Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
safecover (100x150x16M jpeg) ���� ����� � ������� From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. Jeremy W Dale and Malcom von Schantz Copyright 2002 John Wiley & Sons, Ltd. ISBNs: 0-471-49782-7 (HB); 0-471-49783-5 (PB) ���� ����� � ������� ����� � �� ������ ���� �� ��� ���������� ������ � �� � �� � �� � �� ������� ��������� � � ��� � �� ������� � ���� �� ���� ����� � ���� �! " ����� ��! ������ ��! ��� �#���$ %&'( )*�! +��� �� ���� ��� �'�,- ..(... ��������� ��� /�,,0 '�,- ..(... �1� �� /��� ������ �� �#� ���� ���2��� ��3#�����04 ��1���5�67����8��8#5 9��� �#� :��� % �� �� � �4;;77787�����#����8��� �� � �4;;77787����8��� ��� ���� � �����2��8 �� � � �� ��� �#���� ��� � � �� ������#���! � ���� �� �� ���2 � ��� ��! �� � ���� ��! �� �� ���� �� �� �� �� ��! ���� �����! ���� ��� �! ��� ��������! ���������! �� ����� �� � ���7���! �$��� #���� �� ���� �� �� ������� ! ������� �� % �� � �� '(<< �� #���� �� ���� �� ������� ���#�� �� �� ������� �������� ������! (� �� ��� � �#� =� �! �����! *> �'% ( :+! 7� ��# �� ���������� �� 7�� ��� �� �� �#�������8 ����� ���� ���� ���� ������� ���� ����� � ����! )��8! ?�@ ����� �2��#�! ��7 A��5! �A '�'@<1��'�! *�� �����19 : 9��� � ���:! % ���� ���� -! �1?(,?( ��������! ���� �� ���� ����� � ���� /�#� � �� 0 �! -- % �5 =� �! B�� ��! C#����� �� ,�?,! �#� � �� ���� ����� � ���� /��� 0 % � �! � ����� � ��� D��1�'! ��� E��� ��� ��� �5! ���� ���� �@'� ���� ����� � ���� / � � 0 �! �� ������ �� =� �! =�$� ��! &� ��� B(� ' '! � � ������� ���� � � � � ����� �� ������ �� � � � � � ���#� ������ ��� ��� ���5 �� 2 �� ��� ���� �� "�� ��� ��� �� )�"� �1,.' ,(.<� . /: ��� �50 �1,.' ,(.<- @ /% ���� �50 ������ �� '�8@;'- � ����� �� >�� � )����� ��� ���2���� %2 8 �! %����������! )��� %��� �� �� ��#�� �� ) �� �� �� � ��������� ��� ���� ���5 �� ���� �� �� ���1���� � ��� ����������� � �#� � #��� ���� �#� �� ��� ����� ��! �� 7���� �� � 7� ���� �� �� � �� ��� � �� ��� #��� ��� � ��� ����#� ���8 �������� ������� �� � ������������ � � ����� � ��� �� ��� ��� �8' �#����� ���� � �#� #�� @ �8'8' ��� ��� � �5���� @ �8'8� ��� � �� � ��� . �8'8- =�� � �#� #�� '� �8'8, �#����� ��� ��� ����� '' �8'8@ ������ �� �#���������� '� �8� ���� � �#� #�� �� &�� ��F ��� ', �8�8' &������ ', �8�8� +$��� �� �� ���� '@ �8- )����� ��� ���74 ���� +$�������� '? �8-8' �� ������ ��� '? �8-8� �� ��� ��� '( ! "�# �� � ��� � $��� �� -8' �� �� ������G �' -8� &2��2��7 �� �� %�����#��� �� -8- ���� ��� ���� �@ -8, :������F ��� �? -8@ %������ �� � �� =� � ��� �< % ������������ ��� ��&������� �� '�� ��� (���� !� ,8' +$ � � ��� �� %#����� ��� �� �#����� ����� -' ,8'8' "�� 5��� #� ����� �� ���#�� -' ,8'8� +�F��� �� ��� -� ,8'8- %�����H���������� �$ � � ��� -� ,8'8, ������� ������� ��� -- ,8'8@ �� ���� ��� ���#� ��� -, ,8'8? ��5 ���� ��� #� ��� -, ,8'8. ��#�� �#����� ��� -@ ,8� �� �� ��� �� C# � � ��� �� �#����� ����� -? ,8- ��� +��� ���������� -? ,8-8' �� �� �� � ��� ���� ���������� -. ,8-8� %��� � �2� ��� ���� ���������� -( ������� ��� ������� �'( %� @8' =�� ��� ��� +����#��� ��� ,' @8'8' ��������� � ,� @8'8� � ��5� �� ��#� ���� ,@ @8'8- )������F����� ,. @8'8, %��������� ��� ��� ��� �� ���� � ,< @8� �� ��� ,( @8�8' &� ���F��� ��� ��� ����� ���� @' @8- ��5 ���� %����� � @- @8, ��#��� ����� � @, @8@ B������ ��� �� =�� ��� ��� �� ���� +��� @@ @8@8' �������� �� ������� @? @8@8� ��5��� �� � � ��� @. @8@8- :���������� ����� @< @8? & ��� � �� �� ������� ��� B����#��� ?� @8?8' �� ������� �� % = ����#� � ?� @8?8� ��� ��������� �� ?' @8. �#�� �� ?- ) *������ ) ?8' %� ���� 9�� ��� ?@ ?8'8' %����� ��� �� �� ���� 2�� ��� ?@ ?8'8� �� ������ ��� .' ?8� 9�� ��� " ��� �� �� ��� " � ������ �� .- ?8�8' ��� ������� .- ?8�8� �� ���� � �5 ���� .< ?8�8- )���� ��� 2�� ��� .( ?8�8, =��� ����� 2�� ��� <� ?8- ������ <- ?8, B'- 9�� ��� <, ?8@ +$�������� 9�� ��� <? ?8? 9�� ��� ��� ������ �� +$�������� �� +#5 ��� �� ���� (� ?8?8' A� � � (� ?8?8� B �� �� � ����� (� ?8. �#���2�� ���4 A� � �� "� � (? ?8< �#�� �� (. + $������ ��� ��'( ,�-������ .. .8' ������� ��� ���� (( .8'8' % � � � ����� � '�' .8'8� ����� �� 2�� ��� '�- .8'8- ��� �#� ��� �� �2 �# ��� �� ������� ���� �� '�? �� �������� .8� ���7��� �� � ����� ��� ���� '�( .8- ���� ��� ���� ''� .8-8' )��� ��� �� �=�� ''' .8-8� ���� ��� ����� ''� .8-8- " � ��� � ���� ''? .8, = ����! ��� ��� �� &������ ��� ���� ''? / 0������ ��� 1���� � ��� ��� <8' ��������� ��� ���� 7� � ���� %����� '�' <8'8' :������F ��� '�' <8'8� ������� ������ '�@ <8'8- � ��� �� �������F ��� �$������� '�? <8'8, ��������� ������#�� '�. <8'8@ %���� ����� ��� '�( <8� ��������� +$�������� ��� ���� 7� � �� ������� '-� <8- =���������� '-@ <8, �#�������� '-? <8@ � � � ���F ��� �� %� ���� ����� '-. <8@8' =�� ��� ��� ����� � �� � ���� ��� ���� ���������� '-< <8@8� ��# ���� ��� � '-( <8@8- % = �� ��3#���� � ����� ',� . �� ������� ����� 1������� 2��13 �%! (8' ��� % = =� � ��� ',, (8� % = �� %� � ��� ',< (8�8' &� ���F ��� �� �� % = �� � ��� ',( (8�8� �� ����� �� % = ����#� � ',( (8- ������ % = %���#� � '@' (8, ���1� ��� % = '@� (8@ =�2����1 � ������ ��� % = '@- (8? = ��� �������� ��� �� ���� +��� /=� +0 '@, (8. ������ ���� �� % = '@. (8.8' % = ������� � � ����� '@. (8.8� �� ����� �� �������� � ������ �� � �� �2�� � '@( (8.8- �� ���� �� ����� ���� '@( �4 �'( ��5������� �)� '�8' %��������� �� ��� ��3#������ '?' '�8� �# �� �� ��3#������ '?@ '�8- +$ ������ �� ��3#���� '?? '�8, ��� �#� ��3#������4 �� �� �������� '?. '�8@ ������ ��3#������ '?( '�8@8' &2��2��7 '?( '�8@8� � � ����� '.� '�8@8- =��� � �2� ������ � �� � �� '.- �������� ��� �� (�� ���� �� ��5����� ���� �++ ''8' �� ����� �� ���� ��� '.. ''8'8' &��� �� ���� �� ��� '.. ''8'8� +$��;�� ��� ��#�� ���� '<' ''8'8- )��� ���� ��� �� �� �#�� ��� �� ����� �� ���� ����#� � '<� ''8'8, +$�������� ���� �� '<, ''8'8@ & ��� �� #��� �� �#����� ��� ��3#����� '<@ ''8'8? %�� ��� � �#� #�� '<< ''8'8. %�� ��� �� ��� �� ��� ��� '(� ''8� � � �5� '(� ''8- ��3#���� ��� ������ '(@ ''8-8' ��� ��3#����� '(@ ''8-8� %�� ��� ��3#���� ���� ������ '(( ''8-8- ��3#���� ������� �4 *��� ��? �� (�� ���� �� $������ *�������� �4. '�8' � #�� �� ���� �� 9 �� ��� ��( '�8'8' ������ �#���� ��� ������������� �'� '�8'8� ���1�� �� 2 �� ���� �'� '�8'8- �����2�� �� 2 �� ��� ��� ��� �'� '�8� B� ���� ��� � #����� 9 �� ��� �', '�8�8' ������� ��# ���� ��� � ����� H ��� ��� ��� �� ���� ���� � ������������� /=� %�0 �', '�8�8� % =1� ��� �� ���� �'. '�8�8- ������17��� ���� ������ ��� �! (�� ���� �� $��� 6�&������� ��+ '-8' �� ������ �� ������ ��� ��. '-8'8' ��� ���� ��� � ��< '-8'8� =� �� ��� �� ��� �� � ��( '-8'8- =�2���� � ������ ��� % = �-' '-8'8, �� ��� �������F ��� �-, '-8'8@ %����� �$ ������ �� � �-@ '-8� ��� ���� �� ������ ���� �-? '-8�8' �������� � � ��������� �-. '-8�8� �#� � � �2� �������F ��� �-< '-8�8- �������� � � ����� � �,� '-8�8, ��� �1� ��� �� ���� �,' '-8- B� ���� ��� � #����� �� %���� �� �,, '-8-8' =���� �� ����� �,, '-8-8� �� ��� �� ����� �� �,@ '-8-8- *���� ����� �� ����� � � #�� ���#� ��� =�� ������ � �,< '-8-8,=��#� ��� ������ � �� ���1������� ��� ���� �,< '-8-8@ =#�1�� �� �� �@� '-8, �� ��� ��� � �� ����� �@- '-8,8' ��� ��� ��� � �@- ���� �������� '-8,8� )��#���� ������� �� �� ���#����� ������� �� �@, '-8,8- �7�1��������� � ���� ���������� �@@ '-8,8, %�� ������ �@? �% (�� ���� �� $��� 0������� � . ',8' =�� ��� ����� �� �#�� ���� �@( ',8� ���� �� B �� �@( ',8�8' ��5�� �� #����5�� ����� �@( ',8- =�� ��� ���� �� �� %����� � B �� �?� ',8, ��5 �� �� ����� �?- ',8,8' &������ ���� ���� �� ���������� 7 �5��� �?, ',8@ �� ������� B# ������� �?@ ',8@8' �� ������ ��� �� �� � ����� �?< ',8@8� & ��� ����� ���� �� � �������� �.� ',8? ������� =��� ����� �� ���� >���51�# � �.� ',8. �������� ��� �., ',8< � #����� ���� �#�� ��� ���#�� %�� ��� )� �� � ���� �., ',8<8' �7�1������ ��������� �.@ ',8<8� %� �� ����� � ���� ���� �.? � ���&� ����� $��� 6�&������� �+. '@8' � � ��� ����� ��� +$�������� �� ����� ����� �<� '@8� +$�������� �� ����� ����� �� " � ��� �<, '@8�8' �� ������ ��� � �#����� �<, '@8�8� � ���� �4 ����� ��� � �$�������� �<? '@8�8- +$�������� �� �� � � ����� �<( '@8�8, �� ��� ��� � �#����� �(� '@8- +$�������� �� +#5 ��� �� :�� ���� �(� '@8-8' A� � �$�������� ��� ��� �(- '@8-8� +$�������� �� ����� �����4 � �#��2��#� ��� ��� �(, '@8-8- +$�������� �� � �� �� � ����� �(? '@8, ������ � �� �� ���� �� �(. '@8,8' � ���� ��� ���� �(. '@8,8� ����� ��� ���� �� �(< '@8@ �� ���� B# ������� �(( '@8@8' �� �1����� �� �# ������� -�� '@8@8� ��� �� �� ����� -�- '@8@8- �������� % = -�, '@8@8, %�� ��� ����������� -�, �) ����� (&& ��������7 ������� ��� 0����� !4+ '?8' 9 ������ -�. '?8'8' �#�#�� 2 ������ -�( '?8'8� �2� ��# �� 2 ������ -'� '?8'8- �2� �������� � 2 ������ -'� '?8'8, ��� 2 ������ -', �������� �� '?8� �� �� ��� �� )��� ���� ��� �� % ������ -'@ '?8- :#� � ���� �� ���� ��� -'? '?8-8' )��� ������ ���� �� ����� -'? '?8-8� ���� �� �� ������ -'( '?8-8- ���� ��� �� -�� �+ 8���������� !� '.8' �� ��������� �� ������ -�@ '.8� ���� � �� ��������� �� � � ������ ���� -�? '.8�8' +$�������� �� � ������� -�< '.8�8� +�������� � ��1���� ��������� --� '.8�8- ���� 5���51�# � --- '.8�8, ���� 5���51�� ��������� --, '.8�8@ ������ ���� �� � ������� ��� �� --, '.8- �� ������� %� � � �� ���� ������ ���� --@ '.8-8' ���� �#� � � ��� --. '.8, �#�� �� --< ��- �����&�� !!. $ ������ !%� ����� ! ! � �������� ������� &2�� �� � � -� �� ��! ��2��# ��� � � 5�� �� �� � � � �# �����#� � ������� �� �� � �� �� �� �������� � ��������! �� � � � � �$ ����2� ������ ���� �� � �� ������! ����#���� �� ���� �� � ��� 8 � � I�� ���� #� ������ ��� ��2��# ��� 7 � �� ��2������� �� �����3#�� � ���7�� �� ���� ��� �� �������� ��� �� ���� � �� ���� ������ ��� �� � � ��� � ����� /���� �� ����08 ����� �����3#�� ��� ����#��� �� ���� � � �������� � � ��� / �� �#���3#�� �� � ��� ��� ����� ����#���� �� � � �� ��� ��0 � � 2� ��2�� ������ ���! �� �� ����#� ��� �� �� �� ��# �� � ����#� �8 ���� � � ���� �������� � � ������� �����������! ������� ����� ���� �! �� ������� � �������� � H �� �� ���� ����� � ��� �� � �� ����8 :�7�2��! � �� �� �� ����� ���� �$ ��� �#� ��� � � � ! �� �� �� ��2��2� ������� �� ����� �� ���� �� ������� ��� �� ��� �����! � ��#�� ��� �� 7 �� �� 5��7����� ����2�� �� ���� 7 ��8 ���� ����#��� �����3#�� �#�� � � ����� ���� � ��������� � �� �� � � ������ ����� ������ � / !"0! 7���� � � �� ������ �� 7��� 2 ��� � �� 7 �� � ����� ���� �� � ����� �� �������� � ��� �� ���#�� � �������� ����� 1 ���� �� ��� ���������� ��� �� �� �� ������ �� �#� � ���� �� ���������8 )� � ��� � ��2�� ��� � ��� �� �����3#�� �� ����� ����! 7� � 2� #��� �� ��� ��# ����� � � �� �� �#� � ��8 ��� � �� � �� �� �� ���5! $� � %���� � %�� ���! �� ����2�� ���� �� �������� �� ��� ��2��# ���8 ) ��������� �� ��2� ���� �� � ��� ���#� �� �� ���� ��� �� ���� ���� ��� �� �������� ����� � �� �$�� ��� �2 ���� � � 2� ���� � �� �������� �� �� ��3#������ �� ������ � �������8 ���� � � �� #�� �� 7��� 7���� ��7 � ��� �� ����������� /� ��&��� ����0 � �� �������� ��� ������17��� � ����� �� ���� � �#� #�� �� �$��������! ����#���� ���1 �# ��1� ��� � ����� �� �#�� � ��� � �� � /�� ��� �������08 ��� �#����� �� ��� ���5 �� � ���2��� � �� ���#� ��� � �� ������ � �� ����� ���� �� ��� � �����1��2��� �� � ���� ��� �����8 )� 7�� ��� ��� ���5! 7� � � �� ���� � � #���#����� ��� #������ �# � � #��� � �� �� �������� � �� �������� � �������� /7�� 7� ��#�� 7��� � 2� � ��� ���#����� �� �����#� � �������08 :�7�2��! � 7��� ��� �� ����2 � ��� � �� � ����! � ����� ���� ���� ��� 7��5��� 7�� 7 � � #�� � ���� 5��7����� �� ��� �� �� � � ����� 7�� 7�#�� ��5� � #����� �� � ��� ���� �� �� � �5���#�� � �#���� ��� ��2������ ��# �� ����� ���� �� ���� �� ���� �����3#��8 ������ � �� � � �� � �� ������� ��� ��� �� � ������� � �� ���� ���� �� ��� �� � � ��� ����� �� ��� �� � ����� ������ ��� ��� ��� ��� �� ��� � ������ ���������� � �� ����� �� �� �� �� ���� � �� ��� �� ���������� ������� ����� �� ��� �� ��� �� �� ����� � �� ���� �� ��������� ��� �� ���� �� �� ���� ����� ��� ���� �� �� ���������� �������� �� � � ����� � ������ �� ��� ����� ����� �� �� ��� ! ���� ���� ���� ��� ��� � �� ��� ��� ������� � ������� �� ����� ��� ������ � ���� ��� �� ��� ���� ��� ����� ���� � �� ��������� ��� ��������� �������� �"������� � �� �� �� ������� �� � �� ��� �� ����� ��������� ���� ������ ��� ��� � � �� � ��� ���� ��� ���� ������ ���� ���� ����� � ���� �� �� �� ��� � �� �� ��� � � �� ������ � ����� �� ��� �������� �� ���� � ����� �� �� #$%!�� ������ �� ���� ���������� �� ������� � � � &'� �������� �� � �������� ������� �� ��� (��� ��� ��� ��� ����� �� �������� ������� ����� )�� �� ���� ��� � ��� �������� � ����� � ��� � � �������� ������ *���� ��� ������� �� ��� � � ��� ������ �� ����� �� � ��� ���� ��� ��� ��� �� ���� ������� +� �������� �� � ���� ��������� � � ������ �� ���� ��������� �� ������� �� ���� ����� ��� �� �������� &'� ��� ������ ��� �������� �� ��� �� ���� ���� �� ��� ��� ��� �� �������� �� ��� ���� �� ���� �� � �� &'�� ,�������� ���� �������� �� � � ��� �� ������ �� ��� �� ���� ���� ������� �� ���� �� ����� ��� ��� � �� �� ������ ��� �� �� � �� ��� ���� �� �� � ��� ������� ���� ����� ��� ���� �� ��� �� � ����� ������ ��� ����� ���� ��� ��� �� ������� ��� �� ������ ��� -��� ���� ��� ��������� ������ ����� ��� ���� � ���� �������� ��� �� ���������� ��������� . � � ���� ��� ����� �� ���� �������� ������ �� ������� � � ����� ������ �� �� �� �� ����� �� ���� � � �� ���� ����� �� ���� � ���� ���� � �� ������ ��� �� �� �������� � ����� ���� �� �� ����� ����� ��� �"������ �� ��������� �� �� ��� �� ��� ���� � �� �� ��� �� � ��� ���� �� �������� ��� �� ��������� �� �� �� � ���� � ���� ���� ������� ������ ���� � � �� �� +� ��� ������ �� ��� ���� �� �������� �� �� �� �� � �������� ������ � /� ��� �� �� � ������ �� ��� ������ ���� �� �� ������ �� � ��� ��� ����� ���� � ����� �� � � ��� ��� �� ���� ��� �� �� � ������ �� ��� ���� �� � ��� &'� �� �� �� �� ������� ��� �������� ���� ��� ���� ���� �� � ����� �� �� ����� �� ���� ������ ��� ��� ������ ��� ���� ��� ��� ������� �� �� ��� � ��� � ���� '���� ������� �� ���� �� � �� ��� From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. Jeremy W Dale and Malcom von Schantz Copyright 2002 John Wiley & Sons, Ltd. ISBNs: 0-471-49782-7 (HB); 0-471-49783-5 (PB) � ���� � ���� � � � ���� ���� ���� �������� ��� �� ��� ��� �� ���� ������ ��� ����� ��������� -��� �� ����� �� ��� �� ���� ������ ������� �� � �� �� � ��� �� ��� ����� ����� ������ � ����� ��� ��� ���� ���� ���� �� �� � � ���� ��0 ��� ������� ���� ����� � ��������� � ���� � � � � ������ ��� � � ��� �� ����� �� &'� �� ��� � � � �� (����� � � � � �� ���� ���������� ��� �� ����� �� �� ��� ��������� �� ��� ������ � � � ��������� ���� �� �� ��� �� � � ���� �� �� ���� ������ � �� ��� � ��� ��� ��� �� � �� � �� �� ��� ���� ��� �� ������� &'� �� ������ ���� ���� � ���� ��� ���� ���� ������ �� �� &'�� ��� ���� ���� � � ���� � � �� ����� ���� � �� ��� ����� �� �� ��� � ��� �� � ������ �� ��� ��� � �� �� �� 1,2 ���� ������ ����� ���� ����� � �� ��� ����� ������ � � ���� �� ��� ������ �� � � &'� �� �� � �� �� �� ���� �� � ��� ��������� +� �� ���� �� �� �� � �� � ����� ���� ��� ���������� &'� ����� ��� ���� ��� �� �� � �" ���� �� ���� �� � �� �� � ��� ��� � ����� ����� �� � � �������� �� ��� � � ����� ��� � � ��� ��� ���� �� � ��� �������� ��� ����� ���� � ����� � � � ����� �� � � ���������� � ��� ��� ���� �� � � ���� ��� �� � � �������� *� ���� ��� � �� �� ������� �� �� �� ��� � ��� �� ������� &'� �� � �� � �� �� �� ������ � ��� ���� �� � ������� � ������ ���� )�� �� �� � ��� �� ��� ���� �� ��� ���� ����� � �� ��� ����� *��� �� ��� �� � �� � ����� �� �� ������� 3 �� ��� �� ��� �� 4#5%67% � ���� ����� ��� �� �� ������ ������� �� ��� �� . ��� ��� � �� � ����� ��� ��� ���� �� ����� �� ��� ��� �������� �������� ������ �� � ����� �� ���� �� ���� � ����� �� �� � � /������ �� � ���� ����� �������� �� � �� ��� �������� �� ���� ��� ����� ��� �� �� ���� �� � ��� ��� ��� � ��� � ������ ���� ����� ���� � ����� 7������� �� ��� ������� ��� �� �� ��� ��� ��������� ��� ������ ������ �� ���� ��� ����8 �� ����������� �� �������� �� ���� ��� ���� �� ������ � �� �� �� �� ��� ������ �� �� ���� �� ����� ����� /�� �� � � ���������� �������� ���� ������ �� � � ��� ��� ����� � ����� �� � � ����� �� ���� ���9 ����� ��� ��� ���� � �� � �� � ���� �� �� ��(��� �� ������ ��� �������� ��������� ���� ���� ����� �� �� �� �� �� ����� �� ������ ���������� � � ��� ��� ����� ) � �������� ���� ��� � ���� � �� �� �� ������ ���� �� � ������� ��� ���� �� �� �� ������� ���������� ���� ��� #!! !!! ����� �� � ��� ������� &'� �� � ���� � ���� � �� �� � �� ����� ��� ������� �� ������ ��� ������� +� ��� � �� ����� � ���� ��� ����� � � �� ���� � ���� � ������ ���� �� ���� ���� ��� ��� ����� ����� � ���� ��� �� ������� ����� +� � ���� � �� �� ���� � � �� � � � � �� �� �� �������� � ��� �� � �� �� � � ��� ���� ���� ���� ������� �� ������� ���� �� ��" �������� :��� ��� �� ��������; /���� ����� ��� ������� ��� ���� ����� �������� �� � ��� ��� ������ ����� ��� ���� ���� ��(�� ��� ���� ����� �������� ��� ��� ���� ��� � �� � �� ��� �������� �� ��� � �� ���� �� ����������� �� ���� �� �� � ���� ������� ��� ��� ��� ������ � ������ ���������� + �� ����� �� � ��� ��� ��� �� � � �� � ������������ � ������ � � �� ���� � ��� ������� ���� �� ���� ���� � ��� �������� ��� �� �� ����� �������� �� ���� � ��� �� ���� ����� ���� ���� ������� ���8 � ���� �� ������� �� ���� �� �������� ��� ��� ������� ���� �� ����������� ��� �� ��� �� ������ � �� �� ��� ��� �� ���� *�� �� ���� ������ �� ������� �� ������ ��������� ����� �� �� �� � �� ������ ��� ��� ������� � ���� ���� � ����� �� � ���� ����� �������� �� � ��� � �� ����� � �� �� �� ������ � ��� ���� ������ � ��� ������ ���� ���� ��� ���� ��� ���� �� ����� ��� ���� �� ����� . ��� ��� � �� ���� �� �������� ��� �� ������ ��������� �� �� � ������ ��� ������� � �� ���� �� �������� ��� �� ��� ����� ��� ���� ��� ��� ���� �� � �� � �� �� ��� ���� �� ���������� ����� ��� ������� ��� ��������� �� ����� ��� ��� ���� ��� �� � ����� � �� ��� �� ��� ���� �� � ����� ��� ���������� �� ������ ����� �� ��� ������� ��� ��� � ��� � �� �� �� ����� ���� � ��� ����� � �� ���� ��� � �� �� �� ��� � �������� �� ��� �� �� � ��� ��� �� ��� � �� ��� � ���� ���� < � �� �� �� ������ �� � �� ���� �� �������� ��� �� � �� �� �� ���������� �� ������ ���� ����� �� �� �� � ���� ���� ������� � ���� �� ����� � ������ �� ���������� �������������� � �� �� ���� ���������� � ���� ���� ��� ��������� ������ �� ���������� �� � � ���� ��� ��� �� ���� �� �������� ��� � ����� :� ��� � �� ���� ��� � �� �� �������� �������� �� � �� ���� �� �� � � �� �"������ ��� < � ��� �� �� �� ���� ����� ����� �� � ���� �� ���� �� �������� ���� � � �� � �� �� �� �"����� ����� ���� � �������� � � ������� � � � ������ �� � ���� �� ��� �� ��� ���� ���� ���� �� ���� ���� � ��� ��� �� ��� �� � � ������ ���������� ���� � ����� ���� �� �� ���� �� �� ������� �� ��������� ��� '��� ������� ��� ��� � �� � �� ����� �� ������� �� �� �� ���� ����� �������� ��� ����� /� ����� �� ���� ��������� �� � ��� ����� ������ �� � ��� ��� ��� �� �� � ��� � ���� �� ���� ������ ���� �� =! ��� �� �� �� � �� ����� ��� ���� �� �� ��� �� �� �������� �� ���������� ���� ��� � ��� ��� �� �� ����� � �� �� �� ��� �"��������� ������ �� �� ��� �� �� ����� �� ��� �������� �� ��� �� ��� � ����� ��� � � �� � ���� � ���� ��� ���� � ���� ������ � ���� ������ � � � �� ���� ��� ����� ��� ������ � /� ���� �� ������� ��� ���� ���� �� �� ���� ���� ��� �� ��� �� ����� /� ���� ���� �� � ���� ����� ���� �� �� ������� �"�� ���� � ��� �� ����� �� � �� �� ��� �� ��� ������� ������ � � � ���� � ������� /�� �� �� �� � ������� �� ������� �� � ���� (� ��� ��� � ��� ��� �� �� ������� �� ����� ��� �� ���� � � ��� � ������ ��� ��������� ������ ��9/�� ����� (����� ��� ��������� � 00��� ���� � ��� ��� �� � � ������ �� �� (������ �� &'� ������� � ��� ���9 ��� ��� ��� � ���� ���� �� ������� ��� � ���� ��� �� ��� �� �� ���� �� ��0 �� �� � >�� ������ � � � �� �� �� ��� � ����� �� � �� &'� ����� ��� �� � �� � � ������ ���������9 ������������ � � ����� �� �� �� ��� � � �� ���� ��� �� ����� ��� ��� �� � �� ��� ��� �������� �� ��� � ��� �������� �� ������� � �������� ���� �� ���� ������ � �������� �� ��� �� ������ �� ������� � ������� �� � �� ������ ��� ����� �� �� ���� ��� � ��� ����� � � � � ��� ��� ����� ��� �� �� ��� � ����� ���� �� ������� ���� �� ��� � ��� ���� �� � ��� �� ����� ������ � �� ������ � ���������� ����� �� ���� �� ��������� �� ����� �������� � ��������� ��������� ��� ��� �� ���� �� ��� ��������� ���������� ��������� ���� ��� � ����� �� ��� ���� ��������������� ���� �������� ����� ������ ��� �� ���� ������ � ���� �� �� ������ � � ���� ��������� ���� ���!�� � ������ �� ��������� "� � ��� ����� ��� �� �� �� ���� ���� �� ������ �� �������� �� ��� ������ ���������� ������ ��#��� � � � ���� �� � �� ��� ��� �� �� ����� ��� ������ �� ��� � ��� $� �������� �� ��� ��� � �� ��� %� �������� �� ��� ��&� '(����� )�*+� ��� ����� ������� ����� ���������� �&���� �� � ���� ���� �� �� �������� �� �� ,��������� ���� � ���� �� ��� �� ����� ��!���� '����� ���+ �� � ��� ����� ��� ���� ������ ����� �� ������� ���� �� ��� ������� ����� �� � ������ � ����� �� ��� ��� �� �� ������������ ����� ������ � � � ��� ����� -� � � ��� ��� ������ ������ ����� ��!���� �� � �� � ��� �& ���� ��� ����� ��� ��� ��� � ��� �� ��� ��� � ��������� ���� �� ����� ��!���� �� ���.�������� �� �� � �� ����� ��!�� ����������� �� ���� �� � � ��� ��������� �� ����������� �� ���������� '�� ����������� �������+ ����� ��� ��� ��� ��� � �������� ��������� �� � ������ �� ��� ����������� �� ����� ����� ��� ���������� '/������� �����������0+ ������� ���� ��� ������� ����� � � 1��� ��� ������.��� ���� ��� ��������� ��������� 2����������� ����� ���� �� ��� ��� � ������ '(����� )�)+ � ���� �� � ��� ���&������� ����� �� ��� �� ���� �� ��� �� � ���� ���� �� � ���� ��� �� ����� ��� ��� �������������� �� �� � �� ����� ��� '�� ����������+ ��� ���� �� ��� ���� ����������� �� ������ � ���� � ���� ������ ��� �� � ���� �����. ������ From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology Jeremy W Dale and Malcom von Schantz Copyright 2002 John Wiley & Sons, Ltd. ISBNs: 0-471-49782-7 (HB); 0-471-49783-5 (PB) OH 5' end 3' end OCH2 O 3' 5' O OP base O O OCH2 O 3' 5' O OP base O O OCH2 O 3' 5' O OP base O O � ���� ��� ��� � � ���� 2'-Deoxyribose OCH2 OH 1' 2'3' 4' 5' OH OH Ribose OCH2 OH 1' 2'3' 4' 5' OH OHOH � ���� ��� ������� ��� ��� �� � ����� ��� � ��� ������ ����� ��� ��� ����� �� ������� �� ��� ��� � ')����&�������+ �� ������ �� ��� ��������� ���� �� ���� ��������.���� ����� � ��� '(����� )�%+3 ��� ����������� ������� '�+ �� �������� ',+ �� ��� ������� �� ���� '4+ �� ������ '�+� '5���� � ��� � � �� �������� ��� ���� ��������� ��� �� ��� � ��� ���� �� ����. ����� ����� � ��� ����� � ��� ����+ ����� ��� ������� �� ������ �� � ��� ����������� ����� � ������ ����& �� ����� ������ �� ��� ��� �� �� �� � ����� �� ���������� �� ��� ������ (���������� ��� ����� ���� �� ��� ������ ����& �� ����� �������� �������� ������� ������� ��� � ��� �� �� � ���� ��� �������� ���� � � �������� � �� 4 �������� , '(����� )�6+� -� ����� �� ����� � ��� �� � ��� � ������������� �� ����� �� ��� ��� �� � ��� ���������� �� ��� ������ ���� �� � ��� ��� ��� ��� ��� ��� �� �������� ����������� �� ���������� � ��������� ���� �� ������.��� ���� �� ����� ��� /���0 ��� �� � � $� �����&�� ����� � ��� ����.� �� ��� ' �� �� � �� �� �� ������� �� ��� $� �� %� ���������+ ����� ��� /������0 ��� �� � � ��� $� ��� � ��� �����.� �� ���� ����� ��� ��� ��� ��� �� ���������� �� ����� �� �� �����. � ���� �� ��� ������ ��� �� �� � � ���� �� ������� ���� ��� ����� ���� ��������� �� � �� �� �� �� �� ������ �� ��������� ������.��� ���� ��� �� ����� �� ������� ��� �� ����� �� ���� ��� ��� ��� -��� ���� ��� ��� �� �� Thymine CH3 O O O N N H Sugar Cytosine H N H N N Sugar Purines Pyrimidines Adenine H N N N N N Sugar H Guanine H H N O N N N N Sugar H � ���� ��� ������� ��� � ��� ��� � �� �� ���� ��� �� � � O O CH3 N N Sugar Thymine Adenine H NN N N N Sugar H H NH H N N O Sugar Cytosine Guanine H H N O N N N N Sugar H � ���� ��� 7 ��.� ����� �� ��� ��� ��� ������������� ��������� ��� �� ������ �� ����� ����������� � ��� �� ����� �� 1��� ��� �� ��� ��� ��� ��� �� ��� $� �� %� ��������� �� ���� ���� ���� �� ������ ���� ��� ������.��� ���� ��� �� ����� ������������ ������������ ����� �� ����� � �44,�4 ���� ��� ������ ���� '���� ��� �������� �� ��� $� �� %� ����+ ����� ��������� �� ��� ��� �� ����� �� ��� ����� '���������� ��+ ��� �� ��� ���� ��� ���� �� ��� ��� � �� 4 �������� �� � �� , ' �� ���� ���� + ��� ��� ���� ��� ������� ��� ������ �� �� ���� �& ���� ��� ���������� �� �44,�4 �� ,�4,,� �� ���� ��� ����� ��� �� ���� ����� �� ���� ' � �� �� ��� $� �� %� ���������+� ����� �� ��� ��� $� �� %� ���������8 ��� �� ����� �� ��� ������ ��� �� �� �������� ���� �� � �� ��� � �� �� �������� �� � ��� ������ ��� �� ���� �� ��� �������� ���������� ���� ������ ��� �� �� ����� ������� � �44,�4 '�� ���� ����� $��44,�4%�+ ����� � �� � ��� ���������� ,�4,,� '$�,�4,,�%�+ '��� 7�& )�*+� � ����� ��� � ��� ������ �� � � �� ���� � ��.� ����� �� ������� ��� ��� ��� ��� � � �� � ���� ��� � ��� # ���� �� ��� ���� �� �� ��� ���� ���� # ����� ���������� ����� ������� ��� �������� ����� ������� ��� � ��� ��� �� ���� ��� ���� �� ���� �� ���� � �� ��� ��� ���� ����� �� ��� � � ����� ���� �� �������� �� � ����������� �� ��� �� ���� � ��� ��� ��� ���� �� � �� �������� �� �� ����������� 7�� ��� �� ��� ���������� ���� �� ��� � �� � ��� ��� ��� ��� ���� � ���� 1��� �������� � �� �� ��������� �� ��� ���� ���� ��� �� �� ���� ��� ����� �� �� ���� �� ��� ��� ��� ���� ������� �� ��������� ����� �������� �� � ������� ���� ���� �� �� ����������� �� �� �� ����� �� � �� � '���� �� � 59+� ��� ��� ���� �� ������.��� ���� ��� �������� ������ ���� ����� ������ ���� � ��� �� ��� �������� �� �� � � ��� �� ������� � ��� ������� ����������� '��+� ���� �� ���������� �� ��� � �� ����������� �� ��� ���� ����� �� ����3�������� '4,+ � �� � ��� � �� ����� �������� ����� ���� �� �������� '���� ���� ���� � ����+ �� � ������3������� '��+ � ��� ����� � �� ���� ��� �������� ������ �� �� ��������� �������� �� ����� �� ��� ������� ������ ���� �� ��� �� ����� �� ��� ��� ��� �� ����� '�� ��� � �� ����������� �� ������+� ����� �������� ����� �� ������ �� �� ������� ����� ��� ������ �� ���� � �� �� ������� �� ����� ���� ��� �� �� ���� �� ������ �������� ������� ��� �� ������� -� ���� ��� � �������! ���� �� ���� ��� �� �� ,� ���� :� �������� ��� ���� � � �� � ��� '�#� �� 4#,+ �� ��� ���� ����� �� � �� ����� ���� ����� ���� ��� - ����#,��� ������ ����& � ����� �� ����� � ��� � � ����� ������ ��� �� ���� ����� ����� ����� � ������ ����& �� ���� ������ �� '���� � ��� ������� �� ������.��� ���� ������� ���� ���� ������ �� ���������� # ��� �����+� �� ������� �� ��� �������� ����� ��� ������ ��� ���� ��� ��������� �� � ��� ���� �� �� ����� �� ������������ ������� ��� � ���� ��� ����������� � ���� �� ��� � ��� �� �� �� � ������.��� ���� ��������� �� ����� ��� � ��� �� �&����� �� ��� ����� ����������� �� ���� ���� " ����� �� ��� � ��� �� ���� ���� �� �� ������� ���� ����� ����� ���� ��� ����������� � ���� �� ����� �� �� ��� �������� ������� ����������� ����� ������ �� ��� ������ ���. ��������� ���� ������� ��� ��� ��� ���� ���� �� ���� �������� ���� �� ��� ������ �� �������� � ��.� ����� ������� ��� �������� ����� ������ � � ��� ����� ���� ������������ ����������� �� ��� ����� ����� � � ��������� �� ��. ��� ��� �� ��� ��� �� ������ �� '���� � ���� ����+ �� � ������ ��� ��������. ��� ����� ������� -� � � ����� �� ����� �� ���� ������ ������� ��� ��� ��; ���� �� ���� ��� ��� � �� ���� 2�� ��� ������.��� ���� ����� �� ��� ��� �&���� (�� �& ���� �� ���� ������� ��� ������� � ���� � �� ������.��� ���� ���� � ������.��� ���� ������� ��� �������� ���� ���� �� ���� �� �� ������ �� ���� ��� ��!�� ������.��� ���� ������� ��������� ���������� �������� �� � � ������ �� ����.���� ����������� ���� � � ��� ������ �� �������� ��� � ��� ���� ��� ����������� � ���� �� ���� ������ ���� �� ��� ������ �� ��� ������ ����� ��� � �� �� ���� ��� �� � � ������.��� ���� ������� ��� ���� ���� ��� ������� �� ������& ��� �� ���� ��� ��!�� ������ �� ��������� �������� ����� �� ������ ��� ������� ���� 2�� ��������� ���� � �� ����� 2�� '�2��+ �� ������� � 2�� '�2��+� ���� � � ��� � ���� �� ������� �&���� ���� ������ ��� ���� ��� ����� ����� �� ������ � � ���� �� ���� ��� �� ��� ����� � ������ ����&� ����� ���� � �� �� � ���� ��� ��!���� �� ������ ��� ��� �� �� ��� � �� ��� ��� ��� ����� �� ������ � � �� � ���� �� ��� ����� ���� �� ���� �&�������� �� �� ��� ����� ���� �� ��� ������ ����� � ������� � ���� �� �� � �� ���� ������ �� ��� ��� ���� �� ��� �� ��� ������ �� ������ �� ��� ������� ��� � � ����� ���� ��� � �� ��� �������� ��������� �� ��� �������� ����� �� ����������� ����� ������8 ��� ������ ��� ���� �� ��� �� ��� ��� ��� ��� � ���� ��������� ��� ��������� �� � ����� �� ����� ��� ��� ��� ���� �� ��� �������� �� � �� ���� ������ �� ������� ���� �� ��� �������� �� ����� �� ����������� ����������� ��� �������� ����� ��!��� ��� ��� ���� �� ��� �� ��� ������ �� ������� 9������ �� ��� ������ ��� � �� �������� ���� �� �� ����� ������ ������� ��� ��� ��� ���� �� ��������� �� ��������� ��� ��������� # �� ��������� �� � � ��� ��� � �� ���������� �� ����� �� ��� ����������� �� �������! ���� '��� ,� ���� :+� ����� �� ��������� ,����� ��� 2�� �� ���� ����� � ������ ��� ���� ���� � ������ � ���������� �� �� � ��� 2�� � � ���� ���� ��� ������ � ���� �� � ��� )�.���&������� '���� ������ ������� ��� �����&�� ����� � ��� )� ��������+ ������� �� ��� '(����� )�$+� 9������ ���� ������ ���������� � � �������� ������ �� ���� ���������� �� ��� ������� ��� ������ ��� �� ��� �� ������� ���� 2�� �� �� ���� ��������� ���&������ �� ���� �9� <���� ����� ���������� ��� �� �� ���3 ������� ��� ��� ��� ���� ��� � �� ���� ���� ��� �� ��� �� �� � � ��� �� ��� ��� ���� ���� ��� �9 �� ������� � ��� � ������� ���������� �������2�� ����� �� �� � ��� ������ ���� ��� �� ��� � ���� �� � ������� '(����� )�$+� 4���� ��� ����� ���� �� ��� ��� �� ��� �� ������ ��� ���� ���� �� ��� 2�� �� ��������� �������� �� ������ �������������� ��� �� # ������� �� ���� �������� ��� �������� ���� ��� ����� ��� ������� �� ������.��� ���� ������� ����� 9������ ���� ����������� ������� 2�� �� ��� �� ��� � �������� �������� �� ��� ������� ���� ���������� ��� �� ���������� �� ��� � ��� � ����� �� 2�� �� ��� �� ��� ���� �� �� ��� ������ �� ����������� �� �� �������� ��� ����� '���� �&������� �������+ ��� �� ��� ��������� � ���� � ����������� ��� ��� ������� ����������� �� ��� ���� �� ��� ������ ���� ������� �� � � � ������� �� � ��� �� ������.��� ���� ��������8 ��� ����� �� 2�� �� ��� ���� �� ��� �� ���� ������ ��� �� �� ������ ��� �������� �� ������ ���������� �� ��� �� ����� �������� ��� ���� �� ������� ���������� 9������ ����� �� ���� ������� �� � � �� ������.��� ����2�� � ����� �������� ���� � �� ����� ��� � ��� ������ Uracil DNA RNA 2'-Deoxyribose Thymine N N H O CH2 OH 1' 2'3' 4' 5' OH OH Ribose O CH2 OH 1' 2'3' 4' 5' OH OHOH O OCH3 N N H O O � ���� ��� ����������� ������� ��� �� 2�� � ���� � ���� ���� ������.��� ���� 2�� �� ���� ������� ' � ���� � ���� �� �����+ ������ �� �� ������.��� ���� ��� ������ ����� ������� ��� ��������� -� �� ��� ���� �� �������� �� ��� ��� ��� �� ��� ������� ���� �� ��������!��� ��� � ��� �� ����� �� � �� ���� �� �������� �� ���� ��!�� �� (����� )�= ����� ����� ��� ������� �� ���������� �� ��� ������� ��� '%�.59+ �� ��� ��� ��� ��� ������ �� ��� ���� �� ����� �� ��� ����� �� ���&����������� �������. �� �� '���"+ ���� ��� ��� �� � � �� ��� ������� � ��.� �� ���� ��� ������. ������� ������� �� ��� ����� �� ��� ��� ��� ��� ��� �� �� �� �� �&������ � ��� %�.59 ���� (�� ���� �� ����� �� ����� �� �� ������� � �� � ��� ������� � ��� %�.59 ��� �� ����� ��� ��� ���������� �� �� �� ���� �� ���� ���� � ��. � ���� ���� ��� � ����� �� ��� ����� ��� ��� 2�� ��������� ������ �� ���� ��� � �� � � � � � � ���� ����������� ���� �&���� �� � �� ������ ��� ������ ��� �� ���������� ��������� ��� '��"�+ � ���� �� � ��� ���&����������� ��������� ��� '���"�+� ����� �� ��� ���� ������ �� ���������� ������� ��� ��������� ���� ������ �� �&������� �� � �&������ ��� �� # �� �� �� ����� ������ �� ��� �� �� ����� 2�� ������� ��� �� ��� ����� � �� �� � � ��� �� �� ����� ��� 2�� ��� �� ���� ��� ��� ����� ��� ������� �� ���� ��� ��� � �� �� ���� ��� �� � �� 5' end 3' end OH O O 3' 5' CH2 O OP base O O O O 3' 5' CH2 O OP base O O O O 3' 5' CH2 O OP base O O OH O O 3' 5' CH2 O OP base O O O O 3' 5' CH2 O OP base O O O O 3' 5' CH2 O OP base O O OH OP O O OP O O dNTP Formation of phosphodiester bond � ���� ��� ��� ��������� ����! ������" �� �����������" ��� � � �� ��� ����� �� ��� ����� �������� �� �������� �� ����� ��� �� �� ������ ��������� ���� �� ������ �� �� ���� ��� ��� � � ��� �������� � ��� ���� ���� �� �� � � ��� �� �� �� �� ��� ������ ��� ���� �� � �� ��������� ��� ��� �� ��� � ���������� �� �� ���� ��������� ��� ���� � ��� � ��� ������ ����& ����� �� ����� � ����������� ����� ���� ����� �� ��������� �� ��� � � ���� �� ��� ���� �������� �������� ����� ��� ����� ���� �&�������� ������.��� ���� ��� �� ��� ��� &�� �� �� ���� ��� �&���� � �����.� ���� ������ ����& ���� ��� �������� ���� ��� *> � �� � ���8 ���� �� ���� � ��� � �� ����� ��� � ��� ������ ���� �� ���� 9���������� ����� ������ ������� ����������� � ��� �� ��� � �� ��� �� ���������� �� ���� ������� �� ��� ����& � ��� � ��� �� ������� ������ �������� �� ����� ���� ��������� �&������� �� � ��� ���� ����� ����� ���� ��� ����������� � ���� ����� �� ����� ����� �� ������ ����& �� � � � �&��� ��� ��� ��� � ���� ' ��� �����.� ���� ��� ���� ���� �� ���� ** � ��� ��� ����+ �� � ��� ����� �� ����.� ���� ������ ����& ���� ���� ������� � ��� � ��� ' !��! � ��������� ����� ��� ������ ����+� ��� � ���� �� �� ������ � �������� � ���� �� ������� �� ��� �� ����� � � ������� ��� ��!�� ������ ������� ��� �����.� ���� 7 ���� �� ��� ����.� ���� ? ����� 9������ � ��� � ��� ��������� ���� ������� ��� 7 ���� ��� ���� �� ��� ������� 9������ �� � �� ��� ��� �������� ������ ����� �� ������ ������ �� �������. ����� ��� ������ ����& �� �� ���� ������ �� ������ # � ������ ���� � ����� �������� ����� �� � ����� ����� ������� ��� ������� �� ��� ����& �� ��� �������� ������������� �� ���� � ��� ���� �� ��&�� �� ����� ��� ������ �� ������� ���� ���� ��� ����� �� ������������ �� ���� ���� � ��� ������ �� � ���� �����. ��� ��� ' �� ���� ��� ��� �� � ���� � �� ���+ ���� ��������� ����� �� ��� ��� �� ��� �������� �� � �� ���� �� ��� ���� ���� ������� �� ���� ���� ��� �������� ��� ��� ��� ����� ��� ���� ��� ���� ��� ��� ������������ �� ��� ���� ��� ��� �� ��� ��� ���� ������� ��� ���� ��� �� � ��� ��������� �� ��� ������� �� ��� ���� ������� � �� ������� ������������ ��� �� ���� �� ������ ����8 ��� ���� �� ��� ���� �� ��� ��� ���� �� ���� ��������� ���� �� ������ � ��� ���������� ���� � '����+ � ����� � �� ������ ��� ��� ������ �� ������� �� ������������ ' �������� ���� � ��� ������� ��� ��+ �� ��������� ��&�� �� � ���� �� �� ���� ������� ��� ��� ��� �� ��� ��� ���� �� � ���� ����� �� ��!���� ���� � �������������� '��������� ��� ��� ��+ �� � �� 1��� �� �3 ���� ��� ��� ��� ��� ��� �� ���� �� ������ ��� �� ��� ���� �� ���� � ����� ���� ����� ��� ������ �� ������� �� ��� ����& �� ���� ������ ��� ������������ �� ��� ���� ���������� ��� ��� � �� � ��������� ��� �� ��� � ��� ���� ����� �� ���� �������� �� ,� ���� $� �� ��� �� ����� �� � �� ���� �� ��������� �� ��� ������ �� � ��� � ��� �� � ��� ��� ����������� ���� ���� �� ���� ��� ���� ��� ����� 9������ �� ��� �� ��� ��� ��� �� ��� �� � �� ����� ��� ��� �� ���� ���� �� ��� �� � �� � ����� �� � � ��������� ��� & ���� ���.����������� ���� ���� ��� �� � ��������� 7 ���� �� ��� ����&� ���� �� ���� � � ���� �������� ���� '�� ����� �� �� ��� ���������� ����� �������� ���� �� ��� � ���� �� ����+� ��� �� ���� ���� ��� �� �� ��� &�� ���� ���� ��������� �� ������� ��� �� ����� �� ����� � ����. � ������ �������� �� � �� ���� ��� �� ��� ��� � �� ��� ��� �� � �� ��� ������ ��� ������������ �� ��� ��������8 �� � ���� ��� � ���� ����� �� � � ���� ���������� ���� � ����� � ����� ���� �� ��� ���������� �� ��� � ����� ��� �� ���� ���� � ��� �� ��������� ������ �� ��� �������� �� � � ���� ��� �� ��������� ��� ��� � �� � ����� �� ��� � ���� �� ���� ���� ��� ���� � ����� � ����� ��� � �� �� ���� ��� �� � �� ��� ���� � ��� ��� ��� ����� �� �� ��� ���������� �� /����0 �� � ���� ���������� ��� ������� �� � � �� ��� � ��� � �� �� �������� ���� �� ����� �� ���� �� ��������� ��� ���� �� ������� ��� �� � ������ ��� �� � ��������� ' ���������+� �� ��� ����� �� �������� ���������� �� ��� �� �������� �� ��� ��� ���� ���� � �� ���� ��� �� ����� ������ ��� �������� ����������� ������� ���� ������� ����� /�����0 �� � ���� ��� 2�� ��������� ���� � ������� � 2�� �� �� ����� 2�� ����� �� ��� �� ��� ��� ���� ��������� �� ��� ������� ����� ���� ������� ����� �� ������ �� ��� ������ �&�������� �� ���� ������� ��� ���������� �� �������� �� �� ��. � ���� -� ����� ��� ��� ���� /����0 � ����� ���������� ���� /���� �� ���� �� ��0 '52(+ ���� ��� ������ ������� ��� �� �� �� ���� ������ ' ������� ���� �� � ���������� �� ����� � ��� � �� ������� �� ������ �� ������ ��� ������� ��� ���� ����� ������+� �� � ����� ���� � �� �� �� �� � ������������� �� ������ �� �� ������ ��� �������� �� ������� '��� �����+ � �� ���� ���������� ���� ���������8 ��� ������ �� ��� ���������� �� � ���� ��� ��� ������ ���� ��� �������� ����������� � � �� � �� ����� ������ �� � ��� ��� � ������ ��. ������ 7 ��� ��� �� �� ��� �������� �� ������� � �������� � ���� ����� �����. ������ 9������ ���� �� � ���� ������� �������� -� 1��� � �� �� �� � ����� � �� ��� �� ��� ��� ���� ��������� �� ������� �� �� ���������� ���� ��� ������ ������ '52(+ ��� ������ �� �� ����� �� � �� �� �������� ���� �2�� '��������� ���� ��� ��� �������+ �� ��� ����� ���� �� ��� ������ ����� '��������� ����� . ���� �������� �� � �� ������ ��� �� ��� ���� �� �� ����+� �� ���� ������� �� � �� �� ��������� ���� �� ��� �� ����������� �� /����0 ��� ��! ���� ������� �� ������ �� ��� ������ '� ����� + � ����� ������. ����� �� � � 1�� ���� �� ��� ���������� �� ��� ����� ���� �� ������� � ������� ������ ��� �� ����� ��� �� ��������� �������� ����� #������ �� � ����� �� �� ���� ������ ��� ����� �� ����� �� �� �� �������� ���� ������ �������� ���� ��� ���� 2�� ��������8 ���� ����� �� ����� �� ���� � � ������ '(����� )�@+� �� �� �� ����������� �������.������ ����� ��� �� �. ��������� ������� ��������� 2�� '�2��+ �� ���� �� ��� ��� ���� ������ �� ��� � �� ������������� ���� � � ����� �� ��� ��������� �� ����� ��� ���� ����� � ��� ��� �� ��� �����������.������ �� ����� ������ ���� �� ��� ���� �� ���� ���� ��� ������� ������ ��.����� ���� '������� ������� ���� ���� ��� �2��+� ������ ������ ��� ��������� � � �� �� ������������� �� ������ � �������� ������� ����� ������ ��� �2�� �� ������ 4���� ��� ��� ����� �������� �� ����������� ��� ��������� ����� �� ��� � �� � ��� � �� ���� �� ����� ��� � ��� ������ TRANSCRIPTION TRANSLATION mRNATranslation start sites: A B C D Gene a Gene b Gene c Transcriptional terminatorPromoter Gene d � ���� ��� ��������� �� � ������ �� ������� � ����� ��� ��� ��.����� �� ����� ���� �� ����� ����� ���� �&����. ���� ���� �� �� ���� �������� �� �������� �� �� ����� ����������� �� �� ������ �� ����� �� ��� � � �� ����� ��������� ����� �� �� ��� ���� �� ��������� ����� �� �� �� � ���� � ���� ������� ��� � �� �������� ���� ������ �2�� �� ���� � �� ����� �� � �� �� ����� ������ �2�� � � ���� ���� �� ��������� �������� ��� ����� ��� �� ��������� � �� ���� � ��������� ���������� �� ��� �2�� '��� �����+ �� �� ��������� ��� ���� ����������� �� ��������� ����� �� ���� ��� ��� ���� ��������� �������� ' � ������ �� ���� �������+� � ��� ������� �� ��� ��� � �� ������ � �������� ����� ������ ����� $���� �� ������� �� � ����� ����� �� ����� ��� ������ ���.���.��� ��� �������� ������� ��� ������ �� ����� �� ��� ��� ��� �2�� �� ��� �������� ���� �� ��� ��� ��� ���� ��� �� ������ ����� ����� ��� ����� � �� ���������� ������� �� � �� ����� ������ �� � �� � ������ ��� �� ��� ���� ���� ��� ��� � �������� �� ���� ��� ���� � �� �� ����� '�������+ ����� �� ������� �� ���������� �� ����� �� ��� ��� � �2�� ��� �� ��� ���� '(����� )�:+� ������� �� ����� �� � ����� ��� ���� ����� ������� ���� �� � ���� ��� �� ��� ���� ��� ������� �� � ����� � ����8 ��� �� ���� ������ �� ����� ��� ���� � ��� ������ �������� � ��������� �� �������� �� ������ �������� �� � ���. � � ���� ��� ������� � ������� � ���� ����� ���� ��� � ���� �� �� ���������� �� �� ��� ���� �� � ����� � ����� �� ��� ��������� �� �� ��� ���� ��� �2�� ����� �� �� ����� � �� ����� �� ��� ��� �� ����������� ��� �������� �� ��� 2�� �� �� ������� ������ �� ��� ����� ��� � � ��� �� � ��� ������������ �� AAAA Promoter Precursor mRNA Polyadenylation site 5' 3' exon 1 intron exon 2 intron exon 3 AAAAMature mRNA Removal of introns (splicing) AUG Stop codon Protein Cap � ���� ��� A&��� �� ������� ��� �� ��!� �� ���"# ���� $%&��'' �� ��� � � �� ����� ����� �� �&������� �� ������������ ����� � �� �� ���� �� ��� ����� ���� � ���� � �� ���� ��� �� � �� �� ����� ��������� ������� ��� � ����� �� ������ ��� � ��� ���� '(����� )�B+ �� �� � ����� ��� �� ��� � ��� ������� � ���� � �� � � ����� ������ ���� ���� ��� ����� ���� �� �����&� ��� ������ �� ��� �� � ���������� �� ��� ���� �� ����� ������� ��� ������� ���� 2�� '�� �. ���������+ �� ���� ��� �� ��� ���� �� ��� �2�� ���� ����������� �� ���������� (������ ��������� �� �� ����� ������ ��� ������ ������� � � �� � ��������3 ����� ������� ��� ������� �� ��� ����������� �������� �� ����� ���� ���� ����� �������� �� ���� �����.������� ������� �� �� ���� � ��� ������. � ���� ���� �� �������� ���� �� ���������� ����� �� ������ �� ����� �� � �� ���� � ��� 2�� � ���� �� � ������� �� ��� ��� � ������� �� ���� '������� � �� �� ����� 2�� ��������� ��� �& ����+� ����� ������������� �� ���������� �� � ����� ��� �� 2�� ������� ��� 2�� ������� �� �������!�� �� ����� �� �������� �� ����� '��� ��������+ �� ����� ��� ��� ��������� �� �2�� ���� � �1 ���� ��������� � ����� � � ����� � �������� � ����� ��� ��������� �� ������ '���� �� ������ �� � �� ������� ��� ��� �� �� �����+3 ��4�,� ������� � �������� �%$ '���� %$ � ��� ������ ��� �� ���������� �� �� ����+ �� ������ ��*> '(����� )�*>+� �� �� ������ �� �� ������� �� ��� � ���� �� ���������3 ��� � ����� � ��������� �� ����� ��� � ��� ������ Transcription Translation Folding Post-translational modification RNA Protein Biological activity DNA DNA DNA polymerase tRNA ribosomes Replication RNA polymerase � ���� ��� ������ ���� ���� CAGGTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACA -35 region -10 region GTCCAAATGTGAAATACGAAGGCCGAGCATACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGT mRNA Promoter −30 −20 −10 +1−40 Transcription start site � ���� ���� ��������� �� ��� �������� ������ �� ��� ��� ������8 ���� �� � ��� �%$ �� �*> ������� �� ��� ��� �������� �� ��� ���������� �& ���� ���� ��� ��������� �� ������ ��4�,� �� ������ ������������ � �� �& ���� ��� �� ������ ����� ��� �� ��� ���� �� � ��� ������ �� ���. ������ ��� ���� ��� �� � � �� ��� �������� � ��� ������ �� ���� � �� ��� � �� � �� '��� 7�& )�)+� ��� 2�� ������� �� � � ������ ������� ��� ���� ��������� �� � ������ # ��������� ��� ���� �� ��� �& �� � ���� �� ��� ��� ��������� �� ������ ��� �� ������ �&���� �� ��� �� ����� �� ������ ������� ��� � ���� �� ����� ���� �� � ����� � ��������� ��������� ��� �&������� �� ����� ���� ����� �� ��������� �� ���������� ������� �� ,� ���� *%� ��� ����������� ����� � � ��� ����� �� �� �� ������ �� ����� �� ��� �������� �� �������� ��� � ���� �� ����� ��� �� ���������� �� �� ���� ����� ������ �� �����. ����� �� ���������� � ����� '���� ���.������� �������� ������� �� ����� �� ����� � ��� �� ��� ������+ ���� �� ������ �� ���. ����� �������� �������� '���� �������� �� � ����� ��� �&�������� �� ��� ���� ��&� �� ����+ �� �������� ��� ���� ������& ���� ���� ��� ���� ��� ���� ���� ������&��� � � � ���� �� �� �����8 �� ����� � ������ ��� � �� ������ �� ���������� ��� ���� ��������� �� ���� ����� ���������� ���� ��������� ��������� ���� ��������� ��� ������� ������ �� ������ �� ������� � �� ���� ���� ���� ��� �������� ���������� �� ����� �� �� ����.���� ��� ������ �� �&�������� ��� � �� ��� �� ����� ����������� ��� �������� ������ ������� ������ �� ������& ����� ���� �� ��������� ������ �� �� ���������� �� � ����� ������ �� �� ������ ��� ���� �� �� ������� ������������� ��� '��2��+ �� ���� �����.����� � ���� � �� �� ��������� �� ������ �� ������ � ����� ��!�� ���������� ��� �� ���� �� ��� $� ���8 ���� �� ��� ���� �������!�� �� ��� ��������� �� ������� ��������� '��� �����+� ��� ��������� �2�� �� ��� ��� � �������� ���� ��� ��� ��� %� ��� �� ���� � ���� ���������� �� ���� �� ����� �� �������� �������� �� ���� �� ��� ��� ����� ���� �� �������� ������� �������� �� ���� ����� ���� ����������� �� ������ �� ��� %� ���� ��� ��� ������� � �. ���0� /� �����0 �� �2�� ��������� ����� �� ���� ������ �� ��� � ��� ���� ��� ��� ���� ���� �� �� ������ �2�� '��� ,� ���� @+� (�� ��� �� ��� ������� �� �������� ��� ������� �� ������� ��� �� ��� �&��� �� 1����� ��������� �� � ����� ��� ��������� �� �� ���������� �� �� ��� ���� � � �� �� �� ��� � �� ���� ������ �� ������ �������� �� ����� ����� ��� ��������� �� ��. � ���� ��� �2�� ������ ������� ������ ��� 2�� ������� �� �� ����������� ���������� �� ���� ����� � � ���� ������ ��� �2�� �� ��������� �� �� ��. ��� ��� $������� �% $� ��� ��������� 7 ��� � ������ ��� # *> �� %$ ��������� �� ������ �� ��&��� �� ��� �� �������� �� ������!� ��� ��������� ���� �� � ��� ��������� �� ������� ���� ���� � ���� ���������� �� �� � �����!�� ���������� "������� * �� ��� �� ���������� �� �� ����� �� ����� ��� � ��� ������ ���� �� ����� �� ��� � ���� �2���������� �� �� �������� ��� �� ��� ������� �� ��� ������ �� ����� �� ��� ���� � �� �� ��� ��� ��������� ����� �� ������� ���������� �� ��������� �� ��� ����� �� ��� �������� �2�� � �� ��� � ���� �� � 1��� ��� � �� �� ����������� ��� ����� �� � �2�� ������� ���� �� ������� �� ��� � �� �� ���� � ���� � ���� � �� ��� � �� �� ���������� �� � ����� ���� �2�� ��������� �� ���� ��� ���� ��� �� '���� � �� ���� �� ���� ��� �������+ ������� ���� �� ���� ���� �� ���� ��� ���� ������ �� ��� � 1����� �� � ����� � �2�� ��������� �� �� �� � � ����� � � � ����� ���� ����� ������� �� ���� �&�������� �� �� ����� ��� �� ���������� �� �������� ������ ��� ������ �� �� ���� �� ������ �2�� ��������� �� �� ����� �� ����� � ���� �� � �������� �� �� ���� �� ���������� �� ��� � �� �� � � ��� ���� �� � �� ��� �� ������� ��� ��� ����������� �� � ����� �&���� �� ���1����� �� ���� � ��� � ����������� � �� ����� ,���� ������ �2�� ��������� ���� �� �� ���� �� ��� �� �����. ������ � ��� ����� �� � �� ��� �& ���� �� ��� ����������� ��� ��������� ��� ���3 ��� ����� �� � �2�� �� �������� �� ��� ���������� �� ���� � ���� � ���� -� ���� ������� ��� �� ����� �� ������ ���� ����� � � ������ �� ,� ���� *%� ����� ����������� �� � ����� �� ��� ���� �� ��� ���� ��������� ���� �� �������� ���� '��� �� ����� �� ��� ���� ��!+ ����� �� �1 ���� �� ��� �� �� ������ ��� �� ����� �� ��� �������� ������� ���� ' ��� ���� � ��� !����"�������� ��#�����+ � � ���� �������!�� � ����� ���������� �� �� ��� %� ��� �� ��� *=� �2�� '(����� )�**+� ��� ������� �� ����� �� ���� ���� �� ��� ���� ��� ���� ��� �� �� ����� ���� ����� ��� ���������� �� �� ��� ���� ������� �� � ���� ���� �� ���� ������. �� �� � �� ���������� � ���������� �� ����������� ��� ����� �� ���� �&��������� �� ��� ���� ���������� ���� ��� ������ �� ��� ����� �� �� ���� ��� � ��� ������� ���������� ������ �� ��� � �� ������ �� �2�� �� � ���� �������!� � �� ������ ���� ������� �� �&������ ���� ����� �� ,� ���� *$� 5' Translation 3' mRNA 16s rRNA 30S ribosomal subunit met Initiator tRNA � ���� ���� 7 ����� � �������� ������� ���� ��� ����������� ����� � � ��� ����� �� �� � ����� � ������� ����� �� ���������� �� �� ��� ���� ����� �� ��� � �� ���� ������ �� ��� ���� ��������� ���� ���� �� ��� �2�� � ���� � ��� 27� � � ���� ��������!��� ���� ����� ���� �� ���������� �� ��������� ��������� ����� ������ ��� 2�� ������� �� �� ��� ���� ��� �2�� � �� �� ����� ��������� �� ������� ��� �2�� � � �� ���� �����.����� ��� � ����� �� � � ��� �� ��������� ����� ��� � ������ �� ��� ������������� ������������ �� �� ������ ��� ���� ���� ' � ��� �+ �� �������� ������� ���� ����� � �� ������� 1��� ������ � �� ��� ����� ���� ����� ��� �������� ����� � ��� ���� $� ��� �� ��� �2�� �� ��� � � �� �� �� ���� ��� $� ���� ��� ��� ������ '<�2+ ����� �� �� ���� � ����� ���� ������ ��� �� ����� �<4� � �� ������. ����� �� ��� � � ������� ����� ����8 ��� ����������� �� ����� �� ��� ������ �� �� ������ ��� �� �� �� ������� ���������� ��� � �� �� � ��� $� <�2 �� �� ���� �� ��� ���� ������ �� ��� �������� � �� �� � ������ �� ������ ��� ���������� �� ��. � ���� ���������� �� ��������� ������ �� ���������� � � � �� ������ �������� �� ��� ���� ������ �� ��� ����� �� ������� �� � �� ��������� �� ����� ��� � ��� ������ � ��� �� ���� � � ��� ���� � �� � �� ������� �� � � ��� ��� � �� �������� �� ��� �� � � �� � �� � � ������ �� ��� ������� � �� ��� ����� � �� �� ��� �� ����� �� ��� �� ��� ���� � ���� ��� � �� ��������� ��� � ��� ��� � ��� � ��� � � ��� ������� �� �� � �� �� � � ��� �� � ����� � ���� ������� � ���������� � ��� ��� � ��� ��� �� ��� ���� �� ��� ����� ���� �� ���������� �� ���� � ��� ��� ���� ���� ������� �� ����� �!� ��� �� �� � � �� � � � �� � ��� � �� ��� � � "� ���� ��� ������� � ��� �� �� � ��� � ����� � ���� ��� � � �� ��� �� � ���������� ��� � ������� �� � ���� �� � � � ����� � ���� �� � �� ������� �� � ����� � ����� ���� � ���� � � �� � ������ ���� #��� �� � �� � �� ���� �� � �� � �� �� �� �� � #��� ������� � �� �� � �� ��� � � ��� ���� � ����� ����� �� �� �� �� � � ������� � �� ��� � ���� �� � � ����� � $���� ��� ��� ������ � ��� ������� � � ����� � �� �� ������ � ��� � � � �� �� ���#��� ����� ������ �� ������ ���� � �� �� � � � ����� � � � � �� � �� �������� �� �� � �� ���� � � � ������ �� ���� � � ����� ��� �� ��� �������� �� ��� ��� ����� �� ���� ���� ���� � ��� ���� � �� ���� ���� �� ����� �� ��� � � �� � �� ���� �� ������ ���� ��� ���� ����� �� � ���� ��� ���� � ����� � �� ����� �� ���� �� ���� ������� � ����� �� �� � ����� �� "%& ' ��� � �� �� ��� ��� ���� ()��� � *�+,� -� � ������� � �� ����� �� ����� �� ��� � �� ��� � � �!����� �� � � ��� �� � ��� �� ���� �� ��� � ��� �� ��� � � �� � �� � �� � ��� .�� � � ��� � �� � ����� � ����� �� � ��� � � � ��# ����� ���� � .�� � � ��� �� �� �� ���� �� � ����� ���� �� � ��� ���� � #� �� ��� � ��� ��� �� ��� ����� �� � ����� � ������ � ��� ���� �� � � �� ��� .�� � � ���� �� ��� ��� ���� � �� ��� � ��� � � ����� �� ��/��� �� ���� ��� � ���� �� � ����� ���� �� � � ����� ���� �� � ��� � ��� -����� �� �� ��� � ����� � ���� ��� ������� � ��� ���� ��� �� � �� ��� � �� �� �!���� �� ��� � �� ���� ��� ��� ��� ��� � ��� � �������� ����� ��� ���� � ��� � � ���� (� ���� � � ��, ��� �� � �� � �� ��������� ��� �� �� ��� �� ��� � ���� �� � ���� � �� �� �� � �� ��� �� ��� � �� � � ��� � ��� ���� �� ��� � ��� � ���� ��� ��� �� �� ��� � ��� ��� ����� ���� ��� �� �� ��� �� ��� �� �!���� �� ��� � From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. Jeremy W Dale and Malcom von Schantz Copyright 2002 John Wiley & Sons, Ltd. ISBNs: 0-471-49782-7 (HB); 0-471-49783-5 (PB) Mixed bacterial culture Bacterial cloning Gene cloning Mixture of DNA fragments Transformed bacterial culture Each colony is derived from a single cell and contains a different DNA fragment Each clone carries a different piece of DNA Each colony is derived from a single cell Bacterial clones Transformation ������ ��� ���� � �� �� � ��� � � ������� �� ���� ������� ��� �������� �� ��� ��������� $��� � ��� � � ����� ���� � �� ��� � #� �� "%& �� � ��� #���� ������ ����� �� 0����� � �� � ����� � �� �� �� ��/����� �� ������ � � ��� �� � � � ����� ���� � "%& ���� ���� ��� ���� � �� �� � � � ��� "%& ���� ��� �� ����� ��� �� ��� �� � ���� ���� �� ����� �������� ���� (���� � �� � ��� ����, ��� �� � �� ��� ��� � ��� � ������ � ���� �� ��� ���� �������� �� � � ������1�� �� ��1��� ������ ��� �� � ���� �� � �� �� ����� ����� )� �� � �� �� � ��� � ��� � ��� � ��� ���� �� ���� 2� � � ���� �� �� � � ��� "%& �� ���� �� �� �� ����� ���� �� � � � �� ���� �� ����� �� � � ���� � ��� � � $��� �� ��� � ����� � ��������� ����� � � �� ��� ���� ��� ����� �� "%& �� � � ����� ��� ������������� �� ��� �� ��� ���� �� � ���� ���� �� ��� ��� � ����� ���� ���� ��� ���� ������ � (�� �� ��� 3 �� ���� �������� ���� ���� �� ����� � ��������� �� � � �� � ������ � ��� � � ��� � � #���� ������� ������� � �� �� �� �� ��, �� "%& �� � �� � �� �� ����� � �� � ��� ���� ��� ��� ����� � � ������� ��� ������� � ������ ��� � ���� �� ����� ��� �� � � ()��� � *�4,� �� ������� �� �������� ���� �� ����� ��� �� ��� � ��� � � ����� � �� � �� ��� ���� �� ������ � �� �� � ����� � � � �� � �� ���� ���� �� ���� �� ��� ����� �� ������� �� "%&� & � ��� ��� ��#� � � �� � � ����� �� �� � ����� ���� � �� �� � ��������� � �������� ��� � 45 ������ � �� �� ��������� � �� ��� �� ����� ��� DNA to be cloned Vector plasmid Recombinant plasmid Transformation Bacterial replication Bacterial replication Ligation Bacterial cell Bacterial culture containing a large number of cells; overnight growth of E. coli will produce about 109 cells/ml ������ ��� - �� ������� �� ���� ������� � ���� ���� � � �� �� � � �� ����� �� ���� � ��� *5 ���� ���� (+5 ��� ,� ��� � ���� �� +� +56 (��� ���� �� �������� � + 555 555 555, �� ���� �� �� ��� ����� � � � �� � ��� 7 �� ��� �� ��� � ���� � �� ���� �� ��� �������� �� "%& ��������� � �� ���� � �� � ������ �� � � �� ����� �� ����� �� ��� ������ "%&� �� ��� � ��������� � � ���� ��� ��� �������� ������������� ��� ������ ��� � ��� � � � �� �� ��� �� ��� ���� � �� ��� ������������ ( �� � �� �� � ���� ������� � ��� ��� ��� �� � ������� �� � �� �� ��� ��������� �� ��� ���� � ��������� ����� ��� �� ������� � ��� � �� � ��� �, 2��� � � ��� ��� �������� ���� ���� ���� +� +56 � ��� � �� �� �� ����� �� 0����� � �� �� � #� � �� ���� �� �� �� �� � � � ������� ��������� � � ���� ���� � ���� �� ����� � � ��� �� � �� � ���� �� �� ��� � � �� � � ����������� � ����� ��������� !� ������ �� ��� ������ "%&� �� �� � � ��� ��� � ��� � �� �� �������� �� ��� ���������� �� ��� � ��� ������ ����� �� � � � � ��� �� � � �� ����� �� ��� � ����� �� �� � ����� �� � �� �� � � ��� ��� � ����� �� �� �!�� � ������ �� /������ ����� �� "%& �� ��� ����� � ���� � � �� ������� ��� ����� �� � ����� � ���� ������ �� ��� /������ �� � #� �� ��� �� #�� �� ��� ����������� �� ���� ������� ���������� � ��� �� ���� � �� ��1��� �� � ����� � � ��� ��� � � ����� �� �� � � ��� � � �� �� � �� ��1��� ������ � ��������� � ��� ��������� ����� � � # ��� �� '��� �� �� � �#���� �� "%& �������� � � ��� � ��� � �� ��� ������� ����� � ��� �� /��� ������� ��� � ����� �� "%& �� � � ���� ��� �� ��� � � ()��� � *�*,� �� � ��1��� � �� ��� � � �� ����� ���� � � ���� �� � ���� �� �� � ��� �� �� �� ��� 8� ���� ����� �� "%& � ���� �� � ��� ���� �� ��� (�� ���� �������� �� �� ���, �� ���� � �� �� ��� ������ ���� ��� � ��� � � �� � �� � � � �� � ���� � ��� � 9��� ��� ��� � ��� � ��� �� � ��������� � ���� � �� � ��� ���� �� � ��� � � ���� ��� ��� � #� �� ��� �� ���� 0����� � �� � ��� �� ��� ����� �� � � �� ���� ������ �� � � � ��� �� ������� ���������� �� � � ����� �� �� ��� ��� � � �� ��� � ��� � � ����� � ���� � �� �� Vector plasmid Linearized plasmid Restriction site Recombinant plasmid Ligation Restriction sites Cut with restriction endonuclease ������ ��� ������� �� /������ "%& �� ��� �� ����� ��� ���� ����� �� � ���������� �� ���� ��� ���� ����� � �� ������� ��� �� ��� ���� �� ��� �� � �� �� �� � ������� � �� �� � ������ ��� ��� ��� ��� ��� �� ��� ���� �� ����� �� "%& � ���� ��� ������� ���� �� � �� � �� �� ������ 7��� � �� �� �� ������ ����� � � �� � ��#� � ��� ��� ���� �� ���� �� �� ���� � �� ���� � ��� ���� �� � ��� � �#�� ��� � ����� �� ��������� "%& ��������� 2� � �� �� � � # ��� �������� ���� � ��� � ����� � ����� �� � � �� ������� ��� (� ��� � � ������ ��������� � , � ���� ������� ��� (�� ���� ��� � �� ���,� -�� ������ �� �� ��� �� ���� ��� �� �� � � �� ����� �� ����� ��� � ����� �� "%& ���� �� � � � � �� ��� ��� �� ������ ������� � ������ ��� ���� � �� ���� ��� ������� � ����� �� � � �� ��� �!�� �� ����� �� ���� � � �� �� ���� ��� � ����� � �� �1�� ��� ��� � � � � �� � ����� �� � ��� � ���� �� ��� �� ����� ��� ����� �� "%& �� � � � ���� �� �1� �� � ���� � ���� �� �� ���� ��� �� � �������� )� ��� ���� �� � ��� ���� � �� � � �� �� ��� ������� "%& � ����� � ��� �� ��� � ����� �� ���� ������� � �� � �� � ����� ����� � �� � ���� ���� � � �� ������� ������� ����� �� "%&� : ��� �� � ��������� �� �� �� ��� "%& � ����� � �� � #� ��� �������� ����� � �� � � "%& ��� � �� �� � � ��� � ����� ���� ��� � �� �� ����� � ;��� ��� ���� ��������� � ���� ��� � ����� ���� �� �� � ��� ���� � �� ����� ��������� �� ��� � �� �� � ����� ����� � �� � �� ����� �� ����� ��� ������� �� ����� �������� � ����� � #���� ���� ������ (� �� � ������� ��� ��� ��� ������ � �� ���� � �� ���� ���� �� � �� ���� ��� � �� � ���� �� �� � ���� �� �� ��� <,� 2��� �� � � �� � � ��� � � ����� � ���� ��� ��� �� � �� ���� ���� ���� � #� �� ��� ��������� 2��� �� ���� �� �� ��� � � �� ��� ����� �� � �� ������� ����� � � � �� ����� � � �� ��� ����� ���� ���� �� � �� ����� �� � ��� � �� �� ����� � � ��� �� ������� �� �� ���� ���� ���� �� ��� �� ����� �� "%& � �� �� � ���� ����� �� $� �� �� � �� ����� � �� ���� �� (� ������� � � ��� �� ������� , �� ����� ��� "%& � ����� � �� � �� � �� ����� �� � ��� � � ������� � �� �� ����� � �� ��� � ����� ���� ()��� � *�=,� �� � �������� �� � ������ �� ���� ��� �� � ��� ��� �� �� �� ��� < �� >� ��� � �� ���� �� �� � � ���� �� ����� ��� ����� � ���� �� � ����� �� ��� � � ���� ��� � �� �� ��� � ������ ������� ��� �� � 2� ���� � �� �� � ������� ����� �� ��� ��� � �� ������ � �������� � "%& � ����� � ��� ����� ���������� �� � ����� �� � �� �� �������� � � ��� � � ������� � �� ��� ����� � ' �� /� � ���# ���� � �� �� ��� 7 �� �������� � � ��� � � ������ ���� � � ����� ��� ����� �� "%& � �� �� � ���� � ������� ����� �� � �� �� � � �������� ����� � ��� � � ������ � �� ��� ���� �� � �� � ���� � ��� ��� �� ������ �� ������ ����� � ��� � 2� /� � � �� �� ���# ��� ��� ��� ���� ���� � Vector plasmid Mixture of recombinant plasmids n Each colony carries a different insert fragment Mixture of DNA fragments ������ ��� ? #��� ������� ��� � ���� ������ �� ������ �� �� ���� � � � ������� 0����� � �� ���� � �� ��� � ����� �� #������ ����� �� ��� � ���� �� @������� �� � ��� � � ������� ��� ��� ��� � � ��� ���� �� � �� � ��� �� � ��� ��� �� �� � ����� �� �� ��� >� ��� ��� �������� � �� �� �� � ���� ��� ������ � � �� ��� �� ����� �� � � �� ����� �� ������ �� ��� ���������� �� � ��������� �� ��� !"�����#���� �� ������� � ���� "%& � ����� � �� ���� ��� ������� ���� ���� ������� ��� ��� � �� ������� ���� �� �� ������ �� ��� ��� � �� ���� �� ��� �� � #���� ���������� �� � �� �� � ��� ( �� �� ��� ����, ���������� 2��� ��� ������� � ������ �� ���� � ��� ��� � ���� ���� ��� � �$ ��� �� ����� ��� �� ��� � ���� � ������� � ���� � ����� ���� �� ���� ��� (��� ��� � �� � �� �� ������,� 2� � � �����1� ��� ���������� �� �������� ������� ����� �� "%& �� ������� ����� � �� � ������� ������� "%& �!����� (��� �� ��,� �� ������ ��� � ������ � ��� ���� ��� ��� �� �� ����� � �� � ����� � 2��� ��� ����� � � ������ ����� ��� � ��� ���� ���� �� ��� ���1� �� �� �� ��� "%& � ����� ()��� � *�8,� ����� �� ��� � �� �������� ��� ������� "%& � ����� �� � �� � ��� )� � ������ ���� ��� �� ��� � ������ � ��� ���� ��� ���1� �� "%& � �� �� ������ �� � � �� ��� �� � ������� ���� � � � �� ��� �� � � ���� ����� �� � ������ �� � �� �� ����� � � �� ��� ��� � ������� � ��������� ����� �� �� ������ ����� �� ��� � �� � ��� !���� ����� �� � ' �� � ���� ��� ���1� ��� � ��� �� ��� ������� �� � � �� ��� 0����� � �� � � � �� � � �� � � �� � �� ������ ���� ���� �� �� ����� ����� �� ���� �� � ��� ������ � �� � ��� "%& �� ���� �� � ����� �� ��� ���� ��� �� � ����� � ��� � �� "%& ��� �� ��� ���� �� �� �� ����� �� � ������� �� ��� ������� �� ��� � ���� � �� �� ()��� � *�3,� ����� � � ���� �� ��� ���1�� �� ��� � ������ � ��� �� �� ��� ��������� ����� �� ����� �� �� ��� �!�� �� ������� 0�� ���1 ����� � ��� � ������ "%& � :%& � ��� � � � ���� � �� � � �� � �� ���� ������!�� �� � �� ���� �������� �� �� �!���� �� ��� � Denaturation Annealing Labelled probe Denaturation Hybridization with probe Probe detects specific fragment Denaturation and re-annealing double-stranded DNA Hybridization of DNA with a labelled probe ������ �� 0�� ���1 ���� �� ���� � ��� ��� �������� ���� �% Collection of recombinant bacteria Comparison with plate identifies the required colonyColonies replicated onto a filter and lysed to create a pattern of DNA spots Filter hybridized with a labelled probe ������ ��$ ������ ��� ���1 ���� �� ���"&��� � ��� '������ �� ������!�� #���� ��� ������ � �� �� � ����� (A�:, ����� � ����� � ��� � ���� �� ���� ������� �� ���� ��� �� � � �� ��� ����� � ��� !� ������ �� ������� "%& �!����� � A�: �!�� � ��� � � � � �� � ��� �� � ���� ��� � �� ��� � ����� ��� �� ��� �!�� �� ����� �� "%& ()��� � *�<,� "%& ������ � ����� ���� ���� ����� �1� ��� "%& � �� � ���� � �� � �� � ��� � "�� �� ���� �� ��� � ����� � �� �� ��� ���� �� ��� � ��� � ���� ���� ����� ���� �� ����� � � :��� ��� ����� �� ��� �� � ����� ��� ���� �� �������� ���� ���� � � �� � ��������� � ������� ���� �� ��� "%& �!����� ������� ��� ��� � ��� � ���� ��� ����� �� � ����� �������� �� � �� ������ � �� � ��� � 45 ����� ��� � ���� (���� ���� ���, �� �( ��� �� ����� ��� DNA template Add primers Denature and re-anneal Primer 2 Primer 1 DNA synthesis Repeat cycle n times Amplified product (2n) ������ ��% A����� � �� �� � ����� ������������ ��� � � �� ��� ����� �� � ������ �� �� ��� ��� ������� ���� �� ������� ����� �� ��� "%&� �� ��� � ����� � � ���� �� ������ �� ������ �� ������ � �� �� � ������ �� ��� �� ��� � �� ����� ���� � � ��� � ���� �� � ����� �� �� ��� 6� �� ��� �� ��� �� � �� � ������ � ��� ��� ���� �� ��� � ����� � ������ � �� �� ���� �������� �� � � ����� � � �� ��� �� ��� � �� ��� � ���� � ����� � � �� � ���� �� � ����� �� �� �!���� �� ��� � ��� ������� �� �� �� �� ����� �) � �������� � � ��� ����� � � � ������� ����� ��� ����� � �� �� ��� � �� �� �� �� �� � � ��� ����� ��� � � � �� � ��� � �� ���� ������� � �� ���� � � �� � ������� ��� ��� � � � � � �� �� ��� ���� �� � ��� ���� �� � ����� �� �� �� ������� �� �� � ���� �������� � � ������ ���� ��� ������ ����� � ����� � ������ ���� �� � ���� ���� ���� � � ��������� ���� �� ��� ��� ��� !������ � ��� �������� �������� ������� � ��������� �� ����� ���� � � � � �� �� ���� " � � �� � ������ �� ���� �� #$� ���� $�� ��� %� � ����� �&��� � �������� ���� $�� ��� '� ���� ��� �������� ��� �� ���� ������ (� ���� ��� ��� �� ������ ��� � ��� �� �� ������� ��� � �� � �� ��� ��� ���� � � �������� �� ����) �� ������ ������� ��� �* � � ������� �� ��������� ������ � � ���� ��� � � ����� � ��� ��� �� ������ ���� � �� �� ��� ����� ����� � � ����� � � � ����� ���� ��� ����� ��� ���� �������� ���� � � � �������� ������� ��� � ���� ���� � ������ � ����� �������� �� � �� �� "������ �� ��� ��� �������� ��������� ���� � �� �� � ������� � ��������� � ������ ��� ����� ����� � �� ��� �� ��� � �� �� ����� �� � ��� �� ��� �� ��� �� � ���� �� �� ������) ������ �� � � � �� � � ��� ������ ��� �� ����� ����� ��� � � �� � � ���) �&� � ���� ��� �� ��� ��� ����� ��� �� ���� � +������� ������ ��� �������� �� �� �� ������� �������� � �� &�� ����� ��� � � ��� � �� � ���� ��� � �� ��&���� ������ �� ��� ���� �������� ��� ����� ���� ��� � �� ���� � ������� ����� � � ������ ��� ������ � ��� ��������� ���� ���� �� ��� ��� � ��� � ��� ���� �� �� ,�������� ����� ���� ����� ���� ���� � �� �� ��� ��� �� ��� ���� � ������ ��� �� ������� � ���� �� ������� ��� � ����� �� ����� �������� ��� ��&��� ��������� ������ �� ��� ����� �� ����� � � ��� ���� �� �� � �������� �� ��������� ���� ������ ���� �� � �-����� � ���� .��� �� � �������� ���� �� /�/ �� ��� ���� From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. Jeremy W Dale and Malcom von Schantz Copyright 2002 John Wiley & Sons, Ltd. ISBNs: 0-471-49782-7 (HB); 0-471-49783-5 (PB) ��� ������ .��� ���������� ������� ���� �� �� ���� ��������&�� ��� ���� �������� �� �������� ���� �� � ��� �� ��� �������� ������ ���� � �� �������� ��� � ���� � ��� ��� ����� ��� �������� ���� � ������&� ��� �������� �� � �� #���� �� ������ ����� ���� ���� ����� ���� ��� �������� �� � �� �� �� �������� �� ��!���� ����������� ���������� ������ ���������� � ��&������ ����� ������ ����� ������ ���� � ���� ����� ��� ������� �� ���� �� � �� ������ ��������� ���� � ��� ��������� ����� �������� � ���� ����� �� ����� �������� �� ��� �������� ���� � ������� � ���� �������� �� ��� ������������� � � ����� ����� ���� � � ���� ������� 0 � � � ��� � ���� � � ��� ��� � ����� �� � � �� ���� ��) ������ � �� ���� ��� �� �� ����� � ��� ���� ���� ������� ������ �� � �� �������) ���� � � ��� � � ��� ���� (� ��������� ��� ��������� ��� � � �� ����� �� ������� �������� �� ��� ������ ����� ���� �� �� ��� ��� ������ ���������� +���� �� �� ��������� � ����� ���� ����� ����� ������� ��� � � ��� ��� � �� ������ ����� � � ��� �� ��� ��������� ���� ��� ����� �� � � ���� ���� ��� ������ � �) ���� �� $�� ��� 12�� ,�������� ����� � � ����� ��� ��� ��� ������ �� ����� ������ �������� ����� �� ���� �� ����� � � ��� ��� ��� ���� ��� �� ��� � �� ��� �� � �� ����� ��� ����� ������� ��� �� � ����� ���� � � ������ ����� � ���� ������� � ��� ��� � ��� �� � � ��� �� ����� � �� ������ ������� �� ��������� ���� ��� �������� �������� /���� ����� �� � ���� ����)������ ��&��� �� �� ���� � ������ ���� �� �� ���� � ������ � � ����� �������� ������� ���� � �� �������� ���� � � �� ��� ��� �� �� ������� ��� ��&��� ��� �� ���� ��� ��� � ��� �� � ��� �� ����� �� ��� � �� ���� ���� ����� �� ��!����� ����� ���� �� ��� ����� ��������� 3 ����� �� �� � � ������ � ��� �����) ���� ����� ��� ���� �� �����)���� ��� ���������� #� ���� � ��������� � ��� �� ��� �� �� ������ � ���� � � �� ����� ��&��� ���� �� � ������� 4� ����� ���������� ��� � ��� �� ��������� �� �������� ������� ��� �������) �� � � � � ��� 3 ����� �� � �� � � � �� ���� ��� ����� ������ ������� ��� � ��������� � �� ���� ����� � � � � ������ �� �� � ������� ��� � ������) ���� ���� �� ��� �� ������ ��� ��� �����!���� ��� � �� ������� ��� �� ����� ��� ������������� ������� � ��� ��� � � ����� �� ����������� �� ����� �� ��� ���� � ������ � ������ � ��&���� ���� ���� ���� � ������� ��� � �� ���� �� ���� � ����� ���� ���� ��������� ���� �����!���� � �� ���� �� ��� ��� � ��� ������� ��� �� � �� ���������� � � � ������ � ��� �� ����� Aqueous layer (DNA and RNA) Phenol layer Protein precipitate Neutral pH Aqueous layer (RNA) Phenol layer (DNA) Protein precipitate Acidic pH � ���� ��� #��� � �������� � ��������� �� ����� ���� ���!������ �� � �� ��� � ��� ���� � ����� �� �� �������� � ���� ��!����� ��� � � ��������� � ������� � ��� � �� ��� � ) � ��� #��� � �� ��� � � �� ��� ��������� ���������� ���� ����� �� � � � ���� ��� �� ������ � ������ ���� � � � � �� ���� �������� +��� ��� ������� �� ��� � ���� ������� ��� � ����� ���� �� ������� �� ���� ����� �� ��� ����� ���� �"����� 5�1�� (� � � ��� ����� ��� � ���� ��� ���� �!��������� ���� � ������� � �������� ������ ��� �� � ������ ��� ����� ��� ������� ��� � ���� �� ���� ���� ������ �� ��� �!�� �� ������ 6� ��� ���� ��� �� � � ����� �� ��� �������� � ���� ��� �� ��� � ��� ���� ������ � ��� ��� ������ ���� ��� ���� � � � ��� ��� ��� �� � ��� �!�� �� ����� #��� � �� ��������� ��� �� � �!��������� � ���� ����� � ��� ��� � �� ��� �� ������ ���� � ��� ��� � � ����� � � ��� ��� #��� � �������� � �� ��� ������ �� �����!���� ������ � ���� ����� � ���� �� �� ��������� � ������ ���� ��� ������ � �� ��&��� ���� ���� ��� �� ��� �� � ��� ��� � ��� ���� ��� � ��� �7 ��� � �� ������ � ��� �� ���� ��� � �� � �� �� ��� ��� �� � ���� ����� ������� ��� ��� � " �� ���� ��� � �������� � � � ���� ���� � � ����)���� ��� �� � � �� ������� ��� ���� 3 ����� �� ���� � ����� �� � �� ����� ���� � � ���� �� � �� �� �������� �� �� ���� � ����� ������ � ��� � �� ��� � � ��� #��� � ��
Compartilhar