Technology. It uses special enzymes and biotechnology to minimize the visible signs of aging, promote vibrant, youthful skin, and restore and revitalize your appearance. DNA Repair Crème contains the T4 Endonuclease V enzyme. This enzyme is derived through a bio-fermentation process that delivers unique and special reparative enzymes to support the skin’s natural defense against UV radiation and other harmful environmental agents! http://www.youtube.com/watch?v=axFJA4-SzYg 30 • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo porexcisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli Foto-reativação enzimática Fotoliases reparam dímeros de pirimidina Enzimas que removem grupos alquil: O6 - metilguanina DNA metiltransferase Sistemas de reparo direto em E. coli 31 Reparo de dímeros de pirimidinas por foto-reativação Fotoliase Enzima ativada por luz visível Ausente apenas em mamíferos placentários O6 - metilguanina DNA metiltransferase: “enzima” não se recupera Reparo de bases alquiladas 32 • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo por excisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli Resolve bloqueio da replicação DNA polimerase IV Passível de erro Incorpora nucleotídeos aleatórios Fonte de variabilidade genética? Reparo por síntese translesão 33 • Mismatch repair (“reparo de pareamento errado”) • Reparo por excisão de base (BER) • Reparo por excisão de nucleotídeo (NER) • Reparo direto • Reparo por síntese translesão • Reparo por recombinação Tipos de sistemas de reparo em E. coli Próxima aula Células têm vários sistemas de reparo de DNA: - Reparo de pareamento errado (MMR) é dirigido pela não metilação transitória de sequências GATC na fita recém sintetizada. - Sistemas de reparo por excisão de bases (BER) reconhecem e reparam danos causados por agentes ambientais, como radiação e agentes alquilantes. - Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) retira um segmento da fita de DNA que inclui a lesão, deixando um intervalo que é preenchido pela DNA polimerase e depois ligado (DNA ligase). - Alguns danos são reparados por reversão direta da lesão, por enzimas específicas. - A síntese translesão (resposta SOS) permite a retomada da replicação, mas adiciona bases “erradas” e pode ser um mecanismo de aumento de diversidade em condições de estresse 34 Mutações podem resultar ou não na alteração da sequência proteica codificada 35 Mutação Silenciosa substituição TC T G C G G A T T T G C Tcodificadora molde codificadora molde T G C G G G T T T G C T Mutação Missense substituição AT T G C G G A T T T G C Tcodificadora molde codificadora molde A G C G G A T T T G C T 36 Mutação Nonsense substituição GT T G C G G A T T T G C Tcodificadora molde codificadora molde A G A G G A T T T G C T (G) Mudança de fase de leitura - frameshift T G C G G A T T T G C Tcodificadora molde codificadora molde A G A G G C A T T T G C T
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