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________________________________________________________________________________ Medicina-UNIRIO Estudo Dirigido 1-Devido a problemas econômicos o laboratório de um Hospital Universitário ficou temporariamente sem poder adquirir os kits para as dosagens das enzimas fosfogalactose uridiltransferase e fenilalanina hidroxilase. A determinação destas enzimas em recém-nascidos é essencial para detectar a fenilcetonúria. O chefe do laboratório, sabendo que estava cursando BioCel, pediu sua ajuda para estabelecer qual a concentração de substrato a ser utilizada para cada enzima, de modo que a reação ocorresse em velocidade máxima, e assim garantir uma condição ótima para as dosagens. Como dado ele deu a você os gráficos a seguir. Pergunta-se: A) Qual a concentração de S que poderia ser usada para medir cada enzima em velocidade máxima? Para que se chegue a velocidade máxima da enzima fenilalanina hidroxilase, é necessário usar cerca de 3,8mM de fenilalanina e para atingir a velocidade máxima da enzima fosfogalactose uridiltransferase é necessário usar cerca de e 50mM de fosfogalactose. Nessas concentrações de substrato, todas as enzimas estão na forma do complexo ES, fazendo com que a velocidade máxima possa ser atingida (não há enzimas livre ou, e houver, há pouca quantidade). B) Qual das duas enzimas apresenta maior afinidade pelo seu substrato? A enzima fenilalanina hidroxilase apresenta maior afinidade pelo seu substrato (fenilalanina) uma vez que ela precisa de cerca de 1mM desse substrato para atingir metade de sua velocidade máxima, ao passo que a enzima fosfogalactose uridiltransferase precisa de cerca de 20mM do seu substrato (fosfogalactose) para atingir metade de sua velocidade máxima. Dessa forma, podemos assumir que a enzima fenilalanina hidroxilase tem um Km bem menor se comparada com a enzima fosfogalactose uridiltransferase. 2) A determinação de atividades enzimáticas no sangue é uma poderosa ferramenta no estabelecimento da gravidade de um processo de infarto do miocárdio. A oclusão das artérias reduz a oxigenação causando a degeneração localizada do músculo cardíaco, o que resulta na perda de enzimas deste tecido para a corrente sanguínea. Imediatamente ou até uma semana após o infarto a atividade de duas enzimas é aumentada acentuadamente: Lactato desidrogenase (Piruvato→Lactato) e Creatina quinase (Creatina→Fosfocreatina). Entretanto, outros tecidos como fígado e cérebro apresentam isoenzimas de LDH e CK, que também podem ser liberadas para o sangue quando ocorre um dano hepático. Sabe-se que estas enzimas apresentam uma estrutura quaternária e que a combinação de subunidades (peptídios) não são iguais em todos os tecidos, o que resulta em interações diferenciadas com seus substratos. A partir destes dados proponha um parâmetro cinético capaz de diferenciá-las. 3) Uma enzima alostérica é formada por duas subunidades de pesos moleculares diferentes. Para analisar a regulação desta enzima ela foi isolada e testados os efeitos dos moduladores ATP e ADP (gráfico 1.). Paralelamente uma porção da mesma preparação enzimática foi tratada com ureia 6M de forma a dissociar as subunidades, gerando os dois polipeptídios (protômero 1 e 2). Estes foram isolados por gel filtração e testados quanto à capacidade catalítica e de regulação. O protômero 1 não apresentou capacidade catalítica. A atividade do protômero 2 e sua resposta à adição dos moduladores está representada no gráfico 2. Explique estes resultados. Com relação ao gráfico 1, pode-se perceber que o ADP é um modulador alostérico positivo, uma vez que aumenta a atividade da enzima, já que, se comparado com o controle, aumenta a velocidade máxima da reação e, ainda, diminui o Km. Ao contrário, pode-se observar que o ATP é um modulador alostérico negativo, uma vez que diminui a atividade da enzima pois, se comparado com o controle, diminui a velocidade máxima e aumenta o Km da enzima. Em relação ao gráfico 2, pode-se concluir que o protômero 2 não possui capacidade de modulação, apenas catalítica, uma vez que, mesmo com os moduladores positivos e negativos, não houve mudança na reação. Dessa forma, o protômero 1, que foi retirado com a ureia 6M que possuía a parte responsável pela modulação enzimática, apesar de ele não possui capacidade catalítica. 4) A anidrase carbônica é fortemente inibida pela droga acetozolamida, a mesma que é empregada para aumentar a secreção de urina. Neste e em outros processos secretórios, a anidrase carbônica desempenha um importante papel, já que ela participa da regulação do tampão bicarbonato e do pH de muitos fluidos corporais. O gráfico mostra a variação da velocidade da reação desta enzima em função da concentração de substrato. Quando o experimento é repetido na presença de acetazolamida obtém-se a curva inferior. Determine a natureza da interação da acetozolamida com a enzima. A acetozolamida atua como inibidor não competitivo em relação a enzima anidrase carbônica, uma vez ele, por não se ligar no sítio ativo dessa enzima, não altera o se Km mas diminui a velocidade máxima de reação da enzima. Isso acontece pois, inibidores não competitivos alteram a conformação proteica de modo que seja mais difícil a conversão do substrato em produto, diminuindo, assim, a velocidade máxima da enzima. Nota-se no gráfico dado que a velocidade máxima caiu de 20 para cerca de 11, enquanto o Km manteve-se basicamente o mesmo, se comparado com as respectivas velocidades máximas (o Km no controle e com a ação da acetozolamida foi cerca de 5)
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