eletroforese e proteinas plasmáticas

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Arlindo Ugulino Netto – BIOQUÍMICA II – MEDICINA P2 – 2008.1 
 
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FAMENE 
NETTO, Arlindo Ugulino. 
BIOQUÍMICA (PRÁTICAS DE LABORATÓRIO) 
 
ELETROFORESE E PROTEÍNAS PLASMÁTICAS 
(Profª. Maria Auxiliadora) 
 
O plasma humano contém mais de 500 proteínas identificáveis. Entre essas, estão presentes proteínas 
carreadoras, anticorpos, enzimas, inibidores enzimáticos, fatores da coagulação e proteínas com outras funções. A 
avaliação das concentrações de proteínas séricas e as proporções das diferentes frações de proteína têm considerável 
valor no diagnóstico em desordens agudas e crônicas. 
A eletroforese de proteínas (EFP) no soro é uma técnica simples para separar as proteínas do soro. É o teste de 
triagem mais utilizado para investigação de anormalidades das proteínas séricas. Em condições normais, são separadas 
cinco bandas do soro: albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gamaglobulinas. Eventualmente, pode ser observada a 
presença da pré-albumina. O reconhecimento de paraproteínas, normalmente encontradas nas gamopatias benignas ou 
malignas é o uso diagnóstico mais importante para a EFP. Quando alteradas, as bandas apresentam-se com padrões 
conhecidos para importantes patologias. 
A banda da albumina é relativamente homogênea, porém as demais são compostas por uma mistura de 
diferentes proteínas. Informações adicionais podem ser encontradas nos títulos referentes às diferentes proteínas que 
compõem as bandas identificadas pela eletoforese como: albumina, alfa-1-antitripsina, alfa-1-glicoproteína ácida, 
haptoglobina, ceruroplasmina, entre outras. 
 
 
METODOLOGIA 
MATERIAL E REAGENTES 
• Fonte de Energia: pode ser a mesma cuba, sendo dotada de dois eletrodos: um positivo e outro negativo. As 
proteínas vão correr no sentido NEGATIVO � POSITIVO 
• Cuba e ponte para eletroforese: aparelho onde será depositada parte da solução tampão e sobre ela, põe-se a 
ponte com a fita de acetato celulose sobre ela. 
• Fitas de acetato de celulose: inicialmente, passa 15min numa solução tampão (pH 9,5 ± 0,2) e depois 
conservada em metanol à 40% para não ressecar. O tratamento em fita de acetato serve para retirar a condição 
de isoeletricidade entre as proteínas, para que elas obtenham cargas para que seja possível a sua migração na 
fita. 
• Aplicador: aparelho especialmente elaborado para colher pequena parte da amostra do soro para ser aplicada 
na fita. 
• Espectrofotômetro ou Densitômetro 
• Tampão veronal (pH 8,5) 
• Corante: Ponceau´S 
• Descorante: ácido acético 5% 
• Eluente: ácido acético 80% 
• Desidatrante: metanol 
• Solução Transparentizadora: 84 mL de metano 
1 mL de Glicerol 
15 mL de ácido acético glacial 
 
TÉCNICA 
1. Colocar cerca de 100 mL do tampão em cada compartimento da cuba. 
2. Retirar as fitas de acetato de celulose da solução conservante (metanol 40%) e colocar na solução tampão por 
cerca de 20 minutos. 
3. Retirar o excesso do tampão, enxugando-a entre duas folhas de papel de filtro e adaptá-la na ponte de 
eletroforese. 
4. Aplicar a amostra na fita e aguardar 5 minutos, para completa absorção da amostra. Ligar a fonte na corrente 
elétrica durante 45 minutos. 
5. Desligar a fonte e colocar em solução corante (Ponceau´S) durante 5 minutos. 
6. Transferir a fita para a solução descorante (ácido acético a 5%), lavando várias vezes, para tirar o excesso do 
corante. 
7. A quantificação das frações pode ser feito pelo método da eluição (espectrofotômetro) ou transparentização 
(densitometria). 
8. Eluição: 
a) Identificar 6 tubos : Branco, albumina, alfa-1-globulina, alfa-2-globulina, β-globulina e gama-globulinas. 
 
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b) Colocar 2,0 mL de solução eluente (ácido acético 80%), em cada tubo, com exceção do tubo 
correspondente a albumina que será 4,0 mL (após a leitura da absorbância, multiplicar por 2). 
c) Cortar as frações separadamente e colocar nos tubos correspondentes. Agitar até a completa 
dissolução. Para o branco, cortar uma parte da fita onde não haja fração protéica. 
d) Efetuar a leitura no filtro verde (520nm). 
 
 
CÁLCULO DO TEOR DAS FRAÇÕES PROTÉICAS (ELUIÇÃO) 
1. Determinar o teor de proteínas totais da amostra em estudo (biureto). 
2. Determinar os valores relativos (percentual de cada fração), dividindo a D.O de cada fração pela soma das D.O 
de todas as frações e multiplicar por 100. 
∑ D.O → 100 
D.O → X 
 
 Ex: Cálculo da albumina 
 0,780 → 100 
 0,400 → X= 51,3% 
 
3. Determinar o valor absoluto, usando uma regra de três: 
PT: proteína total (biureto) = 7,0 g/dL 
 PT → 100 
 X → % da fração 
 
 Ex: Cálculo da albumina 
 7,0 → 100 
 X → 51,3% 
 X = 3,59 g/dL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Concentração da amostra: 
Concentração da Amostra (g /dL) = Absorbância do Teste x [PADRÃO] 
 Absorbância do Padrão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quantificação das Frações Protéicas 
Fração ABSORBÂNCIA Valor Relativo g/dL 
Albumina 
Alfa-1-globulina 
Alfa-2-globulina 
Beta-globulina 
Gama-globulina 
∑ D.O 
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PROTEÍNAS PLASMÁTICAS 
• Albumina: sintetizada pelo fígado 
• Imunoglobulinas: produzidas pelos plasmócitos da medula óssea como parte de uma resposta imune. 
• Valor de Referência: 
� Proteína total: 6,0 a 8,0 g/dL 
� Albumina: 3,5 a 5,5 g/dL 
� Globulinas: 1,5 a 2,5 g/dL 
• Posições dos valores na fita de acetato de celulose com relação aos pólos dos eletrodos: 
FITA DE ACETATO DE CELULOSE: (POLO -) Gama β α2 α1 albumina (POLO +) 
 
 
OBS1: O aumento das gamaglobulinas significa 
uma gamopatia, que pode ser do tipo policlonal 
(aumento relacionado à vários tipos de 
imunoglobulinas, apresenta um pico difuso) ou 
monoclonal (aumento relacionado a um tipo de 
imunoglobulina, característica do mieloma 
múltiplo e do calazar, e apresenta um pico fino na 
eletroforese). 
OBS²: Na cirrose hepática, devido ao aumento 
de gama-β-imunoglobulinas, não há uma 
separação nítida dessas duas frações (banda β 
larga). 
OBS³: Na síndrome nefrótica há uma diminuição 
nas taxas de albumina (devido a sua perda nos 
glomérulos) e aumento de alfa-globulinas. 
OBS4: Quando α1 e α2 estão aumentadas, tem-se uma fase aguda de uma doença. Quando α1 e α2 estão elevadas 
associadas ao aumento das gamaglobulinas, tem-se uma fase de cronicidade. 
 
 
ALBUMINA 
É a proteína mais abundante no plasma, respondendo por cerca de 60% da concentração total de proteínas. É 
sintetizada exclusivamente pelo fígado, aparecendo primeiro no citoplasma dos hepatócitos como um precursor 
chamado pró-albumina. Possui um papel muito importante em diversas funções do organismo, como o transporte de 
diferentes substâncias e em especial a manutenção da pressão oncótica. 
Foram descritas mais de 20 variantes genéticas de albumina. O tipo mais comum é chamado albumina A. Essas 
albuminas variantes podem resultar em uma faixa de albumina larga na eletroforese de proteína de soro ou podem dar 
origem a duas faixas distintas (bisalbuminemia). Nenhuma dessas variantes foi ainda associada a manifestações 
patológicas. Na rara síndrome de ausência congênita de albumina, os pacientes podem apresentar edema moderado, 
mas podem poupar as conseqüências hemodinâmicas com a utilização de mecanismos compensatórios, como o 
aumento das globulinas do plasma, que assumem algumas das funções da albumina. O problema bioquímico principal 
nesses pacientes é uma alteração no metabolismo lipídico, com aumento de colesterol, fosfolipídios e outras 
lipoproteínas. 
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A albumina tem carga elétricanegativa. Ao ser colocada no eletrodo 
negativo da cuba de eletroforese, ela é a proteína que mais corre, afastando-
se do polo negativo para chegar ao positivo. 
 
FUNÇÕES DA ALBUMINA 
Manutenção da pressão osmótica. Transporte de hormônios 
tireoideas. Transporte de hormônios lipossolúveis. Transporte de ácidos 
graxos livres. Transporte de bilirrubina não conjugada. Transporte de 
fármacos e drogas. Aumento da libido. União competitiva com ions de cálcio. 
Controle do pH. Seu excesso ocasiona diversas doenças, como problemas 
renais e hepáticos. Além disso, o consumo excessivo de albumina provoca 
ganho de peso, sendo que um aumento em massa muscular sem acúmulo 
de gorduras e também é responsável pelo fator anti-catabólico ou seja 
bloqueia a perda de músculos. 
 
CORRELAÇÕES CLÍNICAS 
• Hipoalbuminemia: níveis de albumina abaixo de 3,5 mg/dL � resulta na formação de edema. 
• Hiperalbuminemia: 
� Condição rara, podendo ocorrer na desidratação 
� Uso prolongado do torniquete na coleta de sangue venoso 
• Analbuninemia: edema moderado, acredita-se que as concentrações das outras proteínas plasmáticas 
aumentam e compensam a deficiência relativa da albumina. 
 
CAUSAS DA DEFICIÊNCIA DA ALBUMINA 
� Síntese diminuída: Desnutrição, má absorção ou hepatopatia crônica. 
� Distribuição anormal ou diluição: A hipoabuminemia pode ser induzida pela superidratação ou pelo aumento da 
permeabilidade capilar (septicemia). 
� Excreção anormal ou degradação: Síndrome nefrótica, enteropatias, queimaduras hemorragias. 
 
PRÉ-ALBUMINA (20-45 mg/dL) 
Sintetizada pelo fígado, tem como função conhecida ser carreadora da tiroxina e desempenhar um papel 
significativo no metabolismo da vitamina A. Forma um complexo com o retinol, que se liga posteriormente à vitamina A. 
Devido à sua baixa concentração no soro, com freqüência deixa-se de observá-la na eletroforese de proteínas séricas. 
Entretanto, consegue ultrapassar a barreira hematoencefálica e pode também ser sintetizada por células do plexo 
coróide, o que explica seu aparecimento freqüente na eletroforese do liquor cefalorraquidiano. 
Os níveis de pré-albumina estão significativamente diminuídos em diversas patologias hepáticas e aumentados 
em pacientes em uso de esteróides, como também na falência renal e durante a gravidez. 
Por apresentar uma meia-vida muito curta e ser bastante sensível às variações do aporte alimentar e ao estado 
funcional hepático, é considerada um bom marcador do estado nutricional. 
• Função: transporte de hormônio tiroxina (T4) 
• Significado clínico: Reduzido processos inflamatórios agudos e nas hepatopatias 
 
 
ALFA-1-GLOBULINAS 
A alfa-1-antitripsina responde por cerca de 90% das proteínas que correm na faixa das alfa-1-globulinas. A 
deficiência da alfa-1-antitripsina está associada ao enfisema pulmonar e à cirrose hepática. Só é detectável pela 
eletroforese quando homozigótica; os estados heterozigóticos só podem ser identificados por técnicas imunoenzimáticas 
que também são utilizadas para confirmação das deficiências homozigóticas. 
É uma das proteínas de fase aguda e pode ser encontrada em outros fluidos orgânicos, como lágrimas, sêmen, 
bile e líquido amniótico. Nos 10% restantes, estão a alfa-1-glicoproteína ácida, a alfafetoproteína e outras proteínas. Os 
níveis se elevam nas doenças inflamatórias agudas e crônicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a 
gravidez ou estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento da alfafetoproteína. 
� Alfa-1-glicoproteína ácida (65%): elevada nos processos inflamatórios agudos. Nunca chega ao pico que a 
albumina chega pois não tem afinidade a corantes protéicos. 
� Alfa Lipoproteína (HDL) 
� Alfa-fetoproteína: origem placentária e fetal. 
 
 
ALFA-2-GLOBULINAS 
Incluem a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente encontram-se alterações nessa 
banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos demais mesmo dentro da faixa de 
referência. 
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Níveis elevados de alfa-2-macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome 
nefrótica. Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se elevados em numerosas situações que 
levam à reação de fase aguda. Os níveis de haptoglobina apresentam-se diminuídos nas hepatopatias graves, na 
anemia megaloblástica, nas situações de aumento da hemoglobina livre, como na hemólise de eritrócitos ou na 
reabsorção de grandes hematomas e na terapia com estrogênios e corticóides. Os níveis de ceruloplasmina aumen-tam 
na estrogenioterapia e se encontram diminuídos na doença de Wilson, na desnutrição, na síndrome nefrótica e nas 
enteropatias com perda de proteína. 
� Alfa-2-macroglobulina 
� Função: transporte hormonal e inibidor das enzimas proteolíticas 
� Siginificado clínico: Aumenta na síndrome nefrótica 
� Haptoglobina (50%) 
� Alfa-1-antiquimiotripsina (elevada nos processos inflamatórios agudos) 
� Alfa-2-macroglubulina 
� Função:transporte hormonal e inibidor das enzimas proteolíticas 
� Significado clínico: aumentado na síndrome nefrótica, hemólises, hepatite, neoplasias e cirrose. 
� Haptoglobina 
� Função:formar complexo protéico com a hemoglobina livre plasmática. 
� Significado clínico: aumentado nos processos inflamatórios agudos e diminuído nas doenças 
hemolíticas. 
 
BETA-GLOBULINAS 
Composta pelas beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento, beta-2-
microglobulina e antitrombina III. A redução dessa banda não é freqüente. A anemia por deficiência de ferro leva ao 
aumento da transferrina. O hipotireoidismo, a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se 
evidenciar pelo aumento de colesterol e conseqüente aumento das beta-lipoproteínas (LDL). A beta-globulina está 
freqüentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e menos freqüentemente em alguns casos de hepatite. Quase 
sempre, está elevada nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com sobreposição ou fusão das 
bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na 
artrite reumatóide. Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do complemento podem ocorrer 
em hipertensão maligna, doença de Cushing, poliarterite nodosa e carcinomas. 
• Transferrina: 
o Função: transporte de ferro plasmático 
o Significado clínico: aumentado na deficiência de ferro e reduzido nas hepatopatias crônicas 
• Complemento C3: 
o Significado clínico: aumentado nos processos inflamatórios agudos 
• Beta-lipoproteína (LDL) 
o Função: transporte do colesterol 
 
 
GAMAGLOBULINAS 
Composta pelas imunoglobulinas, predominantemente pela IgG. As imunoglobulinas A,M,D,E e proteína C 
reativa encontram-se na área de junção beta-gama. A ausência ou a diminuição da banda gama indica 
imunodeficiências congênitas ou adquiridas. O aumento dessa banda sugere o aumento policlonal das gamaglobulinas 
associadas a doenças inflamatórias crônicas, reações imunes, doenças hepáticas ou neoplasias disseminadas. 
As principais características das gamaglobulinas são: 
� Migram desde a zona beta; 
� Deficiência no uso da quimioterapia; 
� Aumentado nos processos crônicos, doenças hepáticas e mieloma. 
 
Bandas oligoclonais podem eventualmente ser observadas em infecções virais crônicas, em algumas infecções 
bacterianas como as pneumonias por pneumococos e as hepatites crônicas ativas. 
Tuberculose, sarcoidose, linfogranuloma venéreo e sífilis terciária são doenças crônicas que levam ao aumento 
dessa banda. Artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e outras colagenoses podem apresentar níveis normais a 
acentuadamente aumentados, dependendo da fasede atividade da doença. Níveis aumentados também são 
encontrados em linfomas malignos, doença de Hodgkin e leucemia linfocítica crônica. Tipicamente, a macroglobulinemia 
de Waldenström e o mieloma múltiplo exibem um pico homogêneo, que pode ou não resultar do aumento total da área 
gama. 
As hepatopatias cursam freqüentemente com aumento da banda das gamaglobulinas. Na hepatite, verifica-se 
um aumento das beta e gamaglobulinas com redução da albumina. Nas cirroses, o padrão mais sugestivo consiste na 
elevação da gamaglobulina de base ampla, juntamente com a fusão da beta e da gamaglobulina, sem a individualização 
dos picos da chamada ponte beta-gama. Apenas cerca de 20% dos cirróticos apresentam a fusão completa, e cerca de 
3% apresentam a fusão parcial. 
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As características particulares de cada imunoglobulina são: 
 
IgG (75%) IgA IgM 
� Peso molecular: 155.000 
Daltons (155 KDa) 
� Concentração: 700-1450 mg/dL 
� Imunoglobulina mais 
abundante: representa 75% das 
imunoglobulinas circulantes 
� Protege os espaços teciduais e 
atravessa livremente a placenta 
 vida-média de 22 dias. 
� Entre a 18a e 20a de gestação, 
a IgG é transportada 
ativamente através da placenta, 
fornecendo deste modo, a 
imunidade humoral para o feto 
e o recém-nascido, antes da 
maturação do sistema imune. 
� Valor de referência: 700-1.500 
mg/dL 
 
 
� Peso molecular: 170.000 Daltons 
(170 KDa) 
� Concentração: 90-450 mg/dL 
� Representa 7-15% das Ig 
plamáticas 
� Meia-vida: 6 dias 
� Abundante nas secreções 
� Barreira anti-séptica, protege as 
superfícies mucosas 
� Importante componente do 
colostro (primeira barreira 
imunológica) 
� Promove a fagocitose 
� Induz a degradação eosinófila 
� Valor de referência: 80-385 
mg/dL 
 
 
� Peso molecular: 950.000 
Daltons (950 KDa) 
� Concentração: 
� H: 55-220 mg/dL 
� M: 45-180 mg/dL 
� Contribui com 5-10% das 
imunoglobulinas 
� Meia-vida de 5 dias 
� É a primeira imunoglobulina 
sintetizado em resposta a um 
antígeno 
 
 
 
GAMOPATIAS 
• Tipo policlonal: forma não específica em uma grande variedade de infecções: aumento difuso das várias 
imunoglobulinas em toda região das gama globulinas observada na eletroforese de proteínas. Ex: Hepatopatia 
crônica, cirrose hepática (beta larga: fusão da beta-gamaglobulinas), hepatite crônica. 
 
• Monoclonal: 
� Denominada de Paraproteína 
� Caracteriza-se pela elevação de uma determinada imunoglobulina, formando um pico estreito na fração 
gamaglobulinas. 
� Proliferação de um só tipo de clone de plasmócitos que vão sintetizar um único tipo de imunoglobulina. 
� Ex: mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, calazar. 
 
 
MIELOMA MÚLTIPLO 
� Redução da produção da série branca e da série vermelha e de formação de plaquetas 
� Metastase óssea, apresentando dor óssea 
� Diminuição da produção de imunoglobulinas normais 
� Consequências:anemia e susceptibilidade à infecção 
� Em 50% dos casos de mieloma as cadeias leves são produzidas em maior quantidade do que as pesadas 
� Em 15% dos casos; apenas cadeias leves 
� Tratamento: 
� Drogas supressoras da medula óssea 
� Plasmaférese (substituição do plasma do paciente por plasma normal, com retenção dos seus próprios 
componentes celulares) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Arlindo Ugulino Netto – BIOQUÍMICA II – MEDICINA P2 – 2008.1 
 
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EXEMPLOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1, 3, 5, 8 - Padrão Normal 
2, 7 - Gamopatia Policlonal 
6 – Gamopatia Monoclonal (IgA) 
 
1, 4, 5, 8 - Padrão Normal 
2 - Gamopatia Policlonal 
3 - Gamopatia Monoclonal (IgA) 
6 - Gamopatia Monoclonal (IgG)