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2 Sumário Módulo 1 – Estrutura e Função .................................................................................... 3 Introdução as aulas práticas .......................................................................................... 3 Substâncias Halocrômicas como indicadoras de pH .................................................... 6 Anexo – Questionário 2 ............................................................................................. 18 Tamponamento de Aminoácidos ................................................................................ 21 Anexo – Questionário 3 .............................................................................................. 35 Módulo 2 – Quantificação ............................................................................................ 40 Quantificação de substâncias a partir de princípios básicos da espectrofotometria ... 40 Anexo – Questionário 1 .............................................................................................. 46 Curva padrão para quantificação de substâncias ........................................................ 49 Anexo – Questionário 2 .............................................................................................. 61 Módulo 3 – Enzimas ..................................................................................................... 63 Introdução as Enzimas ................................................................................................ 63 Anexo – Questionário 1 .............................................................................................. 69 Quantificação da atividade enzimática e identificação de parâmetros cinéticos ........ 71 Anexo – Questionário 2 .............................................................................................. 81 Atividade de moduladores sobre a atividade da Pirofosfatase.................................... 83 Anexo – Questionário 3 .............................................................................................. 97 Módulo 4 – Metabolismo ............................................................................................ 101 Metabolismo da glicose: fermentação ...................................................................... 101 Anexo – Questionário 1 ............................................................................................ 112 Determinação da atividade de Succinato desidrogenase .......................................... 117 Anexo – Questionário 2 ............................................................................................ 123 Estresse oxidativo ..................................................................................................... 125 Anexo – Questionário 3 ............................................................................................ 131 Referências .............................................................................................................. 135 3 Módulo 1 – Estrutura e Função Aula prática 1 Introdução as aulas práticas Referente as soluções 1: 1. Qual é a massa molar (Mm) do cloreto de sódio? E da sacarose? 2. Qual o volume final da solução de cloreto de sódio? E da sacarose? 3. Qual a quantidade de cloreto de sódio em gramas? E de sacarose? 4. Qual a quantidade de cloreto de sódio em mols? E de sacarose? 5. Qual a concentração de cloreto de sódio em g/L? E em mg/mL? 6. Qual a concentração de sacarose em g/L? E em mg/mL? 7. Qual a concentração de cloreto de sódio na solução em molar (M)? E em milimolar (Mm)? 8. Qual a concentração de sacarose na solução em molar (M)? E em milimolar (Mm)? Referente as soluções 2: 1. Qual o volume final da solução de cloreto de sódio? E da sacarose? 2. Qual a quantidade de cloreto de sódio em gramas? E de sacarose? 3. Qual a quantidade de cloreto de sódio em mols? E de sacarose? 4. Qual a concentração de cloreto de sódio em g/L? E em mg/mL? 5. Qual a concentração de sacarose em g/L? E em mg/mL? 6. Qual a concentração de cloreto de sódio na solução em molar (M)? E em milimolar (Mm)? 7. Qual a concentração de sacarose na solução em molar (M)? E em milimolar (Mm)? 8. Qual o fator de diluição da solução 2 em relação a solução 1 (quantas vezes a solução 1 foi diluída)? Responda para as soluções de NaCl e sacarose. 4 5 6 Aula prática 2 Substâncias Halocrômicas como indicadoras de pH Parte I - Tamponamento de aminoácidos Introdução Nosso organismo desempenha diversas funções para manter o equilíbrio e o bom funcionamento de todas as estruturas. Entre elas está o tamponamento, que consiste em uma solução aquosa que neutraliza variações no pH em sistemas biológicos. O tamponamento ocorre da seguinte forma: quando há muitos íons H+, o tampão absorve alguns e eleva o pH. O mesmo acontece da forma inversa, quando há poucos íons H+, o tampão doará alguns dos seus, aumentando o pH. Sendo assim, os tampões geralmente consistem em um par ácido-base conjugado. Material e métodos Nessa atividade, os materiais utilizados foram: • 4 frascos Erlenmayer • Solução de glicina 50 mM • Solução de ácido glutâmico 50 mM • Solução NaOH 0,1N • Solução NaOH 1N • Solução HCl 0,1N • Solução HCl 1N • Fitas indicadoras de pH O experimento iniciou-se com a pipetagem de 10mL de solução de glicina 50mM em um frasco Erlenmayer. Após, o pH da solução foi medido através de fitas indicadoras e registrado. Em seguida, adicionaram-se 0,5mL de solução NaOH 0,1N, o frasco foi agitado e o pH foi medido e registrado novamente. 7 Esse procedimento repetiu-se mais três vezes, totalizando 2,5mL de solução NaOH 0,1N adicionados. A cada adição de 0,5mL de NaOH 0,1N o pH foi medido e manteve-se constante nas quatro últimas medições. Sendo assim, passou-se a utilizar uma solução 10 vezes mais concentrada de NaOH. Posteriormente, o processo foi reiniciado, porém utilizando-se uma solução de NaOH 1N. Ainda no mesmo frasco Erlenmayer, foram pipetados 0,5mL da solução NaOH 1N e o pH foi medido com uma fita. Novamente, foram adicionados 0,5mL da solução até o pH manter-se o mesmo, sendo medido a cada adição desse volume. Ao final, o volume total pipetado foi de 3,5mL. Além disso, o volume total no frasco contendo as duas soluções de NaOH foi de 6mL. Após, deu-se continuidade para o experimento. Em um frasco Erlenmayer limpo, foram adicionados novamente 10mL de solução de glicina 50mM e, dessa vez, pipetaram- se 0,5mL de uma solução de HCl 0,1N. O restante do procedimento foi semelhante ao já descrito com a solução de NaOH. Foram pipetados 0,5mL de solução HCl 0,1N e mediu- se o pH a cada adição desse volume. Quando o pH se tornou estável (após 1,5mL de solução HCl 0,1N), a solução foi trocada por HCl 1N, 10 vezes mais concentrado. A atividade repetiu-se com a adição de 0,5mL da solução de HCl 1N, medindo-se sempre o pH. Por fim, o pH estabilizou-se após a adição de 1,5mL de solução. O volume total no frasco foi de 3,5mL, com a junção das soluções de HCl 0,1N e 1N. Em seguida, todo esse procedimento descrito repetiu-se da mesma forma, porém utilizando-se uma solução de ácido glutâmico. A tarefa iniciou-se com a pipetagem de 10mL da solução de ácido glutâmico 50mM e, posteriormente, utilizaram-se as soluções de NaOH 0,1N e 1N e HCl 0,1N e 1N para a adição dos volumes de 0,5mL. O pH também foi medido e registrado a cada adição do volume. Resultados Os valores de pH e volumes adicionados em cada frasco foram registrados e descritosnas tabelas abaixo. 8 Tabela 01. Aminoácido: glicina NaOH HCl Concentração da solução Volume adicionado pH medido Volume adicionado pH medido 0,1N 0 5 0 5 0,5mL 8 0,5mL 3 0,5mL 9 0,5mL 3 0,5mL 9 0,5mL 3 0,5mL 9 - - 0,5mL 9 - - 1N 0,5mL 10 0,5mL 2 0,5mL 11 0,5mL 1 0,5mL 12,5 0,5mL 1 0,5mL 12,5 0,5mL 1 0,5mL 13 - - 0,5mL 13 - - 0,5mL 13 - - Imagem 1. Fitas medidoras de pH utilizadas nas soluções com NaOH 0,1N. 9 Imagem 2. Fitas indicadoras de pH utilizadas nas soluções com HCl 0,1N (esquerda) e 1N (direita). Tabela 02. Aminoácido: ácido glutâmico NaOH HCl Concentração da solução Volume adicionado pH medido Volume adicionado pH medido 0,1N 0 3 0 3 0,5mL 3,5 0,5mL 3 0,5mL 3,5 0,5mL 3 0,5mL 3,5 0,5mL 3 1N 0,5mL 9,5 0,5mL 1,5 0,5mL 12 0,5mL 1,5 0,5mL 12,5 1,5 0,5mL 13 - - 0,5mL 13 - - 0,5mL 13 - - 10 Imagem 3. Fitas indicadoras de pH utilizadas nas soluções com NaOH 0,1N (esquerda) e 1N (direita). Imagem 4. Fitas indicadoras de pH utilizadas nas soluções com HCl 0,1N (esquerda) e 1N (direita). Com essas informações foi possível descobrir o ponto isoelétrico (pI) das soluções, utilizando os valores de pKa, que representam as zonas de tamponamento. Os resultados foram expressos nos gráficos abaixo. 11 Gráfico 1. Solução de glicina. Linhas amarelas indicam as zonas tamponantes. Em pH abaixo de 6, a solução estará protonada (grupo ácido e amina completos). Já quando o pH está acima de 6, a solução se encontra desprotonada (perda do H+). Gráfico 2. Solução de ácido glutâmico. Linhas amarelas indicam as zonas tamponantes. Novamente, no pH menor que o ponto isoelétrico 3,25, a solução encontra-se protonada. Com a elevação do pH, a solução se encontra em estado desprotonado. 0 2 4 6 8 10 12 14 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 p H Volume adicionado (mL) Tamponamento da Glicina NaOH HCl pI= 6 0 2 4 6 8 10 12 14 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 p H Volume adicionado Tamponamento do ácido glutâmico NaOH HCl pI= 3,25 pKa= 9 pKa= 3 pKa= 1 pKa= 13 pKa=3,5 pKa=3 pKa=1,5 pKa=13 12 Parte II - Ponto isoelétrico das proteínas e solubilização Introdução Proteínas são macromoléculas formadas por diversos aminoácidos, unidos através de ligações peptídicas. Os aminoácidos apresentam um grupo carboxila e um grupo amina e ambos podem sofrer ionização, portanto, essas moléculas podem ter carga total positiva, negativa ou neutra. Um dos fatores que influencia na carga do aminoácido é o pH do meio em que ele está inserido, que modifica também sua solubilidade. Material e métodos Para a realização do experimento foram usados os seguintes materiais: • Solução caseína 0.5 g% em acetato de sódio 0,1 N • Solução de ovoalbumina a 10% v/v com solução salina • Ácido Acético • Água destilada • Tubos de ensaio • Fita indicadora de pH Primeiramente, foram organizadas duas séries com nove tubos de ensaio e foram adicionadas as soluções conforme a tabela abaixo. Nº de tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Água destilada (mL) 4,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9 3,7 Ácido acético 0,01 N (mL) 0,5 - - - - - - - - Ácido acético 0,1 N (mL) - 0,1 0,2 0,5 1 2 4 - - Ácido acético 1,0 N (mL) - - - - - - - 0,6 0,8 Em seguida, na primeira série de tubos, pipetaram-se 0,5mL de solução de caseína 0.5 g% em acetato de sódio 0,1 N em todos os tubos de ensaio. Já na segunda série, pipetaram-se 0,5 mL da solução de ovoalbumina a 10% v/v com solução salina (NaCl 0,9g % (p/v)). 13 A cada adição, os tubos foram agitados imediatamente e anotou-se o grau de turbidez. O pH de cada solução também foi medido utilizando-se as fitas indicadoras. Após vinte minutos, a turbidez foi medida e registrada novamente, juntamente com o grau de precipitação. Para essas medições, utilizou-se uma escala de 0 a 5, sendo 0 o grau mínimo e 5 o grau máximo. Resultados As medidas registradas em cada série de tubos estão demonstradas na tabela abaixo. Tabela 03. Tubos com caseína. Nº de tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Turbidez inicial 0 0 0,5 3 4 4 2 1 0,5 pH 5,5 5 4,5 3 2,5 4,5 3,5 4 4 Turbidez final 0 0 0,5 4 5 4 4 3 1 Precipitação 0 0 0,5 4 4 5 2 1 0,5 Imagem 5. Tubos 1 a 5 da esquerda para direita. 14 Imagem 6. Tubos 6 a 9 da esquerda para direita. Imagem 7. Fitas de pH das soluções 1 a 9, da esquerda para direita. Tabela 04. Tubos com ovoalbumina. Nº de tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Turbidez inicial 0 0 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 pH 4,5 4,5 4 3,5 4 3 3,2 3 2,5 Turbidez final 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Precipitação 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 Imagem 8. Tubos 1 a 5, da esquerda para direita. Imagem 9. Tubos 6 a 9, da esquerda para direita. 16 Imagem 10. Fitas de pH dos tubos 1 a 9, da esquerda para direita. Discussão No primeiro experimento, analisou-se a curva de titulação dos aminoácidos, que envolve a adição gradual de prótons. No caso da glicina, há dois grupos ionizáveis: o grupo carboxila e o grupo amino, que são titulados com uma base forte, como o NaOH. Por isso, há duas fases na linha NaOH no gráfico de titulação, cada uma representando a desprotonação dos dois grupos diferentes. Além disso, pode-se observar que em pH baixo a espécie iônica predominante de glicina é a forma completamente protonada, ou seja, está com seu grupo ácido e amino completos. No meio desse estágio, com a elevação do pH, estão presentes concentrações equimolares de espécies doadoras e aceptoras de prótons. Nesse momento, o pH torna-se constante, indicando que a solução está tamponando, e é possível descobrir o valor do pKa, que corresponde a uma medida da tendência de um grupo doar um próton. Na atividade realizada com a glicina, o tamponamento aconteceu em pH 3 e 9. Com essas informações, consegue-se calcular o ponto isoelétrico, que indica o pH característico no qual a carga elétrica final é zero. Para a glicina, basta calcular a média aritmética dos valores de pKa. Portanto, o ponto isoelétrico encontrado foi 6. Ainda sobre o ponto isoelétrico, quando o pH estiver baixo, a solução assume uma forma protonada, e com o pH elevado, a solução começa a desprotonar. 17 Imagem 11. Desprotonação dos grupos funcionais do aminoácido Glicina e sua perda gradual de prótons. Utilizando-se o ácido glutâmico no experimento, obteve-se valores de pKa 3,5 e 3, logo, seu ponto isoelétrico resultou em 3,25. Esse aminoácido possui três grupos ionizáveis (um amino, um carboxil e um radical) e, portanto, segundo a literatura, deveria apresentar três tamponamentos. Porém, na atividade realizada, só foram encontradas duas zonas tamponantes, possivelmente por erros de pipetagem das soluções. Ademais, os aminoácidos apresentam uma forma chamada zwitteriônica. Os zwitteríons são compostos químicos eletricamente neutros, mas que possuem cargas opostas em diferentes átomos, ou seja, possui caráter ácido e básico ao mesmo tempo. Também são conhecidos como íon dipolare apresentam essa propriedade em pH específico. Na segunda parte dos experimentos, observou-se a solubilidade de proteínas. Com a solução de caseína, pode-se verificar que houve uma maior turbidez e precipitação, uma vez que essa proteína possui um ponto isoelétrico entre os pH 4 e 5, semelhante ao pH encontrado nas soluções do experimento. Esse fato contribui para a precipitação da proteína pois desencadeia a formação de um zwitterion, uma forma mais apolar que não interage com a água, resultando em uma solução mais turva. Já com a ovoalbumina, a precipitação ocorre mais facilmente em pH neutros próximos de 6. Nas soluções utilizadas, o pH encontrado estava mais ácido, dificultando a desnaturação da proteína. Outro fator que pode influenciar nesse caso é a temperatura, que contribui para a precipitação quando está acima de 57ºC. Sendo assim, as soluções contendo ovoalbumina não apresentaram turbidez e precipitação por não estarem em condições favoráveis para esse acontecimento. 18 Conclusão Com os experimentos e estudos, pode-se concluir que os tampões desempenham uma função muito importante no organismo e sistemas biológicos, equilibrando o pH do meio e possibilitando que todas as funções e atividades se desenvolvam corretamente. Foi possível verificar as zonas específicas de tamponamento das substâncias, bem como seu ponto isoelétrico. Já com o segundo experimento, foi possível notar como as proteínas reagem de formas diferentes dependendo de meio em que estão inseridas. Além disso, pode-se perceber que elas possuem características próprias que influenciam em sua precipitação, podendo estar relacionado com seu ponto isoelétrico, pH e temperatura. Anexo – Questionário 2 1 - Qual a importância da água no surgimento e na evolução da vida na terra? A vida na Terra começou com moléculas nos mares primitivos, que se acumularam durante milhares de anos, até resultar em proteínas, açúcares, gorduras e outras substâncias. Com aglomeração e organização, essas moléculas adquiriram a capacidade de crescer e se multiplicar, originando as células. A partir disso, surgiram os primeiros seres unicelulares, que evoluíram e promoveram as formas de vida que conhecemos. A importância da água está nas suas propriedades peculiares, que tornam possível a organização crescente que leva a formação da vida. Entre essas características peculiares estão o fato de a água ser o solvente universal, capaz de dissociar sais, ácidos e bases e sua coesão interna que faz ponte entre solutos. 2 - Quais as principais propriedades físico-químicas da água e ao que elas se devem? A estrutura molecular da água, com um ângulo de 104,5º, é responsável por diversas propriedades que se interligam, tornando a água tão essencial para a vida. Seu ângulo a torna uma molécula polar, que se liga através de fortes ligações, chamadas pontes de hidrogênio. Ademais, a água é um excelente solvente, tornando possível que os seres vivos absorvam nutrientes dissolvidos na água que bebem. Sua densidade também é benéfica para os seres vivos, pois diminui em temperaturas menores, fazendo com que 19 a superfície dos lagos congele, mas seu fundo não, permitindo que a vida aquática continue. 3 - O que é ponte de hidrogênio e qual sua importância para a vida na terra? Pontes de hidrogênio são forças que ligam moléculas de águas entre si. Elas fornecem uma força coesiva que confere grande parte das propriedades especiais da água, como a polaridade, densidade e solubilidade, já comentadas anteriormente, que permitem o desenvolvimento de diversas formas de vida na Terra. 4 - O que são e quais são as propriedades coligativas da água? Propriedades coligativas são propriedades de um solvente que se modificam na presença de um soluto, dependendo apenas do número de partículas do soluto. As propriedades coligativas da água são: ponto de ebulição, ponto de fusão, pressão de vapor, congelamento e pressão osmótica. 5 - A água ioniza? Como? A água pura possui uma tendência de sofrer uma ionização reversível, que produz um íon de hidrogênio (próton H+) e um íon hidróxido, resultando um equilíbrio. 6 - O que é pH ? e como sua escala é definida? O pH consiste em uma ferramenta de medida de acidez e basicidade de soluções. A classificação se dá através da concentração de íons de hidrogênio, usando a água pura como parâmetro, uma vez que ela possui níveis iguais de H+ e OH- e, portanto, possui pH neutro, com valor de 7. A escala varia de 0 a 14, sendo os níveis mais baixos ácidos e os mais altos bases. 20 7 - Como se define um ácido? E uma base? Utiliza-se uma escada de pH, que varia entre 0 e 14, sendo definida por: quanto maior o valor do pH, mais básica é a solução, e quanto mais baixo o valor do pH, mais ácida é a solução. 8 - Existe só uma maneira de definir ácidos e bases? Explique. Existem diversos conceitos que definem um ácido e uma base. Segundo Arrhenius, os ácidos são substâncias que, em solução aquosa, liberam íons positivos de hidrogênio (H+), enquanto as bases, também em solução aquosa, liberam hidroxilas, íons negativos OH-. Já o conceito de Bronsted-Lowry classifica como ácido a substância capaz de ceder um próton a uma reação, enquanto base é uma substância capaz de receber um próton. Por fim, o conceito de Lewis diz que ácidos são substâncias que, numa ligação química, podem receber pares eletrônicos, enquanto as bases são aquelas que cedem estes pares. 9 - Como o pH pode determinar a solubilidade de um composto? A variação de pH, ou seja, a variação de íons H+ na solução, determina a protonação ou desprotonação dos grupos ionizáveis nas macromoléculas. Sendo assim, esses grupos terão cargas positivas ou negativas, alterando a interação da molécula com a água e consigo mesma. Logo, a estrutura da molécula é modificada, e, consequentemente, sua solubilidade também, uma vez que a alteração da estrutura e a desnaturação podem exibir grupos hidrofóbicos, por exemplo. 10 - O que são substâncias halocrômicas? Substâncias halocrômicas são aquelas que alteram sua coloração de acordo com o pH do meio em que estão inseridas. 21 11 - O que é uma micela? Micelas são agregados de moléculas polarizadas que formam duas regiões: uma hidrofílica (externamente) e uma hidrofóbica (internamente). Geralmente é compostas por fosfolipídios. 12 - O que é interação iônica e qual sua diferença para ligação covalente? Interação iônica é uma ligação que pode ocorrer entre um metal e um ametal, ou um hidrogênio e um metal. A principal característica dessa interação é a capacidade que seus elementos possuem de ganhar ou perder elétrons. Já na ligação covalente há o compartilhamento de pares de elétrons entre átomos, que podem ser o hidrogênio, ametais ou semimetais. Aula prática 3 Tamponamento de Aminoácidos Parte I: tamponamento de aminoácidos (curva de titulação de tamponamento da glicina e do ácido glutâmico) Introdução Os tampões são sistemas aquosos que tendem a resistir à mudanças de pH quando pequenas doses de ácido e base são adicionadas. Um sistema tampão é formado por um ácido fraco (doador de prótons) e sua base conjugada (aceptora de prótons). Os aminoácidos, por terem em sua estrutura um grupo carboxil, um grupo amino e em alguns casos, um radical R ionizável, apresentam caráter anfótero, podendo se comportar como ácido ou base dependendo do meio onde se encontram. Isso favorece o seu comportamento como tampões ácido-base. 22 No experimento, podemos observar e caracterizara capacidade tamponante de dois aminoácidos (glicina e ácido glutâmico), que perdem ou ganham elétrons para o meio, assumindo formas protonadas e desprotonadas, dependendo do pH em que se encontram. Metodologia Os materiais utilizados no experimento foram: ● 4 frascos Erlenmeyer ● Pipeta de vidro ● Micropipeta ● Pipetador ● Solução de Ácido Glutâmico 50 mM ● Solução de Glicina 50 mM ● Solução de NaOH 0,1 M ● Solução de NaOH 1 M ● Solução de HCl 0,1 M ● Solução de HCl 1 M ● Fitas indicadoras de pH Inicialmente, foram pipetados 10 mL da solução de glicina 50 mM em um Erlenmeyer. O pH original da solução foi medido através de fitas indicadoras de pH e registrado em uma tabela, para fins de organização. Após, adicionou-se 0,5 mL da solução de NaOH 0,1 M, agitando-se o frasco e medindo-se o pH obtido. O procedimento de adição do NaOH 0,1 M foi repetido diversas vezes, até que o pH estagnou, repetindo-se por 3 vezes seguidas. Posteriormente, após a repetição do pH, inseriu-se 0,5 mL da solução de NaOH 1 M (10 vezes mais concentrada do que a solução anterior). Após a agitação do preparo, o pH foi medido com o auxílio das fitas indicadoras. Depois, adicionou-se mais 0,5 mL da solução de NaOH, procedimento que foi repetido até que o pH se repetisse 3 vezes. Em um segundo frasco Erlenmeyer, 10 mL de glicina foram depositados com o auxílio de uma pipeta e um pipetador. Os procedimentos descritos anteriormente foram 23 repetidos, mas ao invés de usar soluções de NaOH 0,1 M e 1 M, as soluções utilizadas foram de HCl 0,1 M e HCl 1 M. Por fim, o mesmo processo adotado na mistura das soluções de glicina com NaOH 0,1 M, NaOH 1 M, HCl 0,1 M e HCl 1 M foi executado para o preparo de dois frascos Erlenmeyer com 10 mL de Ácido Glutâmico cada. Resultados 1) Glicina Figura 1. Exemplo de medição do pH com fitas indicadoras Figura 2. Fitas indicadoras de pH referentes à solução de glicina com HCl. 24 NaOH HCl Concentração Volume adicionado pH medido Concentração Volume adicionado pH medido 0,1 N --- 5 0,1 N ---- 5 0,5 mL 8 0,5 mL 3 1 mL 9 1 mL 3 1,5 mL 9 1,5 mL 3 2 mL 9 1 N 2 mL 2 2,5 mL 9 2,5 mL 1 1 N 3 mL 10 3 mL 1 3,5 mL 11 3,5 mL 1 4 mL 12,5 4,5 mL 12,5 5 mL 13 5,5 mL 13 6 mL 13 Tabela 1. Anotações sobre a medição de pH x mL colocados na glicina 25 Figura 3. Titulação da glicina. 2) Ácido Glutâmico Figuras 4 e 5. Algumas fitas indicadoras de pH da solução de ácido glutâmico com HCl e NaOH, respectivamente. 26 NaOH HCl Concentração Volume adicionado pH medido Concentração Volume adicionado pH medido 0,1 N --- 3 0,1 N --- 3 0,5 mL 3,5 0,5 mL 3 1 mL 3,5 1 mL 3 1,5 mL 3,5 1,5 mL 3 1 N 2 mL 9,5 1 N 2 mL 1,5 2,5 mL 12 2,5 mL 1,5 3 mL 12,5 3 mL 1,5 3,5 mL 13 4 mL 13 4,5 mL 13 Tabela 2. Anotações sobre a medição de pH x mL colocados no ácido glutâmico. 27 Figura 6. Gráfico da titulação do ácido glutâmico. Discussão Os aminoácidos são considerados substâncias anfóteras, ou seja, possuem a capacidade de atuar como ácidos ou bases, apresentando natureza dual. Isso se deve ao fato dessas moléculas apresentarem os grupos carboxil e amino (além de outros grupos R ionizáveis). Essa propriedade dos aminoácidos, quando em meio aquoso, causa uma protonação ou desprotonação, com o acréscimo ou retirada de prótons dos mesmos. Podemos representar essa variação na forma dos aminoácidos através de uma titulação ácido-base, que envolve a adição ou a remoção gradual de prótons da solução. Analisando a forma estrutural do primeiro aminoácido utilizado, a glicina, observa-se que esse aminoácido possui somente dois grupos ionizáveis, amino e carboxil, já que os outros dois grupamentos são hidrogênios. Notamos que o gráfico da titulação de glicina apresenta dois pontos distintos, onde ocorre uma estagnação do nível de pH. Ao adicionarmos HCl na solução tornamos o pH ácido, fazendo com que o aminoácido passe a agir como uma base aceptora de prótons, captando os íons H+ do meio e assumindo a sua forma protonada. No gráfico da glicina, podemos observar um ponto médio onde o pH se estabiliza por um tempo (no nosso experimento esse fenômeno foi visto no pH 3, enquanto na literatura isso acontece no pH 2,34). Isso significa que, neste momento, existem concentrações iguais da espécie de glicina com o grupo carboxílico protonado e com o grupo carboxílico desprotonado. É importante ressaltar que o pKa é a 28 medida da tendência de um grupo em fornecer um próton. Existe ainda um segundo estágio de titulação, em pH mais básico, que facilita a perda de elétrons. Nesse caso, a glicina está se tornando desprotonada, perdendo um dos prótons do grupo amino. Isso acontece em um pH de cerca de 9,6 (no experimento, detectamos esse aumento em um pH de 9). Figura 7. A forma protonada, de íon dipolar e desprotonada da glicina, respectivamente. Essas regiões citadas, onde existe uma certa resistência na mudança brusca de pH são conhecidas como zonas de tamponamento. Nessas regiões, o pH do meio é igual ao pKa do grupo protonado que está sendo titulado. O ácido glutâmico, por sua vez, apresenta 3 grupos ionizáveis pois além de conter os grupos amino e carboxil, apresenta um radical ionizável. Podemos observar tal fato no gráfico 2, onde 3 zonas de tamponamento distintas podem ser observadas. Ainda, existe um ponto onde existe a predominância da forma de íon dipolar (ou zwitterion) do aminoácido está presente. Nesse ponto, denominado ponto isoelétrico, a carga líquida do aminoácido é zero porque a carga positiva do grupo amino (que está protonado) é neutralizada pela carga negativa do grupo carboxil (que está desprotonado). O ponto isoelétrico da glicina, que possui apenas dois grupos ionizáveis, é calculado pela média do pKa das duas regiões tamponantes, totalizando 6, número aproximado com o valor encontrado na literatura de 5,97. O ponto isoelétrico do ácido glutâmico é calculado através da média entre o primeiro pKa e o pKa do grupo R ionizável. Isso acontece devido à presença de dois grupos carboxil que, na média de seus valores de pKa, contribuem para uma carga líquida de -1 que equilibra o +1 doado pelo grupo amino. O cálculo do pI resultou em um valor de 3,25, o que corresponde à um valor aproximado do pI encontrado na literatura, de 3,22. Vale ressaltar que a terceira região de 29 tamponamento só ocorreu em pH 13 (sendo que na literatura ocorre no pH 9), o que pode ter sido causado por erro no momento da pipetagem. Figura 8. As formas protonadas, desprotonadas e de íon dipolar do ácido glutâmico. Essas propriedades de ionização também estão presentes em resíduos de aminoácidos, embora suas constantes de ionização sejam diferentes porque não existe mais um grupo de carga oposta ligado ao carbono alfa. Os grupos alfa-amino e alfa- carboxil estão unidos covalentemente nas ligações peptídicas, não contribuindo com o comportamento ácido-base. O que realmente influencia nesse comportamento, no caso dos peptídeos, são os grupos R de alguns aminoácidos que podem ionizar e os grupos alfa-amino e alfa-carboxil livres. Parte 2: ponto isoelétrico das proteínas e solubilização Introdução O ponto isoelétricodas proteínas é a forma neutra dessa molécula, onde as cargas positivas e negativas estão equilibradas. Esse ponto isoelétrico, que se apresenta em uma faixa restrita de pH, modifica a solubilidade das proteínas, o que foi atestado com os experimentos envolvendo a caseína e a ovoalbumina. Sendo assim, o objetivo central do experimento foi observar o padrão de solubilidade das proteínas caseína e ovoalbumina conforme o pH do meio foi modificado, 30 comprovando que diferentes pHs resultam em diferentes graus de turbidez e precipitação dos compostos. Metodologia ● Tubos de ensaio ● Pipeta de vidro graduada, pipetador e micropipeta ● Solução caseína 0,5 g% em acetato de sódio 0,1 M ● Solução de ovoalbumina a 10% v/v com solução salina ● Ácido acético ● Água destilada ● Fitas indicadoras de pH Duas séries de nove tubos de ensaio foram preparadas com diferentes quantidades de água destilada e ácido acético em diferentes concentrações em cada tubo, como visto na tabela a seguir: Nº dos tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Água destilada (mL) 4,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9 3,7 Ácido Acético 0,01 M (mL) 0,5 - - - - - - - - Ácido Acético 0,1 M (mL) - 0,1 0,2 0,5 1,0 2 4 - - Ácido Acético 1,0 M (mL) - - - - - - - 0,6 0,8 31 Após, em uma das séries de tubo foi pipetado 0,5 mL de solução de caseína 0,5 g% em acetato de sódio 0,1 M. Na segunda série, foi pipetado 0,5 mL da solução de ovoalbumina a 10% v/v com solução salina (NaCl 0,9 g% (p/v)). As duas séries foram identificadas para fins de organização e os tubos foram agitados imediatamente após a pipetagem. Posteriormente, uma escala fictícia foi criada para indicar o nível de turbidez e precipitação da mistura contida nos tubos, sendo 0 uma solução sem turbidez/precipitação e 5 uma solução com alto grau de turbidez/precipitação. Os valores de turbidez logo após a agitação dos tubos foram anotados. A seguir, mediu-se o pH de cada tubo com o auxílio de fitas indicadoras de pH. Por fim, após 20 minutos, mediu-se novamente os valores de turbidez e de precipitação da solução. Resultados 1) Tubos de caseína Nº dos tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Turbidez (T = zero), ou seja, na hora. 0 0 0,5 3 4 4 2 1 0,5 pH 5,5 5 4,5 3 2,5 4,5 3,5 4 4 Turbidez (T=20), ou seja, após 20 minutos. 0 0 0,5 4 5 4 4 3 1 Precipitação 0 0 0,5 4 4 5 2 1 0,5 32 2) Tubos de ovoalbumina Nº dos tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Turbidez (T = zero), ou seja, na hora. 0 0 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 pH 4,5 4,5 4 3,5 4 3 3,2 3 2,5 Turbidez (T=20), ou seja, após 20 minutos. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Precipitação 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Figuras 9 e 10. Fitas indicadoras de pH dos tubos de ovoalbumina e caseína, respectivamente. 33 Figura 11 e 12. Os 9 tubos de ovoalbumina. Figuras 13 e 14. Os nove tubos com caseína. 34 Discussão A solubilidade das proteínas depende diretamente de diversos fatores, entre eles o pH do meio onde elas se encontram. Isso acontece, pois, a forma das proteínas é alterada devido à interação com os íons do ambiente, gerando uma modificação na estrutura dessa macromolécula, a chamada desnaturação. Consequentemente, isso acarreta na perda da função da proteína. Sabe-se que as proteínas podem apresentar carga positiva (forma catiônica), negativa (forma aniônica) ou neutra (íon dipolar), dependendo do pH ao qual são submetidas. A forma neutra onde as proteínas se encontram com cargas negativas e positivas equilibradas é chamada de ponto isoelétrico. Abaixo do seu ponto isoelétrico, a proteína se encontra com carga residual positiva, enquanto acima desse mesmo ponto, a carga residual da molécula é negativa. Essa ausência de cargas dificulta a interação com o solvente polar (como a água), além de fazer com que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína seja mínima, ocasionando a separação do sistema e a formação de aglomerados que consequentemente precipitam, fato que foi visualizado em vários tubos com caseína, que ficaram turvos e com uma nítida precipitação quando submetidos à alguns pontos específicos de pH. Nota-se que o maior grau de precipitação da caseína foi visto no tubo 6, submetido à um pH de 4,5 o que nos leva a concluir que esse pH é o mais aproximado do ponto isoelétrico dessa proteína, onde a solubilidade com o solvente se torna mais complicada. Tal fato se confirma com a literatura, cujos experimentos apontam que o ponto isoelétrico da caseína é alcançado em um pH de cerca de 4,7. A ovoalbumina, por sua vez, apresentou pouco ou nenhum grau de turbidez e precipitação nos pHs testados, que variaram de 3 até 4,5, o que mostra que a sua solubilidade nesse pH é alta pois as forças de repulsão entre as moléculas de proteína são altas, favorecendo uma maior interação com o solvente devido às cargas presentes na molécula. Consequentemente, conclui-se que seu ponto isoelétrico não se encontra nessa faixa de pH: sem precipitação, torna-se difícil determinar o ponto isoelétrico da macromolécula. 35 Conclusão Através do primeiro experimento, podemos concluir que os aminoácidos podem agir como tampões ácido-base devido aos grupos carboxil, amino e outros radicais R ionizáveis presentes na molécula. Em um pH abaixo do seu pI (ponto em que os aminoácidos apresentam carga líquida nula), os aminoácidos são encontrados em sua forma protonada, enquanto acima do seu pI predominam na forma desprotonada. Existem, ainda, certos momentos onde o pH se repete apesar da adição de ácido/base, o que chamamos de região tamponante. A segunda parte do experimento nos mostra que o pH afeta a solubilidade das proteínas devido à uma interação entre os íons do meio e a estrutura proteica carregada positivamente ou negativamente. Essa interação entre solvente e proteína, porém, é diminuída quando o pH do meio se aproxima do seu ponto isoelétrico, afinal as proteínas se tornam eletricamente neutras. Isso desfavorece a interação das proteínas com a água e aumenta a interação entre as próprias macromoléculas, causando uma aglomeração e consequente precipitação. Em suma, podemos observar que quanto mais próximo for o pH de uma solução protéica do seu ponto isoelétrico (pI), mais baixa será a solubilidade da mesma. Anexo – Questionário 3 1 - O que é ponte de hidrogênio? Como ela afeta o comportamento físico-químico da água? Cada átomo de hidrogênio de uma molécula de água compartilha um par de elétrons com o átomo central do oxigênio. A geometria da água não é linear, formando um ângulo de 104,5º. Considerando tais fatos, o átomo de oxigênio (que é mais eletronegativo) atrai elétrons mais fortemente do que os átomos de hidrogênio, fazendo com que os elétrons compartilhados fiquem mais frequentemente nas vizinhanças do átomo de oxigênio do que do átomo de hidrogênio. Esse compartilhamento desigual gera dipolos elétricos, com o oxigênio carregando carga parcial negativa e os hidrogênios carregando carga parcial positiva. 36 Como resultado, existe uma atração entre o átomo de oxigênio de uma molécula e o hidrogênio de outra, formando as pontes de hidrogênio. Essa ligação, por ser mais forte do que outras interações eletrostáticas como as de van der waals, faz com que a água possua comportamentos peculiares diferentes de outros solventes, como a sua densidade incomum: a água em seu estado sólido é menos densa do que a água em seu estado líquido, o que faz com que o gelo não afunde na água. Isso acontece poisas moléculas de água, no estado sólido, fazem ligações de hidrogênio entre si no formato de estruturas hexagonais, deixando alguns espaços entre as moléculas que diminuem a densidade do gelo, fazendo com que o mesmo flutue sobre a água líquida. As ligações de hidrogênio também proporcionam um ponto de ebulição e fusão maior para a água, pois essas interações eletrostáticas fazem com que a água adquira uma coesão interna, o que torna mais difìcil quebrar essas ligações. A tensão superficial da água, que faz alguns insetos caminharem sobre ela, só existe por causa das ligações de hidrogênio. Além disso, a água tem a capacidade de formar ligações de hidrogênio com alguns solutos polares, como é o caso dos açúcares, que dissolvem facilmente em água devido ao efeito estabilizador das ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila ou o oxigênio da carbonila do açúcar com as moléculas polares da água. 2 - O que é capa de solvatação? A água é um solvente extremamente eficiente de sais e íons pois forma interações com os mesmos através das suas cargas parciais. Por exemplo, ao encontrar um sal sólido, a água irá se aproximar pelo polo de sinal contrário ao dele, atraindo-o e fazendo com que ele se desprenda do composto. No caso do NaCl, os íons Na+ são atraídos pela carga parcial negativa do oxigênio da molécula de água, enquanto os íons Cl- são atraídos pelos hidrogênios da molécula de água. Após dissociar os íons, as moléculas de água formam uma capa de solvatação ao redor da molécula, onde a partícula iônica fica cercada de tal maneira pela água que impede que esse composto se una novamente. Os íons, então adquirem uma liberdade muito maior de movimento, aumentando entropia do sistema. Em suma, a capa de solvatação é uma camada de moléculas de água estruturadas ao redor do soluto - ou mesmo de uma molécula apolar. Essa estruturação é provocada porque mesmo os solutos mais polares rompem as ligações de hidrogênio entre moléculas de água (o que nunca é energeticamente interessante) e a água precisa se organizar da 37 melhor forma possível para estabelecer tantas ligações de hidrogênio quantas forem possíveis. 3 - Como é controlado o pH do nosso sangue? Como a respiração afeta este tampão? O que acontece quando você prende a respiração? O pH do nosso sangue é controlado por sistemas tampões que resistem à adições de H+ ou OH-, fazendo com que o pH não mude bruscamente, possibilitando um melhor funcionamento do organismo. O principal sistema tampão do nosso corpo, é o tampão bicarbonato que consiste em um ácido fraco, o ácido carbônico, como o doador de prótons e a sua base conjugada, o bicarbonato. Esse sistema é mais complexo pois o ácido carbônico também pode ser formado pela dissolução de CO2 (proveniente da respiração) na água. Quando existe um excesso de íons H+ no meio, por exemplo, o bicarbonato age como base captando os prótons do meio e formando ácido carbônico. Este, por sua vez, se dissocia formando CO2 e água. Como o CO2 do plasma sanguíneo está em equilíbrio com o CO2 dos pulmões, o excedente é exalado. O contrário também pode ocorrer: quando existe uma falta de íons H+ no meio, o ácido carbônico começa a se dissociar em íons H+ e bicarbonato, diminuindo o pH do meio. Como esse sistema está sempre em equilíbrio, para que haja a formação de ácido carbônico (que se dissocia em bicarbonato e íons H+), mais CO2 é inalado e associado com a água para formação desse ácido. Uma respiração mais lenta e profunda aumenta a pressão de CO2 nos alvéolos, impedindo que esse gás seja liberado por difusão. O ar nos alvéolos é uma mistura de ar "novo" (rico em oxigênio e pobre em CO2) com uma porção de ar "velho", o que mantém as pressões de oxigênio e CO2 dentro deles constante. Quando respiramos devagar, reduzimos a taxa de entrada de ar “novo”, o que faz com que a pressão de CO2 aumente nos alvéolos e a razão pressão de CO2 na corrente sanguínea/pressão de CO2 no alvéolo diminua, o que reduz a taxa de passagem de CO2 da corrente sanguínea para os alvéolos por difusão. 4 - Por que o etanol é mais solúvel em água do que em etano? Isso se deve ao fato do etanol possuir um grupo hidroxila. Com o oxigênio (um átomo mais eletronegativo) ligado ao hidrogênio, existe a possibilidade de formação de 38 ligações de hidrogênio com a molécula de água, o que faz com que a solubilidade do etanol na água seja alta. Isso não ocorre com o etano, que é uma molécula polar, fazendo com que as ligações entre etanol-etano sejam mais fracas do que as ligações etanol-água. 5 - O que é pH? Como foi definida a escala? O pH é uma escala que mede o grau de acidez ou alcalinidade de um sistema, representando a quantidade de íons H+ encontrados em uma solução. Nessa escala, os valores abaixo de 7 representam um pH ácido, números acima de 7 representam um pH básico e um valor igual à 7 representa um pH neutro. Essa escala é logarítmica e baseada no produto iônico da água. O seu termo denota uma equação matemática onde “p” representa “logarismo negativo de”. O pH é representado pela expressão pH = - log [H+]. O valor 7, por sua vez, não é aleatório: é derivado do valor absoluto do produto iônico da água a 25°C. 6 - Como o pH pode influenciar a solubilidade de um composto? O pH de um meio determina se os grupos ionizáveis de substâncias, como os aminoácidos, estarão protonados, desprotonados ou no seu ponto isoelétrico (onde a carga líquida da molécula é igual à zero). Por exemplo, a glicina tem um pI de aproximadamente 6: nesse pH, a solubilidade do aminoácido é reduzida pois as interações entre os aminoácidos aumentam ao passo em que as interações entre a glicina e a água diminuem (já que a carga da molécula está nula, o que desfavorece interações com um solvente polar). Ainda existem as enzimas que possuem condições restritas para o seu funcionamento, atuando em uma faixa estreita de pH. Uma mudança na concentração de íons H+ no meio altera a interação dessa enzima com a água e consigo mesma, modificando sua estrutura tridimensional e causando a sua desnaturação (além da formação de precipitados), o que modifica a sua solubilidade. 39 7 - Como o pH pode influenciar a absorção de um composto? Explique porque a aspirina é absorvida melhor no estômago e não no intestino? A absorção de um composto depende da passagem do mesmo pela membrana plasmática das células. Devido à composição de bicamada lipídica da membrana, moléculas hidrofóbicas e neutras conseguem passar por ela com mais facilidade, por serem apolares, enquanto moléculas altamente polares e carregadas passam lentamente pela membrana. Considerando tal fato, para uma melhor absorção, o ideal é que o composto que será absorvido não possua carga. Sendo assim, quando o pH do meio está acima do pKa de um composto ácido, a sua forma iônica vai ser predominante. A aspirina é um ácido fraco com pKa de 3,5 (onde está 50% na sua forma iônica e 50% na sua forma não iônica). Sabe-se que o pH estomacal é de 1,5 enquanto o do intestino delgado é de 6. Sabendo que o pH do estômago é menor do que o pKa da aspirina, o medicamento vai estar em sua forma não-iônica, o que facilita a sua absorção no estômago. No intestino, por exemplo, onde o pH é mais elevado do que o pKa da aspirina, a forma iônica é predominante, fazendo com que a passagem das moléculas pela membrana plasmática seja dificultada. 8 - Qual o papel do pH na compartimentalização dos processos bioquímicos na célula? Sabe-se que cada enzima atua em um pH restrito, sendo que pequenas mudanças já são o suficiente para alterar a estrutura tridimensional das mesmas,causando a desnaturação dessas enzimas. Mantendo-se um pH em cada compartimento (por exemplo: pH 1,5 no estômago e pH 6 no intestino), é possível que vários grupos de enzimas permaneçam ativos ao mesmo tempo, realizando vias metabólicas diferentes. 9 - Defina ácidos e bases fortes. Ácidos fortes são aqueles que ionizam totalmente em água, liberando íons H+ com facilidade (como o HCl). Já bases fortes são aquelas que se dissociam completamente em solução aquosa liberando íons hidroxilas em solução, não sobrando nada (ou praticamente nada) na sua espécie molecular. 40 É importante lembrar da definição de Bronsted-Lowry, onde uma base tem a tendência de receber prótons e um ácido tem a tendência de doar prótons. Sendo assim, uma base forte é aquela que possui a capacidade de protonar, “roubando” prótons do meio, enquanto um ácido forte é aquele que possui a capacidade de desprotonar, “dando” prótons ao meio. 10) Defina ácidos e bases fracos. Ácidos fracos são aqueles que se ionizam parcialmente na água. Um exemplo é o ácido acético que, quando dissolvido em água, permanece em sua maior parte na forma molecular enquanto apenas uma pequena parte do ácido ioniza gerando íons H+. Bases fracas, por sua vez, são aquelas que se dissociam parcialmente em água: existe uma liberação de íons OH- mas ainda restam muitas moléculas não dissociadas na sua forma molecular. É importante ressaltar que ácidos fracos são importantes para o tamponamento de sistemas biológicos, como o tampão bicarbonato. Módulo 2 – Quantificação Aula prática 1 Quantificação de substâncias a partir de princípios básicos da espectrofotometria Parte I - Comprimento de onda de absorção Introdução A espectrofotometria consiste em uma técnica que utiliza a luz para analisar como a mesma interage com átomos e moléculas. A luz, sendo uma onda eletromagnética, pode interagir com a matéria de diversas formas, sendo possível medir a absorbância, ou seja, quantidade de luz absorvida em vários comprimentos de onda. 41 Material e métodos No experimento, foram utilizados os seguintes materiais: • Solução de azul de bromofenol pH < 3,0 • Solução de azul de bromofenol pH > 4,6 • Placa de 96 poços Primeiramente, foram pipetados 200µL de água destilada em 3 poços adjacentes da placa. Em seguida, o processo repetiu-se utilizando as soluções de azul de bromofenol pH > 4,6 (solução mais azulada) e azul de bromofenol pH < 3,0 (solução mais amarelada). Imagem 01. Poços com soluções de água e azul de bromofenol com diferentes pH. Em seguida, foi feita a leitura das soluções da placa no espectrofotômetro, um aparelho capaz de medir e comparar a quantidade de luz absorvida por uma determinada solução. Ele funciona passando um feixe de luz através da amostra e fazendo a medição da intensidade da luz que atinge um detector de radiação. Nessa medição, o aparelho foi configurado para fazer a leitura na opção de espectro na faixa de 400 a 750nm. Resultado Com a medição no espectrofotômetro, foram gerados gráficos para demonstrar os resultados do comprimento de absorção máximo de cada solução. 42 Gráfico 01. Comprimento de absorção máximo da água destilada. Gráfico 02. Comprimento de absorção máximo da solução de azul de bromofenol pH < 3,0. Gráfico 03. Comprimento de absorção máximo da solução azul de bromofenol pH > 4,6. Os resultados obtidos foram os seguintes: Solução Comprimento de absorção máximo Azul de bromofenol pH < 3,0 435nm Azul de bromofenol pH > 4,6 590nm Tabela 01. Resultados dos comprimentos de onda das soluções. 43 Parte II - Obtenção da curva de diluição Introdução A diluição é um processo que diminui a concentração de uma substância em uma solução. Para isso, pode-se combinar a amostra líquida de interesse com uma determinada quantidade de solvente, até obter a concentração desejada. Ademais, outro método utilizado é o da diluição seriada, que amplifica o fator da diluição, uma vez que a fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da diluição anterior. Sendo assim, o objetivo desse tipo de diluição é diminuir progressivamente a quantidade de soluto na solução. Material e métodos Para a realização dessa atividade, foram utilizados: • Microtubos de plástico • Solução de azul de bromofenol pH < 3,0 • Solução de azul de bromofenol pH > 4,6 • Placa de 96 poços Inicialmente, foram enumeradas duas séries com sete microtubos, uma para cada pH de azul de bromofenol e adicionaram-se 700µL de água destilada em cada microtubo. O tubo 1 foi mantido apenas com água para servir como branco. Enquanto isso, no tubo 2, foram acrescentados 700µL de azul de bromofenol, agitando-se bem. Após, retirou-se 700µL do tubo 2 e colocou-se no tubo 3, novamente agitando bem. Esse processo de diluição seriada repetiu-se sequencialmente até o tubo 7. Por fim, transferiu-se 200µL de cada tubo para os poços da placa, fazendo uma triplicata. A placa com os 96 poços foi analisada no espectrofotômetro, fazendo a leitura de cada solução nos comprimentos de onda na faixa de 400 a 750nm. Imagem 02. Placa contendo as soluções finais. 44 Resultado Após a leitura da placa feita no espectrofotômetro, foram obtidos os valores de absorbância, com os quais foi calculada a média entre as triplicatas, gerando os seguintes resultados: Tabela 02. Média das triplicadas das soluções. A absorbância é medida de 0 a 1. Quando ela é igual a zero, significa que a luz passa totalmente pela solução, ou seja, a solução é completamente translúcida. Já quando ela é igual a 1, indica que nada de luz passa pela solução, sendo ela uma solução completamente opaca. Logo, elaborou-se um gráfico contendo as informações obtidas durante o experimento, sendo o eixo y a média das absorbâncias e o eixo x os valores de diluição. Pode-se notar que quanto mais diluída a solução está, menos ela absorve. Gráfico 04. Curvas de diluições das soluções com diferentes pH. Média pH 3 pH 4,6 1 (Água) 0,045 0,039 2 0,058 0,232 3 0,022 0,115 4 0,013 0,06 5 0,0073 0,03 6 0,0050 0,015 7 0,00105 0,008 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 100% 50% 25% 12.5% 6.25% 3.13% Curva de diluição pH 3 pH 4,6 45 Discussão Todos os compostos químicos são capazes de absorver, transmitir ou refletir luz ao longo de um determinado intervalo de comprimento de onda. A espectrofotometria é um método que estuda essas interações, permitindo analisar a absorção de luz nessas soluções, por exemplo. A luz é uma onda eletromagnética, composta por um componente elétrico e outro magnético. Todo movimento oscilatório possui um comprimento de onda, ou seja, a distância entre dois máximos de onda. Dependendo de sua energia, as ondas eletromagnéticas possuem características diferentes, que modificam também sua interação com a matéria. A matéria é composta por átomos e, consequentemente, por prótons, nêutrons e elétrons. No estado fundamental, átomos e moléculas tendem a minimizar sua energia, distribuindo seus elétrons em orbitais. Todavia, orbitais mais energéticos podem ser ocupados por elétrons, desde que seja disponibilizada uma certa quantidade de energia. A excitação dos elétrons pode ser estimulada quando um fóton de luz atingir um átomo ou molécula. Posteriormente, este elétron no estado excitado tenderá a voltar para o estado fundamental, gerando energiatérmica e, por fim, emitindo luz. Além disso, a luz emitida pode ser fluorescente ou fosforescente, dependendo de seu tempo de duração. A quantidade de luz absorvida em diversos comprimentos de onda pode ser determinada através de um espectro de absorbância. A espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, definida por A= εcl, onde “A” é a absorbância, “ε” é o coeficiente de extinção molar e “l” é o comprimento da cubeta. Em outras palavras, a lei estabelece que “a absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução de amostra”. Além disso, um fato importante a ser observado nas transições energéticas entre orbitais é a quantização. As transições só acontecem quando a energia fornecida pela radiação é igual a energia de transição entre os dois orbitais, portanto, tanto energias inferiores como superiores são incapazes de produzir a transição eletrônica. Ademais, há também o método conhecido como fotometria, utilizado para determinar a concentração de substâncias cromóforas, isto é, substâncias que possuem muitos elétrons capazes de absorver energia. Para isso, são utilizadas comparações entre 46 cores padrões e das soluções em análise. Contudo, esse método não oferece muita precisão devido às propriedades da visão e também do componente subjetivo. Sendo assim, é preferível a utilização de equipamentos capazes de quantificar a luz, os quais permitem a medição da quantidade de fótons. Para conseguir medir a absorbância das soluções, é necessária a interação das mesmas com um comprimento de onda específico e favorável. Por isso, no experimento I, descobriu-se em quais comprimentos de onda cada pH da solução de azul de bromofenol tinha uma maior absorbância. Com esses valores, foi possível calcular quanto cada solução absorveu. Caso contrário, utilizando comprimentos de ondas quaisquer, os valores de absorbância não seriam precisos e não estariam de acordo com a concentração das soluções. Conclusão Os experimentos possibilitaram um entendimento sobre a interação da luz com a matéria, bem como seus princípios e condições. Com o uso do espectrofotômetro, foram feitas leituras dos picos de absorção das soluções com diferentes pH, descobrindo assim o melhor comprimento de onda para analisar a absorbância. Por fim, foi gerado um gráfico de diluição, demonstrando as curvas de diluição em função da absorbância. Esses métodos são muito importantes para uso em laboratórios, uma vez que permitem a verificação de diversas informações relevantes para estudos. Anexo – Questionário 1 1 - Quais os princípios básicos de espectrofotometria? Um dos princípios básicos da espectrofotometria é o fato de cada molécula absorver um comprimento de onda diferente. Isso ocorre pois as substâncias possuem estruturas moleculares específicas, o que faz com que os elétrons de cada molécula consigam absorver diferentes e bem definidas quantidades de energia da radiação eletromagnética incidente. Verifica-se esse fato devido ao fenômeno da excitação eletrônica (passagem de elétrons de estados basais para estados de maior energia após a 47 incidência da radiação visível, por exemplo), de modo que cada elétron só absorve energia quando esta tem o valor certo para promover a sua passagem entre o seu nível basal à um dos estados de maior energia que ele pode ocupar. Sendo assim, cada molécula possui um espectro de absorção de luz singular, o que pode permitir a sua identificação. Outro princípio básico é a obtenção da concentração do analito nas soluções através da medida de suas respectivas absorções de luz em um dado comprimento de onda. Através da lei de Lambert-Beer, podemos concluir que a absorbância é diretamente proporcional à concentração da substância absorvente. Podemos ainda definir como conceito básico da espectrofotometria a transmitância (razão entre a intensidade de luz emergente que não é absorvida pela molécula e a intensidade da luz incidente) e a absorbância (quantidade de radiação absorvida pela molécula). 2 - O que é a lei de Lambert-Beer? É uma lei que procura relacionar a quantidade de luz absorvida com a concentração de um cromóforo e a espessura do meio absorvente. Lambert observou que existia uma relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente notando que quando um feixe de luz monocromática atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. Assim, foi anunciada a lei " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente”. Beer, por sua vez, notou que existe uma relação entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz, onde a interação adequada da luz com o cromóforo diminui a intensidade do feixe de luz. Sendo assim, pode-se concluir que solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela se encontra, isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente "Juntando essas duas leis através de expressões matemáticas, podemos chegar à equação A = ε.b.c que determina uma estrita relação entre o A que corresponde à absorbância, ε que é a absortividade molar característica de cada substância, b que é o caminho óptico e c que determina a concentração do cromóforo. Todavia, essa lei tem 48 algumas limitações como o fato de só servir para soluções bastante diluídas e da luz incidente ter que ser monocromática. 3 - Qual a diferença entre quantidade e concentração? A concentração se refere à razão entre a quantidade de soluto e de solvente em uma solução (por exemplo mol/L, g/L). Já quantidade se refere à uma quantificação, uma grandeza expressa em número que determina a propriedade de alguma coisa que pode ser medida (massa, volume, mols etc) 4 - Qual a diferença entre fotometria e espectrofotometria? A fotometria é um método que utiliza os olhos humanos como equipamentos para detectar luz com o intuito de determinar a concentração de substâncias cromóforas em uma solução. De acordo com o senso comum, quanto mais cromóforo (substância que absorve luz) uma solução tiver, mais escura ela será. Esse recurso utilizava exatamente esse princípio, usando cores e concentrações padrões com as quais a solução em análise era comparada. A fotometria é imprecisa e subjetiva pois não permite uma quantificação exata do soluto devido às propriedades limitadas da visão (só é possível na faixa do visível). Já a espectrofotometria permite quantificar a absorbância ou transmitância de uma molécula com valores mais precisos. Essa técnica lida com alguns equipamentos muito mais precisos do que o olho humano (medindo até comprimentos de onda da faixa do ultravioleta), como o espectrofotômetro, que se baseia na medida quantitativa da absorção de luz pelas soluções com uma quantidade desconhecida de soluto. 5 - Como podemos correlacionar o tamanho dos picos de absorção encontrado no experimento I com a diferença das curvas de diluição do experimento II? No primeiro experimento foi encontrado o pico de absorção do azul de bromofenol nos diferentes pHs. Esse valor foi utilizado como base do experimento 2 para relacionar a absorção com a concentração da molécula, pois se a medida da absorbância 49 fosse executada em um comprimento de onda em que o azul de bromofenol não absorvesse com eficácia, não existiria precisão da concentração da molécula na solução,tornando o experimento improdutivo. 6 - As condições do ambiente podem alterar a absorção de luz? Como? Sim. Condições como o pH de uma solução podem alterar a estrutura da molécula devido à protonação e desprotonação dos analitos ionizáveis, o que ocorre com o aumento ou diminuição de íons H+ no meio. Sabendo-se que a estrutura da molécula é determinante para a absorção de um comprimento de onda característico da substância, uma alteração na estrutura pode provocar uma modificação no comprimento de onda absorvido, refletindo até mesmo na mudança de cor da solução. A temperatura também pode causar modificações na absorção de luz de uma substância, como é o caso do DNA, que possui duas cadeias de desoxirribonucleotídeos. A absorbância dos ácidos nucleicos em cadeia dupla aumenta quando se desfazem as ligações por ponte de hidrogênio entre cadeias, aumentando a área de absorção, o que pode ser efetuado por um aquecimento do DNA. Aula prática 2 Curva padrão para quantificação de substâncias Introdução A quantidade de uma dada substância em uma amostra desconhecida pode ser determinada através de um método colorimétrico. Para esse processo, utiliza-se a comparação da cor produzida pela amostra com a produzida por uma solução de concentração conhecida - denominada padrão. A medição das absorbâncias de uma série de quantidades padrão gera um gráfico linear, chamado de curva padrão. No presente trabalho, determinamos a quantidade de uma proteína utilizando o método de Biureto e quantificamos a concentração de fosfato inorgânico em três amostras de água, visando determinar qual apresenta maior concentração de fertilizantes utilizados na agricultura. 50 Parte I - Determinação da quantidade de proteína pelo método biureto Material e métodos: Material: ● Tubo contendo amostra proteica 20X diluída ● Padrão de proteína (concentração = 5mg/mL) ● Reagente Biureto ● Placa de 96 poços Inicialmente, pipetamos a curva padrão em triplicata diretamente na placa de 96 poços seguindo os volumes indicados na tabela abaixo. Tabela 1. Valores pipetados em cada poço. Imagem 1. Demonstração de como foi pipetado em cada poço da placa de 96 poços. Após isso, adicionamos 100 µL da amostra proteica diluída em cada um dos poços e, seguidamente, acrescentamos em cada poço 200 µL de Biureto. Posteriormente, incubamos a placa a 32°C por 10 minutos e mensuramos a absorbância das amostras, em 520 nm, no espectrofotômetro. Após as análises, obtivemos os seguintes resultados: 51 Tabela 2. Valores de absorbância obtidos no espectrofotômetro (subtraídos os valores do branco). Amostras Absorbância B 0,062 1 0,027 2 0,106 3 0,173 4 0,321 A 0,115 Amostra 1. 5 mg --------- 1 mL x mg --------- 0,025 mL x = 0,125 mg Amostra 2. 5 mg --------- 1 mL x mg --------- 0,050 mL x = 0,25 mg Amostra 3. 5 mg --------- 1 mL x mg --------- 0,075 mL x = 0,375 mg Amostra 4. 5 mg --------- 1 mL x mg --------- 0,100 mL x = 0,5 mg Tabela 3. Cálculo da quantidade em cada uma das amostras padrão. 52 Gráfico 1. Curva padrão das absorbâncias e quantidades obtidas no experimento 1. A partir da quantidade e absorbância obtida em cada poço, foi possível calcular o Fator de Calibração das amostras: FC - Amostra 1. 0,125 ÷ 0,027 = 4,63 FC - Amostra 2. 0,25 ÷ 0,106 = 2,36 FC - Amostra 3. 0,375 ÷ 0,173 = 2,16 FC - Amostra 4. 0,5 ÷ 0,321 = 1,56 FC Médio 2,67 y = 0.7592x - 0.0805 R² = 0.9652 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A b so rb ân ci a Quantidade (mg) Curva Padrão Tabela 4. Fator de Calibração (FC) de cada amostra e média dos Fatores de Calibração (FCM). 53 Quantidade = absorbância X FCM Concentração: x = 0,115 x 2,68 0,3082 x 20 (diluição) 6,164 mg -------- 0,1 mL x = 0,3082 = 6,164 mg x mg -------- 1 mL x = 61,64 mg/mL Equação da reta: y = 0,7592 x – 0,0805 0,115 = 0,7592 x – 0,0805 0,115 + 0,0805 = 0,7592 x 0,1955 = 0,7592 x 0,257 x 20 (diluição) x = 0,257 = 5, 14 mg Concentração: 5,14 mg ------------- 0,1 mL x mg ------------- 1 mL x = 51, mg/mL Parte 2 - Quantificação de fosfato inorgânico Material e métodos: Material: ● Padrão de Pi (1µmol/mL) ● 3 tubos eppendorfs contendo as amostras A, B e C ● Ácido tricloroacético (TCA) 5% ● Molibdato de amônia 0,25% emácido sulfúrico 0,5 N ● Reagente Redutor ● EDTA 1 M Tabela 5. Quantidade e concentração da amostra A obtidas através do FCM e pela equação da reta. 54 ● 9 tubos de ensaio ● Placa 96 poços Inicialmente, nomeamos os tubos de ensaio e pipetamos os reagentes conforme especificado na tabela 6. Após esses processos, agitamos os tubos para misturar bem e adicionamos 200 µL do Agente Redutor em todos os tubos - agitando bem novamente. Posteriormente, incubamos os tubos por 7 minutos a temperatura ambiente. Consecutivamente, adicionamos 100 µL de EDTA 1M e agitamos. Feito isso, transferimos 200 µL de cada tubo para os poços da placa em triplicata para determinarmos a absorbância das amostras a 650 nm. Tabela 6. Valores pipetados em cada amostra. Imagem 2. Demonstração de como foi pipetado em cada poço da placa de 96 poços. 55 Tabela 7. Quantidade das amostras padrão nos tubos 1 e 2 e nos seus respectivos poços. Tabela 8. Quantidade das amostras padrão nos tubos 3 e 4 e nos seus respectivos poços. Tubo 1. Absorbância (média) = 0,061 V final = 3550 µL Padrão Pi adicionado = 0,15 mL 1 mL ----------- 1µmol 0,15 mL ----------- x µmol x = 0,15 µmol No poço: 3550 µL ---------- 0,15 µmol 200 µL ----------- x µmol x = 0,0085 µmol Tubo 2. Absorbância (média) = 0,182 V final = 3550 µL Padrão Pi adicionado = 0,3 mL 1 mL ----------- 1µmol 0,3 mL ----------- x µmol x = 0,3 µmol No poço: 3550 µL ---------- 0,3 µmol 200 µL ----------- x µmol x = 0,0169 µmol Tubo 3. Absorbância (média) = 0,243 V final = 3550 µL Padrão Pi adicionado = 0,45 mL 1 mL ----------- 1µmol 0,45 mL ----------- x µmol x = 0,45 µmol No poço: 3550 µL ---------- 0,45 µmol 200 µL ----------- x µmol x = 0,0253 µmol Tubo 4. Absorbância (média) = 0,304 V final = 3550 µL PadrãoPi adicionado = 0,6 mL 1 mL ----------- 1µmol 0,6 mL ----------- x µmol x = 0,6 µmol No poço: 3550 µL ---------- 0,6 µmol 200 µL ----------- x µmol x = 0,0338 µmol 56 Tabela 9. Quantidade da amostra padrão no tubo 5 e nos seus respectivos poços. Gráfico 2. Curva padrão das absorbâncias e quantidades obtidas no experimento 2. Tubo 5. Absorbância (média) = 0,395 V final = 3550 µL Padrão Pi adicionado = 0,75 mL 1 mL ----------- 1µmol 0,75 mL ----------- x µmol x = 0,75 µmol No poço: 3550 µL ---------- 0,75 µmol 200 µL ----------- x µmol x = 0,0422 µmol y = 9.3696x - 0.0004 R² = 0.9826 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 A b so rb ân ci a Quantidade (µmol) Curva Padrão 57 Tabela 10. Fator de Calibração das amostras padrão. Tabela 11. Fator de Calibração médio das amostras. Amostra A Quantidade = absorbância X FCM 0,0188 µmol x 17,75 µL = 0,3195 µmol/µL Q(A) = 0,170 x 0,1108 = 0,0188 µmol Concentração final: 0,3195 ÷ 200 = 0,0016 0,0016 x 1.000 (diluição) = 1,6 mol/L Amostra B Quantidade = absorbância X FCM 0,0165 µmol x 17,75 µL = 0,292 µmol/µL Q(B) = 0,149 x 0,1108 = 0,0165 µmol Concentração final: 0,292 ÷ 200 = 0,00146 0,00146 x 10.000 (diluição) = 14,6 mol/L FC 1 0,0085 ÷ 0,061 = 0,139 FC 2 0,0169 ÷ 0,182 = 0,093 FC 3 0,0253 ÷ 0,243 = 0,104 FC 4 0,0338 ÷ 0,304 = 0,111 FC 5 0,0422 ÷ 0,395 = 0, 107 FCM 0, 1108 58 Amostra C Quantidade = absorbância X FCM Q(C) = 0,151 x 0,1108 = 0,0167 µmol 0,0167 µmol x 17,75 = 0,296 µmol Concentração final: 0,296 ÷ 200 = 0,00148 0,00148 x 2.500 (diluição) = 3,7 mol/L Tabela 11. Quantidade e concentração das amostras de água A B e C obtidos a partir do FCM. Amostra A Equação da reta: y = 9,3696 x – 0,0004 0,170 + 0,0004 = 9,3696 x 0,1704 = 9,3696 x x = 0,018186 0,018186 x 17,75 = 0,3228099 ÷ 200 = 0,0016140 0,0016140 x 1.000 = 1,61 mol/L 59 Amostra B Equação da reta: y = 9,3696 x – 0,0004 0,149 + 0,0004 = 9,3696 x 0,1494 = 9,3696 x x = 0,0159451 0,0159451 x 17,75 = 0,283027 ÷ 200 = 0,001415135 0,001415135 x 10.000 = 14,15 mol/L Amostra C Equação da reta: y = 9,3696 x – 0,0004 0,151 + 0,0004 = 9,3696 x 0,1514 = 9,3696 x x = 0,01615864 0,01615864 x 17,75 = 0,286815 ÷ 200 = 0,001434 0,001434 x 2.500 = 3,58 mol/L Tabela 12. Concentrações das amostras de água A B e C obtidas a partir da equação da reta. Discussão Para a realização desse trabalho, foram utilizados dois métodos para quantificação de substâncias: o método de Biureto e o método de determinação de fosfato inorgânico. O primeiro, se baseia na reação do reativo do biureto - constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio - com um complexante que estabiliza o cobre em solução. O cobre, em pH básico, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O Biureto, que apresenta coloração azul, se torna violeta na presença de proteínas (pois reage com os íons cúpricos). A intensidade do violeta varia de acordo com a concentração de proteínas na amostra analisada. 60 Já o método de determinação de fosfato inorgânico é baseado na formação do ácido molibdofosfórico e sua subsequente redução com ácido ascórbico, resultando no complexo de fosfomolibdênio de cor azul. A quantidade do complexo azul de fosfomolibdênio formado é proporcional à concentração de fósforo presente como fosfato inorgânico na amostra de água. Por conta disso, o fósforo inorgânico pode ser quantificado por espectrofotometria. A partir dos métodos citados a cima, foi possível obter os gráficos de curva padrão nos experimentos realizados. A curva padrão consiste em uma relação gráfica entre os valores de absorbância, também chamada de extinção, e os valores da concentração ou quantidade da amostra analisada. Então, construímos um gráfico de curva padrão e a partir disso, utilizando a equação da reta, conseguimos quantificar a concentração da amostra desconhecida no experimento 1 e das amostras A B e C no experimento 2. Outra forma de quantificar a concentração de uma amostra é através do fator de calibração, uma constante que relaciona a quantidade da mostra pela absorbância em cada um dos pontos da curva padrão. Através desse método, a partir da média desses valores (FCM) multiplicada pela absorbância, foram quantificados o valor da amostra A (no experimento 1) e das amostras A B e C no experimento 2. Após a obtenção das quantidades do experimento 2, foi possível analisar a distância de cada um dos pontos de água coletada do ponto de descarte de fertilizando enriquecidos com fosfato inorgânico utilizados na agricultura. A amostra B provavelmente foi retirada de uma região mais próxima do descarte, pois apresentou uma concentração maior de fosfato (aproximadamente 14 mol/L). A amostra A apresentou a menor concentração (aproximadamente 1,6 mol/L), demostrando que provavelmente foi retirada de uma região mais longe do descarte, enquanto a amostra C ficou com uma concentração intermediária (aproximadamente 3,5 mol/L). Conclusão A quantificação de substâncias através de métodos colorimétricos demostra sem importantíssima em pesquisas no âmbito das ciências biológicas. A partir da obtenção de um gráfico de Curva Padrão e de Fatores de Calibração, é possível obter a quantidade de 61 uma dada substância inicialmente desconhecida, como foi observado nos experimentos realizados. A partir deste trabalho, conclui-se que ambos os métodos – de curva padrão e do fator de calibração – são bons quantificadores da concentração de substâncias. Além disso, foi possível aplicar o conhecimento bioquímico a um problema biológico real, como o da poluição de um rio com fosfato inorgânico, salientando a importância do entendimento da bioquímica para a atuação profissional do biólogo. Anexo – Questionário 2 1) O que é a curva padrão? A curva padrão consiste em uma relação gráfica entre os valores de absorbância, também chamada de extinção, e os valores da concentração ou quantidade da amostra analisada. 2) O que é fator de calibração? O fator de calibração é uma constante que relaciona a quantidade da mostra pela absorbância em cada um dos pontos da curva padrão. Através desse método, é possível obter a
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