Biotecnologia -vetores de clonagem

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BIOTECNOLOGIA – FARMÁCIA 
MAIO E JUNHO/2019
W. Alber
H. Smith
D. Nathans
Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma sequência particular de nucleotídeos que seja o sítio de restrição da enzima;
Descritas em 1970,
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
6/7/2019
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural da Enzima de Restrição: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno 
6/7/2019
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Ex. A enzima BamHI reconhece a sequência dupla fita:
ER - reconhecem sequências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares
BamHI
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BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5’ G/GATCC 3’
EcoRI - Escherichia coli R
5’ G/AATTC 3’
HaeIII - Haemophilus aegyptius
5’ GG/CC 3’
PstI - Providencia stuartii
5’ CTGCA/G 3’
Nomenclatura:
6/7/2019
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes: 
- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) 
- Produção de terminais abruptos (ou cegos)
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 370 C, 1 hora, com tampão adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
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VETORES DE CLONAGEM (TRANSFERÊNCIA) DE GENES OU SEGMENTOS DE DNA
Vetor de clonagem – 3 componentes essenciais:
Uma origem de replicação;
Um gene marcador selecionável;
Pelo menos um sítio de clivagem da enzima de restrição
A) Plasmídeos 
São moléculas de DNA extra-cromossômico, circulares, bifilamentares → bactérias.
A maioria replica automaticamente;
Muitos têm genes para resistência à antibióticos (marcadores selecionáveis ideais) – ampicilina, tetraciclina
São usados para clonar fragmentos de DNA de 1kb até 15kb.
Tipos de Vetores
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Vetor de Clonagem Plasmidial
pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)
1- Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula)
2- Genes que conferem resistência a antibióticos
3- Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição
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Vetor de Expressão em Eucariotos
VETORES PLASMIDIAIS
6/7/2019
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O terminal coesivo de um fragmento de DNA doador liga-se com o terminal coesivo do DNA plasmidial através da DNA ligase → plasmídio com o fragmento do DNA doador.
O plasmídio é adicionado a uma suspensão de bactérias receptoras  transformação.
As bactérias geneticamente construídas são propagadas em grande quantidade e o produto (proteína) codificado pelo gene transferido é extraído da cultura e purificado. Ou outro caminho é colocar esta bactéria transformada com outro tecido e fazer a transferência do gene.
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B) Bacteriófago
A maioria à partir do cromossomo do fago do Bacteriófago λ que possui 48.502 pares de bases;
Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 23 kb;
Clonagem do DNA no Bacteriófago λ é baseado em duas carcaterísticas-chave do genoma do λ: a) um terço do genoma não é essencial e pode ser substituído pelo DNA estranho b) moléculas do DNA recombinante podem ser embaladas na cabeça do fago in vitro → partículas do fago podem injetar o DNA recombinante em células de E. coli que multiplicarão os clones de DNA recombinante.
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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
USO DE TÉCNICAS COLETIVAS PARA OBTER, AMPLIFICAR E MANIPULAR FRAGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA.
Desde a metade dos anos 70 – esta técnica revolucionou o campo da Biologia → abertura de áreas de pesquisa para investigação molecular.
Engenharia Genética: aplicação desta tecnologia à problemas específicos biológicos, médicos, agriculturais....
Genômica: extensão da tecnologia à análise global dos ácidos nucléicos presentes em um núcleo, uma célula, um organismo ou um grupo de espécies correlacionadas.
A capacidade de construir moléculas recombinantes é a base da tecnologia do DNA recombinante, que revolucionou a Biologia Molecular nas últimas três décadas.
PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE
- Como isolar amostras de segmentos individuais de DNA?
A princípio seria buscar uma agulha no palheiro!!!!
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 ENZIMAS
Uma amostra de moléculas contendo o gene de interesse = DNA doador 
2. Os fragmentos do DNA doador são inseridos em cromossomos acessórios não essenciais → VETORES
Tecnologia do DNA recombinante requer:
Construção da molécula recombinante;
Amplificação dessas moléculas recombinantes (produção de cópias ou clones) → garantir que o DNA da molécula recombinante seja capaz de auto-replicação;
Inserção do gene ou sequencia de DNA de interesse em um vetor de clonagem.
VETOR DE CLONAGEM – 3 componentes essenciais:
Uma origem de replicação;
Um gene marcador (repórter) dominante selecionável (resistência à antibiótico, produção de algum composto...);
Pelo menos um único sítio de clivagem da endonuclease de restrição.
PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINENTE
Etapas:
Escolha do DNA:
DNA genômico – obtido diretamente do cromossomo;
cDNA (complementar) – versão bifilamentar do DNA à partir de um RNAm (sem íntrons); 
DNA sintetizado quimicamente - é necessário a sequência ser conhecida.
2. Cortando o DNA genômico:
- Enzimas de restrição – cortam as sequências alvo específicas = sítios de restrição → geram fragmentos de restrição
Finalidade da tecnologia do DNA recombinante: 
– estudo de genes,
transgênicos,
produção de biomoléculas....
Por exemplo:
Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.
Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obter várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano.
 
Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. 
Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. 
Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).
 Construção de uma Bactéria pela Engenharia Genética
Obtenção do gene do organismo doador ou, em alguns casos, pode ser sintetizados em laboratório por nucleotídeos artificiais.
DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem) é isolado para servir como carreador de determinado gene.
O DNA doador e o plasmidial são tratados com a mesma enzima, uma endonuclease de restrição, que cliva o DNA, formando fitas simples com terminais complementares (“terminais coesivos”). Esses são capazes de ligar-se a outros fragmentos de DNA que apresentam o mesmo terminal complementar das fitas simples.
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Exemplo de aplicação: PRODUÇÃO DA INSULINA HUMANA – BACTÉRIAS TRANSGÊNICAS
Onde se localiza o DNA na célula?
Os passos básicos envolvidos na extração do DNA consistem de:
O DNA PODE SER EXTRAÍDO DE QUALQUER TIPO CELULAR!!
Lise celular. O primeiro passo envolve a quebra da célula para acessar o DNA. Isto pode ser feito utilizando métodos físicos ou químicos.
Remoção de lipídios. Remoção ou separação da membrana lipídica e restos celulares. Isto normalmente é feito utilizando detergentes como SDS, e por centrifugação.
Desproteinação do extrato celular. A desnaturação proteica é feita utilizando proteases como pronases e proteinases K. Após a desnaturação, as proteínas são separadas do extrato celular.
Remoção do RNA. A remoção do RNA é feita adicionando uma RNAse, que rapidamente degrada RNA em subunidades ribonucleotídeas.Este passo normalmente é opcional na maioria dos kits.
Precipitação/agregação/eluição de DNA
Quantificação do DNA: espectrofotômetro
 Nanodrop (espectofotômetro)  260 nm
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Quantificação de DNA: Em gel de agarose
EXTRAÇÃO DE DNA - DROSOFILA
http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=5253
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR é uma técnica para amplificação de uma região específica do DNA, a qual é definida por um par de iniciadores ou "primers". Estes primers atuam como iniciadores para a síntese da molécula por uma DNA polimerase termoestável. 
O número de cópias da sequência do DNA aumenta exponencialmente, e após 30 ou 40 ciclos de amplificação o DNA pode ser observado no gel de eletroforese. As regiões amplificadas usualmente apresentam entre 150 a 3.000 pb.
Características da PCR
- Mullis & Faloona (1987) e Saiki et al. (1985)
- Premio Nobel de Medicina para Kary Mullis
- Primers específicos
- Taq DNA polimerase e termociclador
- Baixo custo de implantação
- 3 etapas:	  Desnaturação (94oC)
		  Anelamento (50 - 65oC)
	 	  Extensão dos primers (72oC)
Amplificação de sequências de DNA pela PCR - reação em cadeia da Polimerase:
Hoje – muitas sequências completas ou quase completas de nucleotídeos de muitos genomas (incluindo humano);
Disponibilidade destas sequências de genomas → Gen Bank e outros bancos de dados;
Permitem o isolamento de genes ou sequências de DNA de interesse sem uso de vetores de clonagem ou células hospedeiras;
Amplificação do DNA é totalmente in vitro → a sequência pode ser amplificada mais de 1 milhão de vezes em algumas horas;
É necessário conhecer curtas sequências de nucleotídeos flanqueadoras da sequência de interesse → PCR;
Amplificação específica do DNA é definida por primer – atua como iniciador para a síntese da molécula pela DNA polimerase;
Sequências de DNA aumentam exponencialmente.
Etapas do processo:
- Extração do DNA da amostra que se pretende estudar ;
- Purificação do DNA ;
- Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à síntese de novas cópias de DNA ;
- Incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando o/os tubo/s;
 
-Eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida dos produtos da PCR ;
- Revelação e fixação do gel.
Trabalhando com PCR convencional
1. Etapas Pré- PCR:
Coleta da Amostra
Estabilização
Extração do Ácido Nucleico
2. PCR ou Ciclagem:
Preparo da Reação
Termociclagem
3. Pós-PCR:
Análise em Gel
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Reagentes da PCR:
PCR – etapas:
I - DNA genômico, com sequência a ser amplificada é desnaturado : 92-95º (30seg);
II – DNA genômico é helicoidizado aos primers de oligonucleotídeos sintéticos, incubados juntos : 50 – 60º (30 seg);
III – DNA polimerase replica os segmentos de DNA entre os sítios complementares aos primers.
Primer = fornece 3`- OH → necessários para amplificação covalente e o DNA genômico fornece o molde.
Polimerização – 70-72º (1,5min).
 ↓
PRODUTOS DO 1º CICLO DE REPLICAÇÃO SÃO ENTÃO DESNATURADOS, HELICOIDIZADOS A PRIMERS E NOVAMENTE REPLICADOS PELA POLIMERASE .....Repetidos várias vezes!!!!!
PCR – aplicações da tecnologia:
Atalho para muitas aplicações que necessitam de grandes quantidades de uma sequência específica de DNA;
Permite a obtenção de dados estruturais de genes e sequências de DNA, quando estão disponíveis em quantidades muito pequenas de DNA;
Aplicado no diagnóstico de doenças humanas herdadas, especialmente no pré-natal (pouco DNA fetal disponível);
Forense – identificação de pessoas por meio de DNA isolado de amostras muito pequenas → fingerprinting de DNA com PCR;
Estudos de variabilidade genética;
Detecção de patógenos;
Técnica básica de estudos moleculares.
No ser humano o gene da leptina localiza-se no cromosso 7q31. A leptina tem 167 aminoácidos e peso molecular de 16 kd; sua estrutura cristalina mostra semelhança com inúmeras citocinas. A leptina é produzida no tecido adiposo branco e, em menor proporção, pelo tecido adiposo marrom, pelos folículos de Graaf e placenta. A leptina circula no plasma de forma livre ou ligada a proteínas e são significativamente maiores em pesoas obesas que nas pessoas magras, sendo 2-3 vezes maiores nas mulheres.  
Diagnóstico molecular – gripe aviária
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Diagnóstico molecular – meningite e penuemonia bacteriana
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 HIV
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Aplicações
Teste de Identificação de indivíduos
polimorfismo
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Ao sair do termociclador, a aparência do gel é a mesma;
Após a revelação da região amplificada – aparecem as bandas de DNA.
http://teach.genetics.utah.edu/
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POLIMORFISMOS DE COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS RESTRIÇÃO (RFLP)
Polimorfismos de comprimentos de fragmentos de restrição (RFLP) – grupo de marcadores que são variações (polimorfismos) nos padrões dos fragmentos produzidos quando as moléculas de DNA são cortadas com a mesma enzima de restrição.
Estas diferenças são herdadas e podem ser usadas no mapeamento, similar ao modo pelo qual as diferenças alélicas são usadas para mapear genes convencionais.
Aplicações do RFLP
O RFLP é usado para diversas aplicações genéticas da análise desde sua invenção, por exemplo:
Para determinar o estado de doenças genéticas tais como a Fibrose Cística entre outras doenças genéticas, em um indivíduo;
Para determinar ou confirmar a fonte de uma amostra do DNA como em testes ou investigações penais de paternidade;
No traço genético para determinar as taxas de recombinação que mostram a distância genética entre os locus;
Para identificar um portador de uma mutação em uma família.
FINGERPRINTING DE DNA (análise do perfil de DNA)
 ↓
 Identificação de indivíduos
Polimorfismos : VNTR, STR e SNP
Minissatélite
VNTR
Microssatélite
STR
TIPOS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS
Polimorfismo em sequência não-codificadora (95% DNA): intergênica ou dentro de íntrons →
ESTIMATIVA DE BASES POLIMÓRFICAS: 1:1000 pb
sem consequência para o funcionamento do gene
sem alterar proteínas
Aplicações de análise de polimorfismos:
Utilização como marcador genético: análise de ligação
Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas
Detecção de portador heterozigoto 
Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete
Teste de paternidade e aplicações forenses
Tipagem tissular para transplante de órgão
POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA SIMPLES (SSLP): 
- arranjos de sequências repetidas com variação no comprimento devido diferentes números de unidades repetidas (multi-alélicos).
MINISSATÉLITES (VNTR): Número Variável de Repetições em Tandem
unidades repetidas de DNA com 10- 80 pb , 
MICROSSATÉLITES (STR): Repetições em Tandem Curtas
 unidades repetidas de 2-10 pb
MINISSATÉLITES (VNTR): unidades repetidas de DNA com 10- 80 pb, resultam de inserção em tandem. Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) → sítio p/ recombinação homóloga.
Utilizados como marcadores polimórficos: datiloscopia de DNA (DNA fingerprinting)
Doença Ligada ao X (recombinação=0)
Diagnóstico de Doença 	Genética
POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO – SNP:
Mudanças de um único nucleotídeo distribuídas por todo o genoma.
Aproximadamente 1:1350 pb no genoma
Cerca de 1.42 milhões de SNPs no genoma 
Polimorfismos com dois alelos
Aplicações: marcadores de mapeamento genético; antropologia molecular (evolução) e comparação entre diferentes populações (epidemiologia molecular)
Detecção: Chips de DNA (hibridização de nucleotídeos)
Inclusão de paternidade (RFLP) com sondas MS1, MS31, MS43 e MS621. Na coluna 1, 2 e 3 observam-se as bandas de DNA da mãe, do filho e do suposto pai, respectivamente. Facilmentedetectamos as bandas maternas(M), presentes no filho, sendo que as bandas paternas (P) estão também presentes no investigado. Os marcadores de peso molecular encontram-se nas laterais.
SEQUÊNCIAMENTO DE DNA - GENOMAS
É um processo que determina a disposição dos nucleotídeos ao longo de um dado fragmento de DNA. 
É feito através de técnicas manuais ou automatizadas, baseadas na identificação do último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento de uma molécula de DNA marcada, ou seja, a fita complementar simples da qual se deseja determinar a sequência. 
Portanto, é a identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA.
OGMS – ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS - TRANSGÊNICOS
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OGM - ser vivo que teve seu material genético modificado artificialmente. 
Transgênico - ser vivo que teve introduzido em seu genoma um material genético de outro ser vivo diferente.
Por exemplo, de bactérias que recebem genes humanos para produzir insulina, depois usada como medicamento por diabéticos.
O que são OGMs e transgênicos???
Na agricultura:
Os transgênicos mais comuns são os do tipo Bt, referência à bactéria Bacillus thuringiensis, e aqueles que são tolerantes a herbicidas. 
O milho Bt, por exemplo, tem um gene da Bacillus thuringiensis responsável pela produção de proteínas tóxicas a insetos. 
Já a soja RR, por exemplo, tem em seu genoma trecho do DNA de uma bactéria que a faz resistente ao glifosato — assim, é possível aplicar o pesticida, matar as ervas daninhas e preservar a soja intacta.
QUANDO os transgênicos surgiram 
Melhoramento genético das espécies, especialmente das alimentícias, é bem antiga - está relacionada com o próprio nascimento da agricultura, há pelo menos 10 mil anos. 
A domesticação das plantas e a prática de seleção e hibridação, que foram gerando variedades cada vez mais produtivas e resistentes de alimentos como o trigo, arroz ou cevada, aconteceram antes mesmo que a ciência definisse o que são e do que são feitos os genes. 
Técnicas de cruzamento de espécies foram sendo aprimoradas, em função de necessidades produtivas, especialmente a partir do século 19 e no começo do século 20. 
Na década de 1970, então, o melhoramento genético deu um grande salto, com a criação da tecnologia do DNA recombinante: inserir trechos de DNA de uma espécie no genoma de outra espécie sexualmente não compatível. 
Técnicas de cruzamento de espécies foram sendo aprimoradas, em função de necessidades produtivas, especialmente a partir do século 19 e no começo do século 20. 
Stanley N. Cohen
 Stanford University
Herbert Boyer
University of California em San Francisco (UCSF)
Especialista em enzimas de restrição
Pioneiro no estudo com os plasmídeos
Os primeiros engenheiros genéticos do mundo (humanos)
Em 1978, Boyer, que fundou a empresa Genetech, conseguiu fazer com que uma bactéria, a partir da introdução de DNA humano em seu genoma, produzisse insulina, hormônio fundamental na regulação do nosso metabolismo 
Entre 1982 e 1983, foram criados os primeiros vegetais transgênicos: plantas de tabaco resistentes a herbicidas, nos Estados Unidos e na França Os primeiros testes em campo desses vegetais ocorreu em 1986.
Em 1992, a China foi o primeiro país a permitir o comércio de plantas transgênicas —uma espécie de tabaco resistente a vírus. 
E, por fim, 1994, os Estados Unidos autorizaram a entrada no mercado do primeiro alimento transgênico: um tipo de tomate chamado Flavr Savr, que demorava mais tempo para estragar .
No Brasil, os transgênicos chegaram ao mercado em 1998, quando o cultivo da soja Roundup Ready, criada pela Monsanto para resistir ao herbicida Roundup, que ela mesmo produz, foi autorizado pelo governo.
Frutos com retardo no tempo de amadurecimento
Transgênico
Não- transgênico
Primeiro alimento transgênico a ser comercializado nos EUA – Tomate Flavr Savr( ou "flavor saver“) em1994 pela empresa Calgene da California – durou apenas 3 anos no mercado
Modificados para retardar o amadurecimento pela tecnologia antisense
 Transgênicos
Uma imagem clássica da engenharia genética: uma planta de tabaco transgênica contendo o gene da luciferase do vaga-lume demonstra o poder e o potencial da manipulação genética
(Gene reporter)
Science, Nov 1986
As biofábricas têm aplicações em diversos setores da economia como energia, agricultura e setor industrial.
A utilização da cana-de-açúcar e do milho para obtenção de biocombustíveis ou, até mesmo, a fabricação de teias sintéticas através de bactérias são exemplos práticos de biofábricas. 
O setor da saúde também acompanha este progresso e surge uma nova variedade de drogas, os chamados biofármacos. 
Os biofármacos ou medicamentos biológicos diferem dos convencionais em sua composição e são estruturalmente parecidos com moléculas produzidas pelo corpo humano, o que os torna mais eficazes. 
O organismo vivo utilizado como base varia, pois, para cada molécula estudada, deve-se escolher a melhor biofábrica para produzi-la, embora as plantas tenham se destacado nesse aspecto.
Insulina: primeira droga resultante da tecnologia do DNA recombinante
O controle do diabetes requer injeções regulares de insulina, que o corpo não produz (diabetes tipo I) ou produz em quantidade insuficiente (Tipo II)
Diabetes tipo I- Letal até 1921
Os seres humanos podem usar a insulina de animais domesticados, de porcos e vacas, que difere ligeiramente da insulina humana  podem provocar efeitos adversos nos pacientes e risco de alergias a estas proteínas
Insulina  mina de ouro biotecnólogica
1982: a insulina transgênica entra no mercado pela Eli Lilly sob licença da Genentech.
Insulina: hormônio que regula os níveis de glicose no sangue por afetar a captação celular de glicose. O diabetes é resultante de uma produção inadequada de insulina
Produção em larga escala de insulina recombinante
Fonte:http://www.biomm.com/pt/
Cientistas argentinos criaram 4 vacas clonadas e modificadas geneticamente capazes de produzir insulina humana em seu leite,um passo que pode cortar o custo do tratamento do diabetes
As vacas chamadas Patagonia 1,2,3 e 4 irão começar a produzir o hormônio humano quando atingirem a idade adulta
Custo reduzido
O leite extraído da vaca é refinado para a purificação da insulina
Hormônio do crescimento humano (hGH)
Em 1959 os médicos começaram a tratar casos de nanismo com HGH, que na época só poderia ser obtido do cérebro de cadáveres
O tratamento funcionava bem , embora mais tarde se verificou que havia o risco de se contrair a doença de Creutzfeldt-Jakob/ 1985 a FDA proibiu o uso de hGH de cadáveres
Outras aplicações terapêuticas desse produto (envelhecimento, osteoporose, recuperação de fraturas, perda de massa muscular na Aids) estão sendo pesquisadas. Todo o hGH utilizado no Brasil é importado e existe carência no mercado.
Doença de Creutzfeldt-Jakob: doença neurodegenerativa
A pesquisa que deu início ao uso de plantas para este recurso ocorreu em 1986, com a extração de um hormônio de crescimento humano por meio de folhas de tabaco transgênico (Nicotiana tabacum).
Além do tabaco, a soja (Glycine max), vem sendo estudada para criar substâncias que serão utilizadas na batalha contra o câncer de mama, conforme pesquisa desenvolvida pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), Unicamp (Universidade de Campinas) e UnB (Universidade de Brasília).
Obtenção de fármacos transgênicos à partir de plantas
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - Elíbio Rech, descobriu que plantas de soja transgênicas também seriam uma biofábrica ideal para produzir uma molécula protéica chamada Cianovirina, eficaz na redução de contágio de AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida). 
O estudo é uma parceria entre a Embrapa e o Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH, sigla em inglês).
A Cianovirina é uma proteína sintetizada poralgas marinhas da espécie Nostoc ellipsosporum e seus efeitos positivos no tratamento da AIDS já eram conhecidos por pesquisadores, porém, a dificuldade estava em produzir a proteína em grandes quantidades. 
Algumas biofábricas foram testadas, entre elas outras plantas, inclusive o próprio tabaco, e bactérias como E. coli, mas a soja mostrou-se mais eficiente fornecendo uma maior quantidade da proteína, que fica armazenada em suas sementes, e o menor custo de investimento em pesquisa.
 Anticoagulantes
 vacinas (hepatite B)
 Anticorpos monoclonais
 Transplantes (medicamentos recombinantes evitam a rejeição)
 ainda em estudo: medicamentos recombinantes para esclerose múltipla, artrite reumatoide, etc...
Mercado que movimenta bilhões de dólares e envolve patentes
As 10 drogas biológicas campeãs de vendas
OBTENÇÃO DE TRANSGÊNICOS – MÉTODOS:
Métodos de alteração gênica baseados em Agrobacterium (1983)
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Modo de infecção Agrobacterium tumefaciens
A bactéria envia para a célula vegetal um “pacote” do seu material genético que é integrado ao DNA da célula hospedeira
Biobalística
O gene desejado é afixado em minúsculos grânulos de ouro ou tungstênio, que são literalmente disparados contra a célula como balas de revólver
O método carece da sutileza de Agrobacterium, mas nem por isso deixa de ralizar o serviço!
Alimentos enriquecidos, ricos em aminoácidos...
Golden rice – arroz dourado
Arroz, produz um precursor da vitamina A, o betacaroteno
Deficiência de vitamina A afeta mais de 200 milhões de pessoas
Cerca de 500.000 crianças cegas
2 milhões de crianças com menos de 5 anos morrem
Iniciativa feita pela Fundação Rockefelller (não-lucrativa)
Banana vacina contra diarréia
vacinas comestíveis:
As plantas poderiam crescer no local onde fossem necessárias, sem muitos custos
 não necessitam ser refrigeradas, pois o alimento protege as proteínas da degradação. E, dentro das células vegetais, as vacinas encontram-se protegidas do suco gástrico, sendo liberadas gradativamente já no intestino delgado. 
1995 – Arntzen,do Texas A&M University, fez plantas de tabaco que produziam o antígeno para o vírus da hepatite B; testou em ratos e estes se tornaram imune à doença. William H. R. Langridge da Loma Linda University obteve tomates e batatas com vacinas para as três principais causas da diarréia. Alimentando animais com estes alimentos conseguiram respostas positivas de imunidade mucosal e sistêmica, e não contraíram a doença quando expostas aos agentes patológicos reais 
Plantas transgênicas já aprovadas no Brasil
 APROVAÇÃO DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS NO BRASIL
Basicamente há dois tipos de alimentos transgênicos: os tolerantes a herbicidas e os resistentes a insetos
Há dois tipos de herbicida: o glifosato, análogo à glicina, e o glufosinato, análogo à homoalanina. O primeiro ficou famoso porque foi introduzido pela Monsanto (tecnologia RR de round up ready) e o segundo pertence à Bayer (tecnologia LL, Liberty Link). No primeiro transgênico introduz-se um gene que faz uma enzima que resiste ao herbicida RR: todas as outras plantas morrem, exceto o transgênico. O glifosato inibe a enzima que está na via do shikimato, precursor dos aminoácidos aromáticos, que não existe nos vertebrados.
Feijão carioquinha
Modificação no DNA faz com que a carne desses suínos produza ômega-3, o ácido graxo que faz bem ao coração e previne o câncer (2004)
Porquinhos light – contendo ômega-3
A empresa americana de biotecnologia Aqua Bounty criou um salmão geneticamente modificado que cresce 50 vezes mais do que o comum. O resultado foi obtido com a introdução em seu DNA de um gene de outro peixe que atua como promotor de crescimento
Salmão transgênico
"Já fizemos de tudo para comprovar que nosso peixe não difere em nada dos outros e não oferece nenhum risco para a saúde. Mesmo assim, a aprovação da FDA não sai", disse a VEJA Joseph McGonigle, vice-presidente da Aqua Bounty. 
Produtos com Componentes Transgênicos 
Em torno de 2 bilhões de pessoas ingerem, direta ou indiretamente, alimentos com componentes transgênicos
 Rotulagem dos transgênicos: 
O rótulo da embalagem deve informar que o produto é um alimento transgênico, contém ou foi fabricado a partir de ingrediente transgênico.
LEI FEDERAL 8.078/90
O consumidor tem direito de saber qual matéria-prima, corante ou conservante foi utilizado em determinado produto para que, assim, lhe seja garantido o direito de escolha para os alimentos em geral.
LEI FEDERAL 11.105/05
“Os alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de OGM ou derivados deverão conter informação nesse sentido em seus rótulos
PORTARIA 2.658/03
O Ministério da Justiça publicou a portaria definindo que no rótulo dos produtos elaborados com ingrediente transgênico deve constar um símbolo, um triângulo com a letra T.
http://revistapesquisa.fapesp.br/2013/04/12/remedio-na-planta/
file:///C:/Users/Usuario/Downloads/114-356-1-PB.pdf
TERAPIA CELULAR E TERAPIA GÊNICA
Terapia celular, células-tronco e terapia gênica
Terapia celular - utilização de células com objetivos terapêuticos. Podem ser injetadas endovenosamente para exercerem ações sistêmicas ou atingirem órgãos e tecidos protegidos, como a medula óssea ou o SNC.
As células usadas para fins da terapia celular também variam amplamente com relação ao seu estado de maturação e diferenciação. 
Podem ser utilizadas células maduras do sangue periférico como eritrócitos, leucócitos e plaquetas como acontece, por exemplo, nas transfusões sanguíneas, ou ainda linfócitos ou células dendríticas sensibilizados in vitro nas chamadas vacinas celulares. 
Também células-tronco → reparo ou mesmo a total substituição de um tecido ou órgão lesado. Neste último caso temos o exemplo, consolidado por mais de 40 anos de experiência, dos transplantes de células-tronco hematopoéticas derivadas da medula óssea, do sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical e que são capazes de reconstituir todo o sistema hematopoético.
CÉLULAS-TRONCO
Terapia gênica é o tratamento baseado na introdução de genes sadios com uso de técnicas de DNA recombinante. 
Modalidades de terapia gênica
A ideia de usar as técnicas de DNA recombinante para corrigir o genoma foi inspirada nas doenças causadas por mutação em um único gene (ditas doenças monogênicas). 
Nesse caso, a ideia é substituir ou suplementar a expressão do gene disfuncional, mediante a inserção de uma ou mais cópias do gene terapêutico.
Mas as doenças monogênicas não são o único alvo da terapia gênica. 
A medicina moderna luta contra muitas doenças complexas, cujas causas primárias ainda não são conhecidas e para as quais há, na melhor das hipóteses, apenas tratamentos paliativos. Em certos casos, é possível planejar uma intervenção por meio de terapia gênica, visando reduzir ou evitar a progressão da doença. 
EXEMPLOS:
http://veja.abril.com.br/saude/a-cura-pelos-genes/
APLICAÇÕES:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-40142010000300004
Vacina de DNA. 
Nessa, ao invés da utilização de uma proteína ou um vírus completo inativado, como se faz nas vacinas convencionais, o paciente recebe o gene que codifica uma proteína típica do agente agressor. 
Dessa forma, o organismo do paciente passará a fabricar permanentemente a proteína exógena, estimulando seu próprio sistema imune. 
Essas vacinas podem ter finalidade preventiva, de forma semelhante às vacinas clássicas, ou curativa, levando o sistema imune a atacar os agentes agressores já instalados no organismo.
 
O que é genômica?
Genômica Funcional 
Genoma: soma de todos os genes de um organismo
Transcriptoma: soma de todos os transcritos (mRNAs) 
Proteoma: soma de todas as proteínas
Metaboloma: soma de todos os metabólitos 
Estudoda regulação dos genes, suas funções bioquímicas e fisiológicas, e interação entre genes associados a diferentes processos biólógicos .
Proteômica → Em 1996 “Caracterização em larga escala do conjunto de proteínas expressas (proteoma) em uma célula ou tecido” 
PROJETO GENOMA HUMANO
GENOMA
Genoma = conjunto de todo o material genético que define um ser vivo. É representado principalmente pelo DNA, na maioria dos seres vivos, e mais raramente pelo RNA, como no caso de alguns vírus.
Genômica = estudo do tamanho, da estrutura física e da sequência de informações contidas no DNA de um organismo.
Bioinformática = interpretações do significado da informação contida nos dados de sequência;
Proteômica = dá uma visão de como são integradas as estruturas e funções de todos os produtos finais (proteínas) dos genes em um tipo específico de célula.
O PROJETO GENOMA HUMANO
Iniciado em 1990, O Projeto Genoma Humano foi coordenado por 13 anos pelo Departamento de Energia do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos. 
Foi completado em 2003.
As principais metas do Projeto Genoma Humano foram:
· identificar todos os genes humanos,
· determinar a sequência dos cerca de 3,2 bilhões de pares de bases que compõem o genoma do Homo sapiens,
· armazenar a informação em bancos de dados,
· desenvolver ferramentas de análise dos dados,
· transferir a tecnologia relacionada ao Projeto para o setor privado,
· colocar em discussão os problemas éticos, legais e sociais que pudessem surgir com o Projeto.
Objetivos específicos
O principal objetivo do Projeto Genoma Humano foi o de gerar sequência de DNA de boa qualidade para os cerca de 3,2 bilhões de pares de bases e identificar todos os genes humanos. 
Também incluíam o sequênciamento de genomas de organismos modelos - comparações entre camundongo e humanos, estudar a variabilidade humana, e treinar cientistas para trabalhar com genômica.
Alguns resultados obtidos na primeira publicação da sequência:
· o genoma humano contem 3,2 bilhões de nucleotídeos;
· o tamanho médio dos genes é de 3.000 bases, mas varia muito, sendo o maior deles o gene da distrofina com 2,4 milhões de pares de bases;
· a função de cerca de 50% dos genes descobertos é desconhecida;
· a sequência do genoma humano é 99,9% exatamente a mesma em todas as pessoas;
· cerca de 2% do genoma codifica instruções para a síntese de proteínas;
· sequências repetidas que não codificam proteínas constituem mais do que 50% do genoma humano;
· Não são conhecidas as funções para as sequências repetidas, mas elas ajudam a entender a estrutura e a dinâmica dos cromossomos. Através dos anos essas repetições reformulam o genoma rearranjando-o, criando desse modo genes inteiramente novos ou modificando genes já existentes;
· o genoma humano possui mais sequências repetidas (50%) do que Arabdopsis thaliana (11%), o verme C. elegans (7%), e Drosophila (3%);
· 40% das proteínas humanas compartilham similaridade com as proteínas de moscas e de vermes;
· Genes estão concentrados em áreas, ao acaso, ao longo do genoma, com vastas sequências sem código para proteínas entre eles;
· O cromossomo 1 (o maior do genoma humano) tem o maior número de genes - 3.168 – e o cromossomo Y, o menor - 344.
 
· Algumas sequências gênicas específicas foram associadas com numerosas doenças e disfunções, incluindo câncer de mama, doenças musculares, surdez e cegueira;
· Os cientistas localizaram, no genoma humano, milhares de locais nos quais há diferença de apenas uma base. Essa informação promete revolucionar o processo de encontrar sequências de DNA associadas com doenças muito comuns tais como disfunções cardiovasculares, diabetes, artrite e câncer.