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XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica – CBEB 2014 1 DIFERENÇAS ENTRE ESTRIAS BRANCAS E ESTRIAS VERMELHAS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN CONFOCAL M. P. Sousa1, M. G. Tosato1, B. Mogilevych1, C. D. Pizzol2, V. Vitoriano2, D. C. S. D`Avila3, M. Lorencini3, C. A. Brohem3, e A. A. Martin1* 1Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, Brasil. 2Grupo de Pesquisa Tecnológica, Grupo Boticário, São José dos Pinhais, Brasil. 3Grupo do Núcleo de Estudos Biológicos e Métodos Alternativos, Grupo Boticário, São José dos Pinhais, Brasil. *e-mail: amartin@univap.br Resumo: As estrias são lesões atróficas que não oferecem agravante clínico, mas é motivo de grande desconforto para as pessoas afetadas. Suas causas de aparecimento ainda não são claras, podendo ser classificadas de acordo com sua fase evolutiva. Quando surgem apresentam coloração avermelhada, sendo classificada como estrias vermelhas, e depois uma coloração esbranquiçada, que são as estrias brancas. Além desse diagnóstico visual, a condição que as fibras de colágeno e elastina se apresentam nas estrias são diferentes. Neste trabalho constatou-se, por Espectroscopia Raman, que a intensidade dos picos de colágeno, fibrilina e glicosaminoglicano apresentam-se com maior intensidade nas estrias vermelhas, quando comparado a estria branca. A determinação das diferenças bioquímicas entre os dois tipos de estrias permitirá que novos estudos sejam guiados. Este conhecimento poderá ser aplicado no desenvolvimento de novos produtos cosméticos e tratamentos estéticos que ajam diretamente nos diferentes tipos de estrias. A utilização da Espectroscopia Raman Confocal possibilitou a realização do estudo in vivo, não invasiva. Essa técnica tem aplicações em diversos estudos, porém ainda escassos para as estrias. Palavras-chave: Estrias, Raman Confocal, espectroscopia, pele. Abstract: Stretch marks are atrophic lesions that do not offer clinical aggravating, but it is a cause of great discomfort for the affected people. Their appearance causes are still unclear and may be classified according to their developmental stage. When arise it feature reddish, being classified as red streaks, and then became a whitish color, which are the white streaks. In addition to this visual diagnosis, the fibers of collagen and elastin present in the marks are different. In this work it was found by Raman spectroscopy that the intensity of the collagen and fibrillin glycosaminoglycan peaks present with greater intensity in the red streaks when compared to white streak. The determination of the biochemical differences between the two types of stretch marks will allow further studies are guided. This knowledge can be applied to develop new cosmetic products and aesthetic treatments that act directly on the different types of stretch marks. The use of Confocal Raman spectroscopy enabled the study in vivo, noninvasively. This technique has applications in several studies, but scarce for stretch marks. Keywords: Stretch marks, Confocal Raman, Spectroscopy, skin. Introdução Estrias, estriações atróficas ou striae distensae (SD) podem ser definidas como um processo degenerativo cutâneo, benigno, caracterizado por lesões atróficas (atrofia tegumentar adquirida) em trajeto linear. Podendo ser raras ou numerosas, as SD variam de coloração de acordo com sua fase evolutiva [1]. As SD surgem com aspecto de coloração avermelhada (violáceas) e de espessura fina tornando-se esbranquiçadas e abrilhantadas (quase nacarado) além de apresentarem-se mais largas [2]. Em geral, dispõem- se paralelamente umas às outras e perpendicularmente às linhas de fenda da pele, indicando um desequilíbrio elástico localizado, caracterizando uma lesão da pele. Existe uma tendência de as estrias distribuírem-se simetricamente, denominado caráter de bilateralidade [1]. Para melhor entender onde ocorre essa lesão é importante ressaltar os principais aspectos da pele. Sendo um órgão altamente heterogêneo composto por camadas que diferem em morfologia e composição bioquímica, a pele é convencionalmente, dividida em duas camadas principais: a epiderme e a derme. A epiderme é localizada acima da derme, variando em espessura de 40µm nas pálpebras para mais de 1mm nas palmas das mãos [3,4]. A derme, onde ocorrem as estrias, é a camada intermediária da pele. Detém como seu principal constituinte celular os fibroblastos, que são responsáveis pela síntese do colágeno (tipos I e III) e elastina, compondo a elasticidade e resistência da pele [4]. O excesso de distensão causa o rompimento dessas fibras, sendo a principal causa das marcas que podem ser motivadas pela gravidez, genética, hormônios, exercícios físicos intensos, mecânica (fricção)constante, 2612 XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica – CBEB 2014 2 ganho ou perda de peso constante, ou o rápido crescimento na puberdade. Na maioria das vezes, acometem mulheres (60%) com faixa etária entre 9 e 35 anos [5-9]. O surgimento de SD é considerado um processo de natureza estética, uma vez que não gera incapacitação física ou alteração da função cutânea. Entretanto, o aparecimento de SD pode produzir profundo desagrado em alguns indivíduos, tornando-se motivo de depressão psíquica e sentimentos de baixa autoestima [5,10]. A etiologia da estria não é plenamente conhecida e bastante controversa. Historicamente os estudos de SD utilizam técnicas in vitro [11]. Estes métodos fornecem informações a níveis bioquímicos e histológicos, porém por serem invasivos, geram desconforto ao voluntário, além de apresentar algumas desvantagens devido à perda de constituintes das amostras [11-13]. Nos últimos anos têm crescido a utilização de técnicas in vivo para os estudos da pele. Recentemente a Microscopia Confocal de Refletância (RCM) foi utilizada para a determinação das possíveis conformações das fibras de colágeno e elastina em SD e na pele normal [14]. Entretanto, esta técnica fornece imagens e não a constituição bioquímica das profundidades da pele [14]. Assim, os estudos in vivo de SD ainda são escassos. A Espectroscopia Raman Confocal (ERC) fornece informações bioquímicas das diferentes camadas da pele, não altera a morfologia do tecido e não necessita de preparação especial da amostra [12,13]. Atualmente têm sido aplicadas em diversos estudos como, por exemplo, na determinação da espessura das camadas da pele, permeação de componentes na pele e, até mesmo, do fator de hidratação natural (NMF) da pele [3,15,16]. O efeito Raman é o fenômeno de espalhamento inelástico da luz que fornece as frequências dos modos vibracionais das moléculas constituintes do material a ser analisado [3,12]. A aplicação da técnica de ERC para os estudos das SD permite o acompanhamento contínuo de possíveis tratamentos, durante um longo período, sem causar estresse invasivo ao paciente, além de fornecer informações em tempo real. Assim, este trabalho tem como primeiro objetivo a identificação das diferenças entre as estrias brancas e as estrias vermelhas, utilizando a técnica de ERC. Em um futuro próximo, estudos de ativos específicos na minimização dos efeitos da SD serão realizados. Materiais e métodos Para a realização deste estudo, o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa através da Plataforma Brasil, de acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa envolvendo seres humanos (95.109/2012). Neste projeto foi utilizada a população de 30 voluntárias. Os critérios de inclusão e exclusão foram: faixa etária entre 18 e 30 anos, fototipos I a III (conforme a classificação de Fitzpatrick), não tenha sido gestante ou lactante, e que não faça uso de tratamento para estrias e/ou de medicamentos que podem agravar ou desencadear as mesmas. Os dados aferidos foram separados em dois grupos: estrias brancas e estrias vermelhas. As avaliações das peles por espectroscopia Raman Confocal foram realizadas no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) em parceria com a Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Antes do início dos procedimentos, as voluntárias permaneceram em ambiente climatizado a 23º C com umidade relativa de aproximadamente 50% durante 15 minutos. A assepsia do local foi realizada utilizando algodão embebido em álcool etílico 70% na pele estriada. Para garantir uma correta obtenção de dados, após seleção da pele com a estria branca ou vermelha, a SD foi destacada utilizando fita adesiva vazada, impedindo assim que a pele normal ficasse exposta. Para a coleta do sinal a pele na região de estria deve estar em contato com a janela de objetiva de imersão de equipamento. Os espectros Raman foram coletados utilizando o sistema Confocal da Rivers Diagnostics (Model 3510 Skin Composition Analyzer) acoplada a um laser com comprimento de onda igual a 785nm e objetiva de 40X e instalado no LEVB. O sinal Raman foi coletado por um CCD (Charge Coupled Device) e registrado em um computador acoplado ao sistema. Os parâmetros de medidas dos dados espectrais foram definidos utilizando software Rivers. A potência nas amostras foi de aproximadamente 19 mW, realizada nas profundidades de 0 a 140 micrômetros (µm), na parte selecionada da estria branca e da estria vermelha. Neste estudo, descreveremos as análises dos espectros Raman obtidos das estrias na região da derme: de 100 a 140 µm. Os espectros obtidos no sistema foram separados pelas profundidades, realizada a subtração de fluorescência e suavização de linha de base. Foram utilizados os softwares Skin Tools®, Origin®, LabSpec® e Minitab®. Análise estatística multivariada foi realizada através da aplicação de análise por componentes principais (PCA, Principal Componente Analysis) e análise por agrupamento (HCA, Hierarchical Clustering Analysis). O PCA consiste em reduzir a dimensionalidade de parâmetros do conjunto de espectros facilitando a classificação. Para as análises de agrupamento dos espectros por similaridade foram utilizados distintos números de componentes principais contendo mais que 95% das informações iniciais. Quanto menor o número de componentes maior a correlação entre os dados. Os gráficos de Loading plot, projetados a partir dos componentes principais, ilustram a contribuição das variáveis espectrais originais para a formação das primeiras componentes principais. As principais variações podem ser observadas principalmente na PC1 e PC2. 2613 XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica – CBEB 2014 3 Resultados Nas análises entre estrias vermelhas e brancas, foram consideradas oito componentes principais formando um total de 93,6% sendo que a primeira componente (PC1) engloba 42,9% da variância dos dados. A análise do gráfico de uma PC pode dar informações sobre a origem da variabilidade dentro de um conjunto de dados, derivadas de variações nos componentes químicos que contribuem nos espectros. Utilizando os componentes principais obtidos para cada agrupamento de dados, fez-se a análise discriminante linear para identificar o percentual de probabilidade dos espectros pertencerem ou não ao seu grupo. O percentual de discriminação intergrupos de espectros que foram classificados corretamente totalizou 75%. Os espectros relacionados com o cálculo de componentes principais para análises intergrupos mostraram regiões do espectro com contribuição positivas e negativas indicando aumento ou diminuição na intensidade de alguns modos vibracionais. Por este motivo, calculou-se a subtração dos espectros médios para estrias vermelhas e estrias brancas a fim de observar as principais regiões onde apresentaram diferenças. A Figura 1 mostra os espectros Raman médio para região da derme nas estrias brancas e vermelhas. Figura 1: Espectros médios de estrias brancas e vermelhas. Foram considerados três componentes bioquímicos da pele: glicosaminoglicanos (GAGs) (1342cm-1), fibrilina (630cm-1, 646 cm-1) e colágeno (855cm-1, 938 cm-1, 1104 cm-1 e 1246cm-1) (Tabela 1). Com o objetivo de compreender o perfil completo de cada um destes componentes na derme foram realizados cálculos de áreas sobre os espectros de todas as voluntárias e apresentadas sob a forma de histogramas com a média e o desvio padrão (Figura 2). Figura 2: Histogramas representando os valores médios ± dp das intensidades. Tabela 1: Atribuições dos modos vibracionais para a pele [13] Posição (cm-1) Atribuições 630 C-H torção; triptofano, amida III 646 COO- estiramentosimétrico; CH3 deformação; 855 Prolina 938 Hidroxiprolina 1104 C-N estiramento (colágeno) 1246 Amida III (α hélice do tropocolágeno) 1342 C-H torção; triptofano; Após as análises constatou-se que as estrias vermelhas apresentam uma maior intensidade nos picos que são identificados como: glicosaminoglicano (1342cm-1), fibrilina (630cm-1, 646cm-1) e no colágeno indicado pelos picos: prolina (855cm-1), hidroxiprolina (938cm-1) e amida III(1246cm-1), nas estrias brancas foi constatado maior intensidade no pico do C-N estiramento (1104cm-1). Discussão A partir da análise utilizando a PCA pode-se concluir que os grupos de espectros foram classificados corretamente e separados segundo suas características intrínsecas. O percentual de 75% valida estas análises. Baseado nos dados da subtração dos espectros médios pode-se definir as regiões onde ocorreram as principais diferenças entre as estrias brancas e as estrias vermelhas. As estrias brancas apresentaram a perda no número de fibrilina, colágeno e elastina [17] com exceção do 2614 XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica – CBEB 2014 4 pico 1104 cm-1 que mostrou aumento de intensidade. Este fato pode estar relacionado à mudança na conformação das moléculas de colágeno associadas a abertura da tripla hélice ou/e ao rompimento das fibras. O GAGs encontrado em maior intensidade nas estrias vermelhas, pode ser associado à desorganização do sistema fibrilar da derme [18]. Alguns tipos de GAGs estão relacionados com atividade antiinflamatória. A maior intensidade dos picos de fibrilina nas estrias vermelhas deve indicar aumento das fibras finas elásticas, o que está em acordo com estudos das estrias com microscopia de campo claro e microscopia eletrônica de varredura [17]. A hidroxiprolina e a prolina apresentaram maior intensidade nas estrias vermelhas, provavelmente é um reflexo da intensa síntese de colágeno pelos fibroblastos [17]. Conclusão Com o avanço de novos estudos, este trabalho representa o inicio para melhor entendimento a respeito das diferenças bioquímicas entre os diferentes tipos de estrias. As diferenças encontradas possibilitaram investigar e entender bioquimicamente as principais diferenças entre estrias brancas e vermelhas. Importante ressaltar que a utilização in vivo da espectroscopia Raman Confocal permitiu que os dados fossem obtidos de forma confiável e conclusiva, sem alteração bioquímica da pele. Agradecimentos Agradecimentos a FINEP, CNPq, Instituição de ensino UNIVAP – FVE e a empresa LADECOM pelas bolsas de estudo concedidas. Referências [1] Guirro E, Guirro R. Fisioterapia Dermato-funcional. 3.ed. ver. E amp. São Paulo: Manole, 2004. [2] Jiménez GP, Flores F, Berman B, Gunja-Smith Z. 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