Relatorio Eschericia Coli

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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL 
 
 
CURVA DE CRESCIMENTO DA ESCHERICIA COLI
ALICE RIBEIRO PRADE
CRISTIAN EDUARDO DA ROSA
FAGNER RIBEIRO DA SILVA
FRANCINE SANTOS MÜHL
GABRIELA DA SILVA MOOG
JULIANA CRISTINA DE OLIVEIRA
LENISE PACHECO DA SILVA
LUAN WEBER DOS SANTOS
MARCELO RODRIGUES DOS SANTOS
POLIANA KERBER 
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Canoas
2019/1
1 OBJETIVOS
Objetivo geral 
Construir uma curva de crescimento do micro-organismo Escherichia Coli. 
Objetivos específicos 
Caracterizar na curva de crescimento a fase de inoculação da estirpe em meio novo nutritivo e a fase em que ocorre um aumento constante do número de organismos de cultura.
Analisar as condições microbiológicas de desenvolvimento dos microrganismos, a uma determinada temperatura, em um dado período de tempo e em um determinado meio de cultura. 
REFERENCIAL TEÓRICO 
A Escherichia Coli é uma bactéria caracterizada por ser resistente à altas temperaturas, anaeróbia facultativa. Seu habitat natural é o intestino humano e de alguns animais, mas, quando em excesso pode causar problemas como gastroenterite e infecção urinária.
O seu crescimento bacteriano ocorre por divisão celular, levando a um aumento exponencial do número de células iniciais de uma população. As bactérias podem crescer como fissão binária individualmente, alongando-se até dividir-se em duas ou por população, quando as células duplicam seu tamanho e é formado um septum, isto é, o crescimento da membrana celular e da parede celular até a separação das duas células. 
O processo da bactéria em estudo é por fissão binária, levando um tempo variável para a sua duplicação, visto que depende da temperatura do meio, pH, condições físicas de incubação e nutrientes para sua geração, normalmente este tempo dura 20 minutos, para o nosso microrganismo em estudo. 
Toda bactéria possui um meio de cultura ideal, que se baseia em uma preparação química utilizada para que os microrganismos se multipliquem, esta preparação consiste em uma substância líquida ou gelificada, composta por soluções de nutrientes, assim permitindo a nutrição, o crescimento e a multiplicação de microrganismos. Se necessário conhecer a fisiologia do microrganismo para compor um meio de cultura para este. É importante ressaltar que para que a atividade do microrganismo possa ser aproveitada e ele possa ser caracterizado, deve-se encontrar em cultura pura, que trata-se de não estar misturado a outros. 
Os meios de cultura bacterianos podem ser líquidos (sem ágar), semissólidos ou sólidos. Para que haja a separação adequada em um material ou uma cultura líquida, realiza-se o procedimento em semissólido. Este meio possui um agente solidificante, normalmente o ágar, em uma concentração de 1 a 2%.
Este microrganismo consegue crescer em uma gama de temperatura entre 7 a 46ºC, em pH 4,5, se este for ajustado com ácido clorídrico e não ácido lático, à um limite máximo de Aw (atividade de água) 0,95 e independe de oxigênio, pois é anaeróbio facultativo.
A cultura bacteriana pode ter crescimento em sistema fechado ou sistema aberto, caso seja em sistema fechado, não ocorrerá a renovação de nutrientes e as substâncias tóxicas irão se acumular no meio, ao contrário do que ocorre no sistema aberto. O sistema fechado é composto por quatro fases, sendo elas: fase lag, fase log, fase estacionária e fase de morte ou declínio. 
Fase Lag: Fase que se tem um período variável, onde não há aumento significativo da população, porém é a fase onde são sintetizadas diversas enzimas e moléculas variadas, tendo um aumento na quantidade de proteínas, peso seco e tamanho celular. 
Fase Log: Fase onde as células estão plenamente adaptadas, causando um crescimento exponencial das células, que muitas das vezes são influenciados pelas condições de cultivo, ou sejam dependem dos nutrientes dispostos no meio de cultura específica para seu crescimento, que irão favorecer essa divisão celular.
Fase Estacionaria: Fase da qual não há um crescimento líquido da população, pois o número de células que se dividem (viáveis) é equivalente ao número de células que morrem, devido à escassez de nutrientes e ao aumento de produtos tóxicos. Algumas bactérias nessa fase sintetizam esporos (esporulação) para tentar sobreviver. 
Fase de Morte ou Declínio: Nesta fase a maioria das células está em processo de morte. A contagem total permanece constante enquanto que a quantidade de células viáveis está em declínio. 
Pode-se avaliar o crescimento microbiano através da determinação da evolução ao longo do tempo da concentração de um componente celular, da concentração de células ou da biomassa em suspensão em meio de crescimento líquido, com isto, obtém-se a curva de crescimento e é possível determinar a ampliação da população microbiana, esta determinação pode ser realizada através de variadas análises. Sendo elas:
Contagem: Existem diversos métodos de determinação de biomassa microbiana. Elas podem ser feitas através do peso seco, do peso úmido, focando algum constituinte celular como, por exemplo, as proteínas e a contagem de células. Este último é o mais utilizado em microbiologia e foi utilizado também em nossa atividade prática. 
Para realizar esse método, é essencial que somente um número limitado de colônias cresça em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento de algumas colônias e dificultando a contagem.
Análise: Quando essa metodologia de contagem é empregada, devem-se fazer diluições seriadas para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada. 
Essa técnica, portanto, consiste em sucessivas diluições da amostra, e que em cada diluição é espalhada em placas de Petry contendo meio de cultura. Após o plaqueamento e incubação, por tempo e temperatura adequados, as células ou pequenos agrupamentos vão crescer isoladamente, dando origem a colônias que serão contadas na diluição apropriada e, portanto, chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC).
O ideal é entre 30 e 300 colônias. Os tubos muito diluídos não terão células suficientes, ao mesmo tempo em que os tubos muito concentrados terão excesso de células, e assim sendo não será possível se fazer um a contagem adequada nas respectivas placas. Após os cálculos adequados, levando-se em conta a diluição e volume, é possível determinar a quantidade de microrganismos presentes em determinado peso ou volume do material inicial. 
METODOLOGIA 
Iniciou-se o procedimento com a limpeza das bancadas, utilizando o álcool, para evitar quaisquer focos de contaminação do ambiente. Após, ligou-se o bico de Bunsen, para que toda a prática fosse realizada em torno dele, ou seja, em área estéril. 
Realizou-se as diluições transferindo 1mL do caldo, que continha as células da Eschericia Coli para um tubo de ensaio contendo 9mL do meio (água peptonada). 
O grupo dois trabalhou com os pontos: 3, 6, 9, 12 e 15 da curva, os quais tiveram diluições 10-7, 10-7, 10-8, 10-8 e 10-8, respectivamente. Dentre os outros grupos, o ponto 1 obteve 4 diluições, do ponto 2 ao ponto 9 obtiveram-se 7 diluições e do ponto 10 ao ponto 16 obtiveram-se 8 diluições.
As diluições foram realizadas de maneira seriada, isto é, primeiramente retirou-se uma alíquota de 1 mL do ponto 3 e transferiu-se para um tubo contendo 9 mL de água peptonada, sendo identificado como diluição 10-1, deste tubo retirou-se uma alíquota de 1mL e realizou-se a segunda diluição 10-2, e assim sucessivamente até 10-7. No ponto 6 foram realizadas 7 diluições seriadas, até o ponto 10-7. Nos pontos 9, 12 e 15 foram realizadas diluições até 10-8.
As diluições foram adicionadas à placas de Petry, em meio de cultura ágar PCA, retirando-se alíquotas de 0,02 mL e aplicando na placa, nas três divisões identificadas que nela haviam, referente às diluições de trabalho. 
Após adicionadas todas as diluições, as placas invertidas foram colocadas em estufa, a 35º por uma semana. Caso passe desse tempo,aumenta o tamanho e não a colônia, que é nosso interesse. Sendo assim, sete dias depois realizou-se a contagem do número de UFC (unidades formadoras de colônia). 
Analisou-se microscopicamente o número de células viáveis de cada ponto. Os resultados obtidos dos grupos 1, 2 e 3 foram cruciais para a elaboração da curva de crescimento da Eschericia Coli. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES
 Os resultados encontrados pela turma estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1 – Resultado da contagem das células viáveis
	PON.
	DIL.
	H/ dia
	∆t (h)
	G1
	G2
	G3
	M
	Nº C.V.
	LOG
	1
	1,00E-06
	12:30 seg
	0
	25
	28
	-
	26,5
	1,33E+09
	9,12
	2
	1,00E-05
	12:40 seg
	0,17
	2
	2
	-
	2
	1,00E+07
	7,00
	3
	1,00E-06
	12:50 seg
	0,33
	14
	14
	-
	14
	7,00E+08
	8,85
	4
	1,00E-06
	13:20 seg
	0,83
	19
	23
	-
	21
	1,05E+09
	9,02
	5
	1,00E-05
	13:50 seg
	1,33
	3
	6
	-
	4,5
	2,25E+07
	7,35
	6
	1,00E-06
	14:20 seg
	1,83
	20
	23
	19
	20,7
	1,04E+09
	9,02
	7
	1,00E-06
	15:20 seg
	2,83
	22
	20
	-
	21
	1,05E+09
	9,02
	8
	1,00E-06
	15:50 seg
	3,33
	9
	7
	-
	8
	4,00E+08
	8,60
	9
	1,00E-06
	16:20 seg
	3,83
	22
	27
	24
	24,3
	1,22E+09
	9,09
	10
	1,00E-07
	17:20 seg
	4,83
	9
	9
	-
	9
	4,50E+09
	9,65
	11
	1,00E-06
	18:20 seg
	5,83
	7
	10
	-
	8,5
	4,25E+08
	8,63
	12
	1,00E-06
	19:20 seg
	6,83
	28
	19
	32
	26,3
	1,32E+09
	9,12
	13
	1,00E-07
	21:20 seg
	8,83
	14
	12
	-
	13
	6,50E+09
	9,81
	14
	1,00E-06
	12:30 ter
	24
	5
	7
	-
	6
	3,00E+09
	9,48
	15
	1,00E-06
	12:30 qua
	48
	13
	16
	16
	15
	7,50E+08
	8,88
	16
	1,00E-07
	19:00 qui
	78,5
	7
	7
	-
	7
	3,50E+09
	9,54
(Fonte: os autores, 2019)
Cálculo do número de células viáveis:
 Para obter-se o número de células viáveis, multiplicou-se a média do número de colônias contadas, pela correção da diluição e pelo fator de correção. O fator de correção tem valor de 50, pois é a razão do volume utilizado para as diluições (1mL) pelo volume da gota aplica na placa (0,02mL).
Tem-se, portanto:
Nº Células Viáveis = Média colônia presente na gota * Diluição aplicada * FC
 O gráfico 1, apresenta a curva de crescimento de E. Coli obtida a partir dos resultados encontrados.
Alguns pontos obtidos foram descartados na realização da curva, para uma melhor avaliação das fazes lag, log exponencial, estacionária e fase de declínio.
Gráfico 1 – Curva de crescimento de E. Coli
(Fonte: os autores, 2019).
 
 Não foi possível visualizar a fase lag na curva de crescimento, pois os resultados não foram obtidos no tempo certo. A curva iniciou-se já na fase log exponencial que podemos observar entre o tempo de incubação de 20 a 50 minutos (0,33 a 0,83 horas). A fase estacionária pode ser visualizada entre o tempo de incubação de 50 minutos a 4 horas e por fim a partir de 4 horas de incubação podemos observar a fase de declínio ou morte.
CONCLUSÃO 
Através dos dados obtidos experimentalmente, foi possível construir a curva de crescimento para a Escherichia Coli e identificar as fases log exponencial, estacionária e de morte. 
Os pontos referentes à fase lag precisaram ser descartados devido a alguns desvios que se devem a erros operacionais que podem ter ocorridos devido ao grande numero de pessoas que realizaram as diluições, inoculações e a contagem de colônias. Mesmo assim podemos concluir que a fase lag se deu nos primeiros 20 minutos de incubação. Começando em seguida uma rápida divisão celular, onde a quantidade de nutrientes disponível era maior do que a necessária para o desenvolvimento das células e ainda não havia uma quantidade significativa de substâncias tóxicas, esta é, portanto a fase log exponencial, que é observada entre 20 a 50 minutos. Após este crescimento exponencial, observa-se na curva a fase estacionária que vai de 50 minutos a 4 horas de incubação, onde o número de células novas produzidas se igualou ao número de células mortas. Por fim a partir de quatro horas de incubação através do declínio da curva podemos afirmar que se inicia a fase de morte, onde há escassez de nutrientes e quantidades significativas de substâncias tóxicas.
Através da curva de crescimento da Escherichia Coli foi possível visualizar e compreender o desenvolvimento de um micro-organismo.
REFERÊNCIAS 
OLIVEIRA, Casé. Fases do crescimento bacteriano. Disponível em <https://sites.google.com/site/caseoliveiraambientalista/microbiologia/microbiologia/fases-do-crescimento-bacteriano>. Acesso em 20.04.2019.
https://sites.google.com/site/caseoliveiraambientalista/microbiologia/microbiologia/fases-do-crescimento-bacteriano Acesso em 14.04.2019
http://www.asae.gov.pt/?cn=541054135465AAAAAAAAAAAA Acesso em 14.04.2019
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/preparo-de-meios-de-cultura/24351 Acesso em 17.04.2019
http://knoow.net/ciencterravida/biologia/crescimento-bacteriano/ Acesso em 18.04.2019