trabalho de CROMATOGRAFIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO 
 
 
 
 
LORENA CAROLINA SANTANA DE ARAÚJO 
 
 
 
 
TRABALHO DE CROMATOGRAFIA 
 
 
 
 
 
 
RECIFE 
2017 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO 
 
 
 
 
LORENA CAROLINA SANTANA DE ARAÚJO 
 
 
 
 
TRABALHO DE CROMATOGRAFIA 
 
 
Trabalho apresentado à disciplina de Cromatografia Líquida Clássica 
e de Alta Eficiência como parte dos requisitos para obtenção de nota. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RECIFE 
2017 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 03 
2. BREVE HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA......................................... 04 
3. 
4. 
5. 
6. 
6.1 
6.2 
6.3 
7. 
7.1 
8. 
 
8.1 
8.1.1 
8.1.2 
8.1.3 
8.1.4 
8.1.5 
8.2 
8.3 
8.4 
8.4.1 
8.4.2 
8.4.3 
8.4.4 
8.4.5 
8.5 
8.5.1 
8.5.2 
CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS................. 
CROMATOGRAMA....................................................................................... 
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO DA CROMATOGRAFIA................... 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA....................................... 
Adsorventes....................................................................................................... 
Pontos importantes a serem considerados.......................................................... 
Revelação........................................................................................................... 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA-LÍQUIDA CLÁSSICA.................... 
Alguns termos técnicos...................................................................................... 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA................................................................................................... 
Instrumentação................................................................................................... 
Reservatório da fase móvel................................................................................ 
Sistema de bombeamento................................................................................... 
Injetor manual.................................................................................................... 
Injetor automático.............................................................................................. 
Colunas para a CLAE......................................................................................... 
Características da fase móvel em CLAE............................................................. 
Características da fase estacionária em CLAE.................................................... 
TÉCNICAS DA CLAE.................................................................................... 
Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção................................................... 
Cromatografia líquido-líquido ou por partição................................................... 
Cromatografia líquida com fase ligada............................................................... 
Cromatografia líquida por troca iônica............................................................... 
Cromatografia líquida por exclusão................................................................... 
DETECTORES USADOS EM CLAE............................................................ 
Detectores por absorvância no ultravioleta e no visível...................................... 
Detectores por fluorescência.............................................................................. 
05 
06 
07 
08 
08 
09 
09 
10 
11 
 
 12 
 12 
 12 
 13 
 13 
 13 
 14 
 15 
 15 
 17 
 17 
 18 
 19 
 19 
 19 
 20 
 21 
 22 
 
 
8.5.3 
8.5.4 
8.5.5 
8.5.6 
8.5.7 
8.5.8 
8.6 
 
Detectores por índice de refração....................................................................... 
Detectores eletroquímicos.................................................................................. 
Detectores por absorbância no infravermelho.................................................... 
Detectores de radioatividade.............................................................................. 
Detectores de espectrometria de massas............................................................. 
Outros Detectores............................................................................................... 
REGISTRO DE DADOS................................................................................. 
REFERÊNCIAS............................................................................................... 
 
 
 
 
 
23 
24 
24 
24 
25 
25 
25 
26 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
Dentre os métodos de análise modernos, a cromatografia tem se destacado, em virtude 
da sua facilidade em realizar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, 
por si mesma ou juntamente com outras técnicas instrumentais de análise, como por exemplo, 
a espectrofotometria ou a espectrometria de massas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
A cromatografia é um método físico-químico de separação, que está fundamentado na 
migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes 
interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE). A fase 
estacionária é composta de um material escolhido para reter de forma diferenciada os 
componentes da amostra que se pretende separar. A fase móvel é o material que se desloca pela 
fase estacionária, arrastando os componentes da amostra (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). 
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação 
com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as 
substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura (DEGANI; CASS; 
VIEIRA, 1998). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
2 BREVE HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA 
 
Em 1906, o botânico russo Mikhael Tswett utilizou os termos “cromatografia” 
“cromatograma” e “método cromatográfico” pela primeira vez, ao descrever suas experiências 
na separação dos componentes de extratos de folhas e gema do ovo. O nome é derivado das 
palavras gregas Chrom (cor) e graphe (escrever). O processo não é totalmente dependente da 
cor, mas em alguns casos pode facilitar a identificação dos constituintes separados (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
A época moderna da cromatografia teve início em 1930, quando Kuhn e Lederer, 
aperfeiçoaram as experiências do botânico russo, separando e identificando as xantofilas da 
gema do ovo, utilizando uma coluna preenchida com carbonato de cálcio pulverizado e éter de 
petróleo como fase móvel (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
No ano de 1941, Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partição (líquido-
líquido), que fundamentou o surgimento da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
e da Cromatografia Gasosa (CG). Eles receberam em 1952 prêmio Nobel de química pelo 
método desenvolvido (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Ainda em 1941, Hesse e colaboradores descreveram pela primeira vez a cromatografia 
gás-sólido, a partir da separação de dois ácidos graxos sob vapor de 100 °C, arrastando sobre asílica com dióxido de carbono (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Martin e James relataram a cromatografia gás líquido em 1952. Anos depois, em 1958, 
Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar, desenvolveram o detector de 
ionização em chama. Neste mesmo ano, Golay introduziu as colunas capilares em análises por 
cromatografia de alta eficiência (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Outros desenvolvimentos na década de 60, por Kaar e colaboradores, Jentoft e Gouw, 
Huber e Hulsman, e outros, foram o aperfeiçoamento dos sistemas de bombeamento e detecção 
da CLAE, comprovando que o uso destes equipamentos, operado com FM líquida sob pressão 
e com métodos de detecção sensíveis, possibilita análises rápidas, em comparação as de 
cromatografia gasosa, com resultados bastante satisfatórios (COLLINS; BRAGA; BONATO, 
1997). 
Todos estes avanços ampliaram o poder analítico da cromatografia, tornando-a o 
método analítico de separação e determinação mais usado do mundo. 
 
 
5 
 
3 CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 
 
Muitos critérios são utilizados para classificar as diferentes modalidades da 
cromatografia, sendo os mais comuns relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de 
separação envolvido, e aos diferentes tipos de fases usadas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 
1997). 
Quanto a forma física do sistema de cromatografia, a fase estacionária pode ser 
depositada em uma superfície planar (cromatografia planar) ou depositada em um tubo 
cilíndrico (cromatografia em coluna). Nesta útima, conforme o diâmetro interno do tubo, temos 
as colunas preparativas (6-50 mm), analíticas (2-6 mm), com microdiâmetro (<2 mm) e 
capilares (< 1 mm) (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Quanto ao estado físico da fase móvel, distingue-se a cromatografia gasosa, onde a fase 
móvel é um gás, a cromatografia líquida, onde a fase móvel é um líquido, e a cromatografia 
supercrítica, onde se usa como fase móvel um vapor pressurizado, em temperatura acima da 
sua temperatura crítica (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
A cromatografia líquida em coluna se divide em dois grupos: a cromatografia líquida 
clássica, realizada em colunas de vidro, onde a fase móvel é geralmente deslocada sobre a fase 
estacionária pela força da gravidade; e a cromatografia líquida de alta eficiência, feita em 
colunas metálicas, onde a fase móvel é deslocada por pressões elevadas, obtidas com auxílio de 
uma bomba de alta pressão (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
O estado físico da fase estacionária pode ser líquido ou sólido. O líquido pode estar 
espalhado sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre este. A imobilização pode envolver 
ligações químicas entre o líquido e o suporte ou apenas entre as cadeias do próprio líquido. 
Graças às vantagens de volatilidade e solubilidade reduzidas atribuídas às fases estacionárias 
contendo a parte ativa na separação quimicamente imobilizada sobre o suporte, é comum 
considerar uma categoria distinta, isto é, a cromatografia com fase ligada (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
Há ainda, outra classificação baseada na polaridade das fases. Na cromatografia gasosa, 
a fase móvel é inerte e a separação ocorre devido às interações das moléculas da amostra com 
a fase estacionária, enquanto na cromatografia líquida, a polaridade de ambas as fases é 
relevante. A cromatografia líquida com fase normal acontece quando a fase estacionária é mais 
polar do que a fase móvel, e a cromatografia de fase reversa é quando a fase móvel é mais polar 
do que a fase estacionária (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
6 
 
A figura 1 mostra as classificações da cromatografia, segundo as formas físicas mais 
encontradas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Classificação da cromatografia pelas formas físicas (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
 
4 CROMATOGRAMA 
 
O cromatograma é uma forma gráfica de demonstração dos resultados da separação 
cromatográfica (figura 2). Neste gráfico, os sinais obtidos nos detectores são apresentados em 
forma de picos que podem ser relacionados a diferentes substâncias. Também é mostrado o 
tempo de retenção, tempo que o detector registra o maior pico relacionado à presença de um 
composto e a área e largura da base dos picos, relacionadas à concentração das espécies e sua 
afinidade com as fases (NETO, 2015). 
 
Figura 2: O cromatograma (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
 
 
 
7 
 
5 MECANISMOS DE SEPARAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 
 
A cromatografia é dividida em categorias com base no mecanismo de separação, 
podendo este ser por processos físicos, químicos ou mecânicos. 
A cromatografia de adsorção utiliza uma fase estacionária sólida e uma fase móvel 
liquida ou gasosa. O soluto é adsorvido na superfície da partícula sólida. O equilíbrio entre a 
fase estacionária e a fase móvel justifica a separação dos diferentes solutos (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
Na cromatografia de absorção a fase estacionária é um líquido. O processo ocorre por 
absorção ou partição e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na 
fase estacionária. A volta dos componentes a fase móvel depende de sua volatilidade (fase 
móvel gasosa) ou de sua solubilidade (fase móvel líquida) (COLLINS; BRAGA; BONATO, 
1997). 
No processo de troca iônica, a fase estacionária é constituída por um suporte onde são 
adicionados grupos ionizáveis: grupos carregados positivamente, retendo ânions e grupos 
carregados negativamente retendo cátions. A fase móvel é uma solução iônica com 
propriedades tamponantes, compatível com o tipo de trocador utilizado (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
Na cromatografia por bioafinidade, grupos com especificidade biológica, quimicamente 
ligados ao suporte (podem ser antígenos, enzimas ou lecitinas) retiram da mistura somente os 
componentes complementares, os anticorpos, proteínas ou açúcares, respectivamente. A eluição 
dos componentes retidos pode ocorrer com a modificação das propriedades da fase móvel, por 
métodos de deslocamento usando outro grupo fortemente atraído, por exemplo (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
A cromatografia por exclusão é uma técnica que separa as moléculas pelo tamanho, com 
os maiores solutos passando por ela com maior velocidade. A fase móvel líquida ou gasosa 
passa pelo gel poroso. Os poros são pequenos o suficiente para excluírem as moléculas grandes 
do soluto, mas não as pequenas. O fluxo de moléculas grandes passa sem entrar pelos poros. 
As moléculas pequenas levam mais tempo para passar pela coluna, porque elas entram no gel 
e, portanto, devem passar por um volume maior antes de sair da coluna (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
 
 
8 
 
6 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) 
 
Consiste na separação dos componentes de uma mistura por meio da migração 
diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. Teve 
início em 1938, mas somente na década de 1960 começou a ser largamente utilizada. Algumas 
vantagens: fácil compreensão e execução, separações rápidas, baixo custo (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
A cromatografia em camada delgada é uma cromatografia de adsorção. Adsorvente 
polar como a sílica ou alumina terá afinidade por substâncias polares. Portanto, substâncias 
apolares como hidrocarbonetos não terão afinidade pelo adsorvente. Dessa maneira, não serão 
retidas, deslocando-se com a fase móvel. Substâncias polares como substâncias aromáticas, que 
possuem oxigênio na molécula, serão retidas pela fase estacionária (adsorvente) polar, não se 
deslocando (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Aplicações: analítica ou preparativa, dependendo da espessura da camada de adsorvente 
e da quantidade de amostra a ser analisada.6.1 Adsorventes 
 
O mercado dispõe de uma grande variedade de adsorventes que podem ser adquiridos 
para a confecção de placas nos laboratórios, ou sob a forma de placas prontas, nas quais os 
adsorventes são espalhados em várias espessuras (para cromatografia analítica ou preparativa). 
Dentre os mais usados estão a sílica, a alumina, a celulose e a poliamida (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 2006). 
A sílica é um dos adsorventes mais usados. Apresenta caráter fracamente ácido, é 
utilizada na separação de compostos lipofílicos como ácidos graxos, terpenoides, esteroides, 
alcaloides, entre outros (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
A alumina é o mais usado depois da sílica. Tem caráter alcalino, mas existe no comércio 
na forma neutra ou ácida. É utilizada na separação de compostos lipofílicos, como alcaloides, 
hidrocarbonetos policíclicos, aminas e vitaminas lipossolúveis (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 2006). 
A celulose tem sido empregada como suporte da fase estacionária líquida em 
cromatografia de partição. Pode ser impregnada com alguns materiais tais como polietilimina, 
9 
 
carboximetil, dietilaminoetil, empregada para separar nucleotídeos, proteínas e ácidos 
nucleicos, substâncias fenólicas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
A utilização da poliamida vem crescendo, apesar de ser pouco aderente ao vidro. 
Empregada com maior frequência na separação de fenóis e ácidos carboxílicos (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 2006). 
 
6.2 Pontos importantes a serem observados 
 
As placas pré-fabricadas são mais uniformes e homogêneas do que as feitas no 
laboratório, melhorando a separação e tornando os valores de RF mais reprodutíveis. 
A colocação da amostra deve ser exatamente na linha de partida, para não ocorrem 
variações nos valores de RF. 
O solvente ou mistura de solventes usados como fase móvel devem ser escolhidos 
cuidadosamente, pois vai haver uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra 
pela superfície do adsorvente. Assim, deve-se considerar a natureza química das substâncias a 
serem separadas e a polaridade da fase móvel (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
As amostras devem ser dissolvidas em solventes bastante voláteis, que possam ser 
rapidamente eliminados após a aplicação, numa concentração que varie de 0,1 a 1%. A 
aplicação pode ser feita com pipeta automática ou tubos capilares de vidro (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 2006). 
 
6.3 Revelação 
 
Após o desenvolvimento dos cromatogramas, evapora-se o(s) solvente(s) e as placas são 
reveladas, a fim de tornar visível as substâncias incolores presentes na amostra. A visualização 
pode ser feita por meio de métodos físicos como a luz UV (substâncias fluorescentes). Esse 
método não é destrutível. Métodos químicos: substâncias são borrifadas sobre as placas e depois 
aquecidas a 100-120ºC (exemplo: vanilina-sulfúrica). Zonas coloridas ou fluorescentes podem 
aparecer durante o aquecimento. Manchas escuras são o resultado final da carbonização das 
substâncias orgânicas. Esse método é destrutível. Métodos biológicos: reações enzimáticas ou 
bacterianas, como por exemplo o teste de substâncias antifúngicas (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 2006). 
10 
 
A revelação com Iodo (I2) é reversível. A placa é colocada em uma cuba saturada com 
vapor de iodo. Após alguns minutos aparecem manchas marrons resultantes da formação de 
complexos com a maioria das substâncias orgânicas. Ácidos graxos poliinsaturados e ésteres 
podem dar reação irreversível (adição ou substituição) (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
 
7 CROMATOGRAFIA EM COLUNA-LÍQUIDA CLÁSSICA 
 
Esta técnica é bastante empregada com a finalidade de isolar produtos naturais e 
purificar produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e 
alumina, porém, estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase 
estacionária líquida. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases 
estacionárias líquidas por partição. Suportes quimicamente modificados também têm sido 
usados, sendo o processo de separação misto neste caso. Esses suportes são acondicionados em 
tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira 
em sua extremidade inferior (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
O empacotamento constitui uma etapa fundamental ao se utilizar essa técnica, pois ele, 
entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. Enquanto a alumina é empacotada em 
sua forma original, o empacotamento da sílica deve ser feito na forma de suspensão (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
Após o empacotamento, é conveniente passar uma certa quantidade do eluente (duas a 
três vezes o volume da coluna) a ser utilizado através da coluna antes da introdução da amostra. 
Esta é adicionada à coluna com o auxílio de uma pipeta no momento em que o nível do eluente 
esteja o mais próximo possível do adsorvente. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o 
eluente é então adicionado cuidadosa e continuamente. O volume das frações a serem recolhidas 
é função da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da separação (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
É possível visualizar a separação dos componentes de uma mistura observando o 
desenvolvimento de manchas diferentes na coluna, ou através da luz ultravioleta, sendo 
necessário o acompanhamento da separação dos componentes pela técnica de cromatografia em 
coluna delgada (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
 
 
11 
 
7.1 Alguns termos técnicos 
 
A seguir serão citadas algumas definições e termos mais gerais, comuns a todos os tipos 
de cromatografia (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997): 
 
Fluxo (F): vazão da FM, geralmente em mL/min. 
 
Tempo morto (tm): tempo necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. 
 
Volume morto (Vm): volume de FM necessário para preencher todos os interstícios e poros da 
FE, ou volume de FM necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. tm = 
Vm/F 
 
Tempo de retenção (tR): tempo necessário para eluir uma substância de um determinado 
sistema cromatográfico. 
 
Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma substância de um 
determinado sistema cromatográfico. tR = VR/F 
 
A resolução indica a qualidade da separação entre duas bandas cromatográficas. 
Rs = 2. (tr2 – tr1) 
 (w1+ w2) 
Fatores envolvidos na resolução cromatográfica: 
k’: Fator de capacidade ou de retenção. É a razão da distribuição do analito entre FE/FM. 
Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM. 
 
α: Fator de seletividade. É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos. Quanto maior, 
mais fácil a separação. 
 
N: Fator de eficiência. Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento 
da banda cromatográfica. Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário. 
 
 
12 
 
8 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) 
 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) representa uma das mais novas e 
mais importantes técnicas de separação, e tem sua aplicação considerada indispensável em 
muitos laboratórios. Neste método são utilizados instrumentos sofisticados, que podem ser 
completamente automatizados, e pequenas colunas, onde uma fase móvel líquida elui sobre a 
fase estacionária que está em seu interior, sendo esta formada de materiais especialmente 
preparados. Emprega-se alta pressão na separação dos componentes da amostra, sendo capaz 
de completar a análise em alguns minutos (COLLINS; GUIMARÃES; CECCHI, 1997). 
A CLAE apresenta diversas vantagens tais como a alta resolução, menor tempo de 
análise, resultados quantitativos, alta sensibilidadee versatilidade. Por outro lado, algumas 
limitações da técnica relacionam-se ao alto custo de instrumentação, alto custo de operação e 
manutenção, falta de detector universal sensível, pouco usada para análises qualitativas 
(COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.1 Instrumentação 
 
8.1.1 Reservatório da fase móvel 
 
O reservatório da fase móvel consiste em um frasco de vidro de 1L, com tampa 
perfurada para a passagem do tubo que conduzirá a FM até à bomba. As fases móveis polares 
têm tendência a dissolver oxigênio e outros gases. Se esses gases são liberados dentro do 
equipamento, formam bolhas e podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da 
coluna, além de gerar ruídos no cromatograma (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Por esse motivo, é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel. Em muitos 
equipamentos, o próprio reservatório está condicionado a efetuar a remoção, por exemplo, pela 
aplicação de vácuo no reservatório e agitação da fase móvel sob ação de ultrassom e/ou 
aquecimento. O problema da formação de bolhas tem sido reduzido pela adição de um filtro na 
saída do detector, o que restringe um pouco a vazão e produz uma pequena pressão na cela do 
detector, impedindo a formação de bolhas. Os solventes, incluindo a água, devem ser de grau 
CLAE, isto é, ultrapuros. É importante sempre purgar o sistema para evitar a ocorrência de 
bolhas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
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8.1.2 Sistema de bombeamento 
 
A bomba tem a função de transportar a fase móvel. Alguns requisitos desse sistema são: 
alta pressão e fluxo constante, vazões na faixa de 0,5 e 2 mL/min, componentes resistentes à 
corrosão. O sistema de eluição pode ser isocrático, onde a constituição do solvente permanece 
constante, ou gradiente, onde a composição do solvente é alterada (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
 
8.1.3 Injetor manual 
 
Para adicionar a amostra a ser analisada, usa-se um sistema de injeção que pode ser 
automática, o qual possibilita a inserção da amostra sem a interferência do analista, ou manual. 
Um modelo de válvula de injeção manual é a válvula de seis portas, comumente produzida em 
aço inoxidável, que possui duas posições (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
Na posição de carregar (Load), a amostra injetada com o auxílio de uma seringa 
preenche um tubo, que pode possuir diversas formas, denominado loop. Neste caso, não há uma 
ligação do Loop com a bomba e sim com o descarte para casos de injeção de uma quantidade 
excessiva de amostra, necessário para garantir a adição da quantidade exata de amostra e 
limpeza do tubo que fica com resíduos da amostra anterior, diminuindo o erro analítico 
(COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
Após a injeção da amostra, movimenta-se a válvula para a posição de injetar (Inject), na 
qual toda a amostra contida no Loop é arrastada para a coluna pela fase móvel, sendo possível 
pela ligação feita após a rotação da válvula do tubo com a bomba de alta pressão (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 2006). 
 
8.1.4 Injetor automático 
 
Este tipo de injetor é usado quando já se tem um método definido, permite a injeção de 
diferentes volumes de uma mesma solução padrão. Deve-se ter cuidado com a lavagem da 
agulha e programar sempre para lavá-la (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
 
 
 
14 
 
8.1.5 Colunas para a CLAE 
 
As pré-colunas são pequenas e de constituição similar à da coluna analítica, e devem ser 
utilizadas para reter possíveis materiais particulados, contaminantes do solvente e componentes 
da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária. O uso de pré-colunas é de grande 
importância para a vida útil da coluna analítica. A filtração da fase móvel e da amostra nem 
sempre são suficientes para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 2006). 
Dependendo das características da fase estacionária e da natureza da amostra, pode 
acontecer o que se chama de retenção irreversível, ou seja, a afinidade do contaminante pela 
coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros centímetros do 
empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminante pode provocar perda da eficiência, 
aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o contaminante não atingirá 
a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns são aumento de 
pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui a pré-coluna, que em média custa 10 
vezes menos que a coluna analítica (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
As colunas de fase estacionária têm distribuição média de diâmetro, o leito é mais 
uniforme, e possui menor tendência a formação de fases quimicamente modificáveis. A C18 é 
bastante utilizada, a sílica não é recomendada para uso em fase móvel aquosa, e a resina 
apresenta grande variedade de porosidade (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
As colunas de fases quimicamente modificadas são as mais utilizadas atualmente, 
principalmente a sílica com fase quimicamente modificada, pois a alta polaridade da sílica 
tornava difícil a separação de compostos polares (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
Em virtude dos grandes volumes de solventes que são bombeados através da coluna, 
eles devem ter um elevado grau de pureza para evitar a contaminação da coluna. Além disso, 
os solventes devem ser filtrados para retirar partículas sólidas que podem até entupir os tubos 
do sistema (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
Por fim, são necessários alguns cuidados com as colunas, incluindo equilibrar a coluna 
com a fase móvel, tratar a amostra, filtrar a amostra em membranas específicas, não permitir 
variações bruscas de pressão, temperatura ou choque mecânico, guardar com um solvente inerte 
e não volátil, após lavagem com solvente apropriado para esta finalidade (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 2006). 
 
15 
 
A figura 3 mostra um esquema de um cromatógrafo básico para CLAE. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Esquema de um cromatógrafo para CLAE (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.2 Características da fase móvel em CLAE 
 
A fase móvel deve apresentar alto grau de pureza ou fácil purificação, dissolver a 
amostra sem decompor seus componentes, não decompor ou dissolver a fase estacionária, ter 
baixa viscosidade, ser compatível com o tipo de detector, ter polaridade adequada para permitir 
a separação dos componentes da amostra (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
É fundamental que a amostra seja solúvel na fase móvel e não sofra decomposição, para 
que possa ser transportada através da coluna sem haja modificação dos seus componentes. 
Quando possível, o solvente da amostra é a própria fase móvel ou um de seus componentes, 
para que ela não precipite no injetor ou na coluna, provocando queda de resolução no processo 
de separação (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.3 Características da fase estacionária em CLAE 
 
Segundo Ciola (1998), considerando as suas propriedades físicas, os recheios para 
CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos: 
a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos; 
b) Partículas porosas ou peliculares; 
16 
 
c) Partículas esféricas ou irregulares; 
d) Partículas com diferentes diâmetros. 
Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses recheios 
podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento estável e colunas 
eficientes de partículas pequenas (CIOLA, 1998). 
Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de poliestireno 
entrecruzadas com divinilbenzeno. O semi-rígido tem sido usado para pressões até 350 bars. O 
maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações naCLAE por exclusão com fase 
móvel orgânica, contudo eles também são usados na troca iônica (CIOLA, 1998). 
Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por 
exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis em 
água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as pressões 
usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em algumas de suas 
propriedades e têm muitas outras em comum. Ambos podem ser introduzidos na coluna com 
certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas podem ser utilizadas em cromatografia 
líquido-sólido, dependendo da atividade da sua superfície ou pode ser recoberto com alguma 
fase líquida e obter-se uma coluna para CLAE com fase quimicamente ligada. Além destes tem-
se os materiais de recheio do tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca iônica 
(CIOLA, 1998). A Figura 4 apresenta esquematicamente algumas formas mais comuns de 
partículas para cromatografia de líquidos. 
 
Figura 4- Formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos (COLLINS & 
GUIMARÃES, 1988). 
 
Os adsorventes peliculares, com diâmetro de partícula entre 30 e 45 μm, apresentam 
eficiência, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes porosos (5 - 10 μm), mas 
têm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem diminuído notavelmente nos últimos anos 
(COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
Para obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que 
aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro 
17 
 
possível. As partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm menor custo 
(COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra ao 
penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa, mais lento 
o processo de difusão e, como consequência, mais lenta a transferência de massa entre a fase 
estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que aumenta o tamanho da partícula, 
aumenta também a profundidade dos poros e consequentemente a amostra demora mais tempo 
para sair destes poros profundos (COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
Ao mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para 
obter-se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem rapidamente, 
em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto resulta no 
alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a profundidade dos poros 
diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente, permitindo obter análises rápidas, sem 
perda na eficiência (COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
Estas explicações justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais porosos 
cujas partículas tem tamanho menor do que 30 μm, com exceção da troca iônica. Outros tipos 
de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas, não porosas, recobertas por 
uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo de material é denominado de 
película de camada porosa, de porosidade superficial ou de centro não poroso (COLLINS & 
GUIMARÃES, 1988). 
 
8.4 TÉCNICAS DA CLAE 
 
8.4.1 Cromatografia líquido-sólido ou por adsorção 
 
O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção, se 
baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os 
sítios ativos na superfície de um sólido, isto é, na fase estacionária (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma 
molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o adsorvente possui 
uma superfície polar, por exemplo sílica ou alumina, grupos apolares como hidrocarbonetos 
terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel, por isso, 
18 
 
não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão 
fortes afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis como 
moléculas aromáticas, irão apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a superfície do 
adsorvente e, portanto, também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de 
cada molécula ou grupo funcional (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
A superfície da sílica empregada na CLAE é habitualmente submetida a determinados 
processos de desativação com o propósito de diminuir a retenção de moléculas muito polares 
e, assim, se mantém a superfície em condições uniformes, o que contribuirá para melhorar a 
reprodutibilidade das análises. Muitas vezes, devido a uma forte adsorção ou retenção de alguns 
componentes da amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de 
uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos 
componentes da amostra na fase móvel. A essa variação dá-se o nome de eluição por gradiente 
ou programação da fase móvel (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Na modalidade de cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar 
suportes que sejam inertes; mas não existem suportes inertes com rigidez e uniformidade 
requeridas pela CLAE. Usa-se a sílica, sabendo-se que tem pontos adsorventes que necessitam 
ser completamente cobertos ou inativados, como em CG. Os poros deverão ser suficientemente 
grandes para permitir total acesso das moléculas do soluto à fase estacionária contida dentro da 
estrutura dos poros, mas suficientemente pequeno para resistir a remoção do líquido 
estacionário pelo arraste mecânico da fase móvel (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.4.2 Cromatografia líquido-líquido ou por partição 
 
O mecanismo de separação neste tipo de cromatografia baseia-se nas diferentes 
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária. 
Então, os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos por ela, 
enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel (COLLINS; 
BRAGA; BONATO, 1997). 
O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel, 
o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não reprodutibilidade nas separações 
repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira é saturando a fase móvel com 
a fase estacionária por meio de uma pré-coluna, colocada antes do injetor, que contenha uma 
19 
 
alta percentagem de fase estacionaria. A segunda é utilizando materiais que contenham a fase 
estacionária, quimicamente ligada a um suporte sólido (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.4.3 Cromatografia líquida com fase ligada 
 
O mecanismo principal desta técnica é baseado na partição. Por outro lado, como esta 
fase estacionária também apresenta influência de grupos ativos (polares) da superfície, isto é, 
também ocorre o mecanismo de adsorção, a maioria dos pesquisadores considera esta técnica 
um método separado (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária é possível obter 
diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino (-NH2) 
e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente às fases polares da CLS, sendo chamados 
de fase normal. E há os de natureza apolar, como os grupos octil (-C8H17), octadecil (-
C18H37), fenil (-C6H5), que são chamados de fase reversa (COLLINS; BRAGA; BONATO, 
1997). 
 
8.4.4 Cromatografia líquida por troca iônica 
 
Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária possui grupamentos iônicos 
quimicamente ligadosque podem ser trocadores de cátions ou de ânions. Esses grupamentos 
apresentam contra-íons que são deslocados pelos íons da amostra (COLLINS; BRAGA; 
BONATO, 1997). 
Os materiais usados como recheio para CLAE por troca iônica tem grupos (cátions ou 
ânions) quimicamente ligados a partículas porosas de resinas poliméricas, a sílica com camada 
pelicular, as micropartículas porosas de sílica e as micropartículas porosas de resinas 
poliméricas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1997). 
 
8.4.5 Cromatografia líquida por exclusão 
 
A cromatografia por exclusão tem sua resolução baseada no tamanho efetivo das 
moléculas dos componentes da amostra em solução. E existem limites que determinam o 
intervalo de tamanhos em que um material é útil. O primeiro é o inferior, chamado de limite de 
permeação, abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas 
20 
 
dentro dos poros do material e o segundo é o superior, chamado limite de exclusão, acima do 
qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar nos poros. Moléculas de tamanho 
intermediário entre ambos os limites serão separadas totalmente ou parcialmente de acordo com 
a seletividade característica de cada material. Então, serão eluídas sem resolução as moléculas 
menores que o limite de permeação e as maiores do que o limite de exclusão, separando somente 
as que se encontram dentro destes limites (COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
Atualmente dispõe-se de um grande número de materiais para cromatografia por 
exclusão. Eles variam de acordo com a sua rigidez e com o intervalo de tamanho dentro do qual 
são úteis, isto é, o material a ser utilizado na coluna dependerá do tamanho efetivo das 
moléculas que devem ser separadas (COLLINS & GUIMARÃES, 1988). 
 
8.5 DETECTORES USADOS EM CLAE 
 
O detector constitui o componente mais caro e sofisticado do sistema cromatográfico. 
Ele mede de maneira contínua alguma propriedade física ou físico-química da amostra, ou da 
solução que a contém, e envia um sinal para registro, em geral, diretamente proporcional à 
concentração do componente da amostra. Esse sinal é gerado logo que o efluente sai da coluna 
e chega ao detector (CIOLA, 1988). 
Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à sensibilidade dos 
detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna. Infelizmente as propriedades 
físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel são, muitas vezes, similares. Algumas 
soluções para o problema de detecção têm sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: 
a) Medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel; 
b) Medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel; 
c) Detecção após a eliminação da fase móvel. 
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma 
destas soluções (CIOLA, 1988). 
Os detectores podem ser universais ou seletivos, conforme a sua capacidade de trabalhar 
com todos os tipos de amostras ou com uma classe ou tipo de substância, respectivamente. 
Geralmente os detectores universais são os mais procurados, sobretudo pelos laboratórios de 
pesquisa, onde se trabalha com diferentes tipos de amostra. Os seletivos, que podem ter maior 
detectabilidade e efetuam melhor análises de amostras complexas, é de interesse para 
laboratórios que efetuam análises de rotina com compostos similares (CIOLA, 1988). 
21 
 
Os detectores podem ser caracterizados como destrutivos e não-destrutivos. Detectores 
ópticos por absorvância no ultravioleta-visível e infravermelho, por fluorescência e por índice 
de refração são não-destrutivos e permitem recolher a amostra para posterior caraterização, ou 
ser acoplados a outros detectores para obterem informações qualitativas para identificação de 
vários compostos presentes na amostra. Já os detectores eletroquímicos e espectrômetros de 
massa são exemplos de detectores destrutivos (CIOLA, 1988). 
A classe de detectores mais utilizada em CLAE é a óptica, que envolve os de 
absorvância (fotométrico de comprimento de onda fixo, espectrofotométrico de comprimento 
de onda variável, espectrofotométrico por arranjo de diodos), índice de refração, fluorescência 
e espalhamento de luz. Outros tipos são o espectrômetro de massas, eletroquímicos e de 
condutividade elétrica (CIOLA, 1988). 
 
8.5.1 Detectores por absorvância no ultravioleta e no visível 
 
Nos detectores espectrofotométricos o seu funcionamento baseia-se na absorvância de 
luz por parte da amostra ao passar através dela qualquer radiação eletromagnética, normalmente 
isto ocorre no ultravioleta até o infravermelho, em um dado comprimento de onda (CIOLA, 
1988). 
Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de onda variável 
(espectrofotômetros), que não só é de aplicação mais variada e sensível, mas também é mais 
caro, e o chamado fotométrico que funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos. Este 
último é sensível, econômico e mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos 
os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Este tipo de 
detector é normalmente insensível a variações de vazão e temperatura (CIOLA, 1988). 
A maioria dos detectores de comprimento de onda fixo, oferecidos no mercado, operam 
em um comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm, resultado da absorbância de luz em 
254 nm e da emissão de luz em 280 nm por uma substância fosforescente. Em ótimas condições, 
pode-se atingir sensibilidades de até 0,001 unidades de absorbância e, se o composto absorve 
intensamente na faixa de UV, é possível detectar quantidades de amostras da ordem de 
nanogramas (10-9 g). 
Quando se aplica gradiente na fase móvel e ela apresenta variação significativa de 
absorbância para o UV, é necessário utilizar a cela de referência para compensar esta variação. 
22 
 
Se a fase móvel não absorve ou se a absorbância é constante, pode-se deixar a cela de referência 
vazia ou cheia com um dos componentes da fase móvel (CIOLA, 1988). 
Espectrofotômetros de comprimentos de onda variável UV-VIS, cobrindo a faixa de 
190-800 nm, através de monocromador que seleciona o comprimento de onda desejado do feixe 
de luz emitido pelas lâmpadas de deutério (UV) ou tungstênio (VIS), oferecem várias vantagens 
sobre os instrumentos de comprimento de onda fixo, tais como: apresenta alta absorbância para 
vários componentes, permite maior seletividade, promove eficiência em eluição por gradiente 
através da habilidade de selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase 
móvel não apresentam uma variação de absorbância para diferentes concentrações; permite 
obter o espectro de absorbância de cada componente em separado após parar a vazão da fase 
móvel (CIOLA, 1988). 
Análises em diferentes comprimentos de onda também são possíveis com os detectores 
espectrofotométricos através de um conjunto de fotodiodos. Esses fotodiodos, seletivos a 
determinados comprimentos de onda, em grande número, cerca de 250, permitem levantar o 
espectro da substância durante a eluição. Este detector é denominado detector de rede de diodos. 
Os detectores de rede de diodos eram, até a alguns anos, pouco sensíveis, mas na atualidade, 
com a melhora dos computadores com programas dedicados para este fim, com o aumento da 
sensibilidade dos diodos e com correções da aberração da rede de difração, eles aumentaram 
sua sensibilidade e aplicabilidade (CIOLA, 1988). 
 
8.5.2 Detectores por fluorescência 
 
 O princípio de funcionamento destes detectores é que a luz de comprimento de onda 
adequado passa através da cela da amostra, que é excitada por ela. Retornando ao estado 
fundamental, a molécula excitada emite luzde comprimento de onda maior, sendo detectada a 
um ângulo reto da radiação incidente (CIOLA, 1988). 
A espectroscopia de fluorescência pode ser usada como um método de detecção seletivo, 
sendo o detector de maior detectabilidade para compostos que fluorescem. Em boas condições 
é possível detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que é comparável aos 
detectores por captura de elétrons em CG. Uma alta intensidade de fluorescência é esperada de 
compostos que sejam conjugados simetricamente ou que não podem produzir estruturas 
fortemente iônicas. 
23 
 
A fluorescência pode ser desenvolvida em compostos não-fluorescentes por reações 
realizadas pré ou pós-coluna. As principais áreas de aplicação são as que se dedicam às análises 
de alimentos e de produtos farmacêuticos, além daquelas voltadas para a caracterização de 
destilados do petróleo de alto ponto de ebulição (CIOLA, 1988). 
A fase móvel utilizada nos detectores de fluorescência deve ser cuidadosamente 
selecionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em que se encontra a amostra. Isto 
dificulta algumas de suas aplicações, tais como análise quantitativa e eluição por gradiente, nas 
quais deve-se selecionar os componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência. Os 
detectores para fluorescência também podem proporcionar espectros de emissão das amostras 
retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV é necessária em ambos os 
detectores, por absorbância no UV e por fluorescência, eles podem ser combinados em um só 
detector (CIOLA, 1988). 
 
8.5.3 Detectores por índice de refração 
 
É o segundo detector mais usado na CLAE. Ele acompanha continuamente a diferença 
de índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os 
componentes da amostra. Para solutos que não absorvem no UV ou visível e, 
consequentemente, não são detectados por detectores fotométricos, a melhor escolha é o 
detector por índice de refração (CIOLA, 1988). 
A resposta deste detector é universal e sua sensibilidade é moderada, geralmente da 
ordem de micrograma (10-6 g). Este nível de concentração corresponde a uma diferença no 
índice de refração entre a amostra e a fase móvel de aproximadamente 10-7 unidades de índice 
de refração. Para observar esta diferença é necessário um controle de temperatura de 
aproximadamente 0,001 ºC, o que normalmente é conseguido por circulação de água, de uma 
boa fonte termostatizada, através do refratômetro ou um bom controle da temperatura ambiente 
(CIOLA, 1988). 
Além deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade às 
variações de vazão e mudanças na composição da fase móvel, que impedem o uso de gradiente 
por ser difícil encontrar um par de solventes com índices de refração idênticos. Qualquer 
mudança na composição da mistura mudará o índice de refração da fase móvel, então, o lado 
da referência terá que mudar, o que é quase impossível (CIOLA, 1988). 
 
24 
 
8.5.4 Detectores eletroquímicos 
 
Métodos eletroquímicos de detecção oferecem a mais promissora solução para o 
problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensível e não 
baseado em absorbância de luz. Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta sensibilidade 
e serem muito bons para as análises de traços (CIOLA, 1988). 
É importante destacar que, neste tipo de detecção, a amostra tem que ser constituída de 
íons ou compostos que sofram ou oxidação ou redução (detectores polarográficos). Este 
detector é seletivo, porque detecta somente as espécies que se oxidam (ou reduzem) em um 
potencial inferior ou igual ao fixado. Os detectores eletroquímicos são bons para as modalidades 
de cromatografia que usam fases móveis aquosas, tais como a cromatografia por troca iônica, 
por exclusão ou com fase reversa por pares de íons ou até com fase reversa com compostos 
oxidáveis na fase água-álcool (CIOLA, 1988). 
 
8.5.5 Detectores por absorbância no infravermelho 
 
A absorbância no infravermelho pode ser usada como detector universal ou específico. 
A sensibilidade destes detectores, oferecidos no comércio, é muito pequena para as quantidades 
de amostra normalmente usadas, mas eles são usados com sistemas de CLAE por exclusão. 
Usando a técnica de parar a vazão com a amostra na cela e tirar o espectro de infravermelho, 
dará uma imagem analítica completa da amostra. Este tipo de detector é limitado pela fase 
móvel que deve ser transparente no comprimento de onda utilizado (CIOLA, 1988). 
 
8.5.6 Detectores de radioatividade 
 
Os detectores de radioatividade são projetados especificamente para detectar solutos 
radiomarcados conforme são eluídos da coluna. Quase todos detectores deste tipo não são 
encontrados comercialmente, com exceção dos que detectam as partículas β- do 32P e do 14C. 
Para o segundo, que funciona através de cintilação líquida, há necessidade da adição de um 
coquetel de cintilação. Detectores radioquímicos têm uma grande faixa de resposta, são 
insensíveis a troca de fases móveis, podendo ser usados com eluição por gradiente. Aplicações 
cromatográficas com emissores de γ e de β- forte (tais como 131I, 210Po e 125Sb), usando 
sistemas de cintilação ou mesmo contador Geiger, têm sido publicadas (CIOLA, 1988). 
25 
 
8.5.7 Detectores de espectrometria de massas 
 
Os espectrômetros de massas são um tipo de detector para CLAE que pode combinar 
sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilização é muito grande. A 
maior dificuldade na utilização destes detectores é o interfaceamento com o sistema de CLAE 
e o seu alto custo quando comparado aos outros detectores mais usados (CIOLA, 1988). 
 
8.5.8 Outros detectores 
 
Detectores baseados em outras propriedades do soluto, como constante dielétrica, 
densidade, pressão de vapor e viscosidade, têm sido apresentados para serem usados na CLAE. 
Vários destes detectores são baseados em propriedades que dependem da temperatura, fazendo 
sua resposta depender da variação térmica (CIOLA, 1988). 
 
8.6 REGISTRO DE DADOS 
 
A última parte do processo na CLAE é o registro feito por um software específico no 
computador. Este possibilita a criação de métodos de análise variando o tempo de corrida, a 
vazão e a concentração da fase móvel e o comprimento de onda a ser utilizado. Assim como 
apresenta os resultados em um cromatograma e os valores de largura de banda e tempo de 
retenção da amostra (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. 
Campinas: Editora da UNICAMP, 7 ed., 1997. 262 p. 
 
COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. Fundamentos de 
cromatografia. Campinas: Editora da UNICAMP, 2006. 452p. 
 
COLLINS, C. H. & GUIMARÃES, L. F. L., Cromatografia líquida de alta eficiência. In: 
Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, 3. ed., Ed. 
UNICAMP, São Paulo, 1988. p. 179-243. 
 
CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho. 1 ed. Edgard 
Blucher Ltda., São Paulo, 1998. 
 
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: Um Breve Ensaio. Química 
Nova na Escola, n. 7, 1998. 
 
NETO, A.J.S. Problema com o formato dos picos em cromatografia líquida. Disponível em: 
<http://w.scientiachromatographica.com/files/v1n3/v1n3a7.pdf>. Acesso em: 20 nov. 2017.