Preparação para Esterilização

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CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
 DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
1. Título: 
PREPARAÇÃO DE MATERIAL PARA ESTERILIZAÇÃO 
 
2. Objetivo: 
 Acondicionar adequadamente vidrarias, instrumentos e meios de cultura para esterilização. 
 
3.Base Teórica: 
 
A – Esterilização, Desinfecção e Anti-sepsia 
 
 Esterilização: é o processo de inativação total por meio de agentes físicos e químicos de todas 
as formas de vida, quanto a capacidade de reprodução. 
 Desinfecção: consiste na inativação ou redução dos microrganismos presentes em um material 
inanimado. Visa principalmente eliminar os microorganismos patogênicos do material. 
 Assepsia: é a inativação ou redução dos microorganismos patogênicos em um tecido vivo. 
 O controle da multiplicação de microrganismos pode se dar por dois modos: inibição do 
crescimento ou morte, onde morte é considerada com a perda irreversível da sua capacidade 
reprodutiva. A inibição é reversível, ou seja, o microorganismo volta a se multiplicar 
(microbioestase). 
 
B - Limpeza 
 A limpeza em um laboratório deve ser rigorosa, uma vez que qualquer matéria estranha pode 
ser fonte de contaminação. Pisos, bancadas e outras superfícies devem ser desinfetados todos os 
dias, com pano molhado em um desinfetante. 
 
C – Preparação para Esterilização 
 Os materiais a serem esterilizados precisam estar limpos, secos e acondicionados 
corretamente para impedir que após a esterilização, sejam contaminados novamente. Esta preparação 
consiste no embuchamento e na embalagem dos diversos materiais antes da esterilização. 
 Os tubos de cultura, balões e erlenmeyers são tampados com rolhas ou tampões de 
algodão, recobertos na parte superior com papel manilha e amarrados com barbante. 
 As rolhas são preparadas com algodão, de preferência algodão em rama, algodão cardado ou 
algodão hidrófilo. Tomam-se porções convenientes de algodão, dobram-se as extremidades para o 
centro e fricciona-se entre as mãos, formando um cilindro firme, em seguida introduz-se no tubo em 
um movimento rápido de rotação com leve pressão para baixo até atingir cerca de 3 cm da boca do 
tubo. O tampão deve ser firme e liso (sem fiapos), fácil de retirar e de introduzir novamente. 
 As placas de Petri devem estar com tampa e fundo bem ajustados, devem ser embaladas em 
papel manilha, seladas com fita gomada ou barbante, individualmente ou em grupos de três ou mais 
placas. 
 As pipetas devem ter suas boquilhas obturadas com uma mecha de algodão de modo a formar 
uma pequena coluna de 1 cm de comprimento, que funciona com um filtro de ar, impedindo a 
contaminação do material que esta sendo manipulado, em seguida são embaladas em uma tira de 
papel manilha, com comprimento cerca de 1,5 vezes maior que a pipeta, enrolando-a com um 
movimento de rotação em diagonal sobre o papel, dobrando-se as extremidades e selando com fita 
gomada. 
 Pinças, tesouras e outros instrumentos metálicos devem ser embalados em papel manilha, 
individualmente e selados com fita gomada. 
 
 
4. Material Necessário: 
N.º Cd. Item Quant. Unid. 
01 V Tubo de Cultura de 12 x 75 mm Pça 
03 V Erlenmeyer de 250 ml Pça 
04 V Balão fundo chato de 250 ml Pça 
06 V Placas de Petri (10 cm de diâmetro) Pça 
07 V Pipeta Sorológica de 1 ml ml 
08 V Pipeta Sorológica de 5 ml ml 
09 V Pipeta Sorológica de 10ml Pça 
10 O Pinça de Inox Pça 
11 O Papel Manilha Fls 
12 O Algodão Hidrófilo ou Algodão Cardado g 
13 O Fita Gomada Rolo 
14 O Cordão (Barbante) Rolo 
 
5. Procedimento: 
P Operação T 
1 Preparar rolhas de algodão para os tubos de cultura, erlenmeyers e balões e tampando-os 
em seguida. 
 
2 Obturar as boquilhas das pipetas com mechas de algodão 
3 Juntar os tubos de cultura em grupos de cinco e recobrir a parte superior com papel 
manilha e amarrar, bem firme, com barbante 
 
4 Recobrir a parte superior dos erlenmeyers e balões com “capacetes” de papel manilha 
5 Embalar as pipetas com tiras de papel manilha, enrolando-as diagonalmente, dobrando 
as extremidades e selando-as com fita gomada. 
 
6 Embalar as placas de Petri individualmente com papel manilha, selando-as com fita 
gomada 
 
7 Embalar a pinça em papel manilha, selando com fita gomada. 
 
6. Bibliografia: 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São 
Paulo, 1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008. 
Vermelho et al. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro, Ed. Guanabara Koogan, 2006. 
 
 
Obs: O uso de EPI (Bata, máscara e luvas de látex) é obrigatório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
 DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
1.Título: 
PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 
 
2.Objetivo: 
 Conhecer o que são e como são classificados os meios de cultura; Aprender a preparar um 
meio de cultura. 
 
3.Base Teórica: 
 O meio de cultura constitui um material preparado em laboratório para o crescimento de 
microrganismos in vitro. Estes meios de cultura devem conter os nutrientes necessários para o 
crescimento dos microrganismos, bem como quantidade de água suficiente e um pH ajustado. Porém 
nem todos os microrganismos podem ser cultivados em laboratório. Além de nutrientes, os meio 
devem conter ágar. O ágar é um polissacarídeo extraído de algas que é incorporado ao meio de 
cultura e funciona como agente solidificante. 
 
Classificação: 
1) Quanto ao estado físico: Líquido; Semi-sólido e Sólido 
 
2) Quanto à composição: 
 
a) Meio quimicamente definido ou meio sintético: sua composição exata é conhecida 
b) Meio complexo: são compostos de nutrientes como extratos de levedura, extrato de carne, extrato 
de vegetais, sangue, soro. 
 
3) Quanto à finalidade: 
 
a) Meio Seletivo - Elaborado com o objetivo de favorecer o crescimento do microrganismo de 
interesse, inibindo o crescimento de outras bactérias na cultura. 
 
Ex.: Ágar Sabouraud Dextrose com cloranfenicol – crescimento de fungos com pH 5,6 e inibição do 
crescimento de bactérias pelo baixo pH e antibiótico. 
Ex.: EMB (eosine metil blue) – crescimento de bactérias Gram negativas e inibição de Gram 
positivas. 
 
b) Meio Diferencial - Meio de cultura utilizado para identificar colônia da(s) bactéria(s) de interesse 
através de mudança de coloração da colônia ou do meio de cultura devido à presença de uma 
substância (indicador) que diante de uma reação passa a apresentar uma coloração distinta. 
Ex.: Ágar Manitol – crescimento de colônias de Staphylococcus aureus com viragem do meio de 
vermelho para amarelo, devido acidificação pela fermentação do Manitol. 
 
c) Meio de Enriquecimento - Meio de cultura utilizado para aumentar o número de bactérias de 
interesse quando o material examinado contém grande número de outras bactérias (fezes e solo) e/ou 
para favorecer bactérias mais exigentes ou com dificuldade de crescimento. 
 
Ex.: Meio Agar Sangue ou Chocolate, com sangue de carneiro desfibrinado, favorece o crescimento 
de bactérias que cresce com dificuldades em meio sem a presença dos nutrientes contidos no sangue. 
 
 
 
4.Material Necessário: 
Item 
BalançaBecker 
Espátula 
Proveta de 100 mL 
Bastão de vidro 
Tubos de ensaio 
Suporte universal 
Fonte aquecedora (bico de Bunsen ou chapa ou microondas) 
Algodão 
Frasco de meio de cultura com ágar 
 
5.Procedimento: 
P Operação T 
1 Pesar o meio de cultura 
2 Diluir o material em 100 mL de água destilada 
3 Aquecer na chapa até o meio ficar límpido 
4 Distribuir nos tubos de ensaio. 
 
6.Bibliografia: 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São 
Paulo, 1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008. 
Miller, Otto; et al. Laboratório para o Clínico, 1991 
 
Obs: O uso de EPI (Bata, máscara e luvas de látex) é obrigatório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
 DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
1.Título: 
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS 
2.Objetivo: 
 Demonstrar a presença de microrganismos em diversos ambientes. 
 Isolar microrganismos de diferentes locais. 
 Treinar técnicas de manipulação de microrganismos. 
3.Base Teórica: 
Os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes da terra, inclusive em 
locais onde nenhuma outra forma de vida poderia sobreviver. Podemos encontrar microrganismos 
desde condições altamente ácidas até aquelas alcalinas, do gelo da Antártida às fontes termais, em 
fontes de águas puras ou em pântanos salgados, na presença ou ausência de oxigênio, etc. 
Tudo isso é possível porque os microrganismos são pequenos e facilmente dispersáveis, 
ocupam pouco espaço, necessitam de pequenas quantidades de nutriente e são bem diversificados 
quando às suas necessidades nutricionais. Eles também possuem grande capacidade de adaptação 
às mudanças ambientais. 
No laboratório, os microrganismos são mantidos em meios de cultura, que fornecem os 
nutrientes necessários para que eles cresçam. Além disso, são submetidos à condições de pH e 
temperatura compatíveis ao seu desenvolvimento. Quando os microrganismos são colocados no 
meio de cultura, as células individuais multiplicam-se e produzem um grande número de células 
que crescem agrupadas formando as colônias bacterianas. 
Para isolarmos os diferentes tipos de microrganismos serão utilizados diferentes meios de 
cultura. Para detectar bactérias Gram negativas, utilizaremos o ágar EMB Levine; para fungos, o 
ágar Sabouraud, enquanto o ágar sangue que é um meio de cultura enriquecido permitirá a 
proliferação de diferentes tipos bacterianos. 
4.Material Necessário para cada bancada: 
 Meios de cultura em placas: ágar Muller-Hinton, ágar Sabouraud. 
“swabs” e tubos contendo salina fisiológica. 
5.Procedimento: 
P Operação T 
1 Escolher, um local, de onde será coletada a amostra: nariz, mãos, embaixo das unhas, 
couro cabeludo, bancada, maçaneta da porta, sapato, etc. Obs.: Cada grupo trabalhará 
com um único local e sempre com ele, para semeio em todos os meios de cultura. Pesar 
o meio de cultura. 
 
2 Megulhar o “swab” na solução de salina estéril, trabalhando assepticamente. 
3 Coletar a amostra friccionando o “swab” repetidas vezes no local escolhido. 
4 Espalhar o material coletado na superfície dos diferentes meios de cultura (ágar sangue, 
ágar EMB e ágar Sabouraud). O mesmo “swab” para as três placas. 
 
5 Identificar as placas com o nome da pessoa e o local de coleta. 
6 As amostras serão incubadas a 35-37°C por 24-48 horas. 
6.Bibliografia: 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São 
Paulo, 1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008. 
Miller, Otto; et al. Laboratório para o Clínico, 1991 
 
Obs: O uso de EPI (Bata, máscara e luvas de látex) é obrigatório. 
 
 
 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
 DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
1.Título: 
TÉCNICA DE COLORAÇÃO E MORFOLOGIA BACTERIANA 
 
2.Objetivo: 
 Visualização das características morfológicas e tinturiais das bactérias 
 
3.Procedimento: 
 PREPARO DO ESFREGAÇO: 
1 Sobre uma lâmina limpa e seca colocar, com uma pipeta de Pauster, uma gota de salina 
estéril 
2 Flambar a alça de repicagem 
3 Esfriá-la nas paredes do tubo ou da placa semeada, em uma zona sem crescimento de micro-
organismo. 
4 A partir do crescimento das placas e tubos semeados coletar com a alça uma pequena quantidade 
da colônia bacteriana. 
5 Espalhar o material da alça sobre a lâmina, com a gota de salina, procurando obter um 
esfregaço fino. 
6 Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vezes pela chama. 
7 Realizar a coloração. 
 
 TÉCNICA COLORAÇÃO: 
1 Cobrir o esfregaço com cristal violeta, durante 1 minuto. 
2 Lavar rapidamente em água corrente; 
3 Cobrir todo o esfregaço com lugol, por 1 minuto; 
4 Lavar rapidamente em água corrente; 
5 Lavar rapidamente, com a solução descorante: álcool/acetona; 
6 Lavar rapidamente em água corrente; 
7 Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica ou safranina, por 30 segundos; 
8 Lavar novamente em água corrente; 
9 Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço; 
10 Observar ao microscópio com objetiva de 100x (usar óleo de imersão). 
 
4.Bibliografia: 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São 
Paulo, 1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008. 
Miller, Otto; et al. Laboratório para o Clínico, 1991 
 
Obs: O uso de EPI (Bata, máscara e luvas de látex) é obrigatório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
 DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
1.Título: 
ANTIBIOGRAMA 
 
2.Objetivo: 
Avaliar a sensibilidade dos micro-organismos aos diferentes antibióticos. 
 
3.Material Necessário para cada bancada: 
 
Amostras de bactérias; 
Alça de platina; 
Pinça metálica esteril; 
Bico de Bunsen; 
Tubos de ensaio com meio de cultura estéril; 
Escala de 0,5 Mac-Farland; 
Swabs de algodão estéril; 
Solução Salina 0,9% 
Placas de Petri com meio de cultura Muller-Hinton; 
Frascos de antibióticos. 
 
 
4.Procedimento: 
 Operação 
1 Suspender em solução salina com a alça de platina (1-3 colônias) de um micro-organismo de 
morfologia semelhante, homogeneizar até obter a turvação da escala de 0,5 Mac-Farland. 
2 Mergulhar o swab estéril na suspensão de micro-organismo, retirando o excesso de material 
pressionando o swab contra a parede do tubo. 
3 Passar o swab sobre a superfície do meio Agar Muller-Hinton em três eixos diferentes, de 
forma uniforme. 
4 Aplicar discos de antibióticos diferentes na superfície do ágar com o auxílio da pinça metálica. 
Pressione levemente os discos para não ferir ou se desprendam posteriormente do meio. 
5 Incubar as placas a 37°C por 24 horas. 
6 Realizar a leitura dos resultados. 
 
5.Leitura dos resultados: 
Medir o diâmetro dos halos de inibição (em milímetros) e anotar os resultados. 
Comparar as medidas obtidascom as tabelas de interpretação do resultado do antibiograma 
(Sensível ou Intermediário ou Resistente). 
 
6.Bibliografia: 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São 
Paulo, 1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008. 
 
Obs: O uso de EPI (Bata, máscara e luvas de látex) é obrigatório. 
 
 
Figura 1 
CENTRO UNIVERSITÁRIO BRASILEIRO 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA 
 
 
 
MORFOLOGIA DOS FUNGOS 
 
 
1 - OBJETIVO: 
 
1.Observar as características macroscópicas e microscópicas dos fungos filamentosos ou 
leveduriformes. 
2. Aprender a repicar colônia fúngica. 
3. Aprender a preparar lâmina para observação das estruturas microscópicas dos fungos filamentosos 
e leveduriformes. (hifas, conídios, condidióforos, esporângio, blastoconídios, micro e maroesclerócios, 
ascocarpos e ascósporos). 
 
2 – MATERIAIS: 
 
20 Placas de Petri com meio de cultura BDA ou agar Sabouraud com e sem crescimento fúngico. 
Bico de Bunsen 
Lâminas e lamínulas de vidro, alça de platina em picada 
Solução de azul de metileno ou preferencialmente azul de algodão 
Microscópios 
Fungos isolados em placa de Petri: Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Cladosporium, Fusarium, 
Eurothium. 
 
3 - PROCEDIMENTO: 
 
1) Observar as características macroscópicas do crescimento fúngico em meio BDA (tamanho, 
coloração, produção pigmento e reverso da colônia, estruturas de resistência) . 
2) Realizar o exame microscópico direto de algumas destas amostras. 
3) Trabalhar próximo ao bico de Bunsen para montar Lâmina de observação microscópica: 
 Colocar uma pequena gota de azul de algodão na lâmina de vidro; 
 Com a alça de platina recolher um pouco do crescimento fúngico (borda da colônia – 
micélio jovem) e esmagar no azul de algodão com auxílio de lamínula. 
 Observar no microscópio com objetiva de 10x (focar) e 40x (identificar estruturas) 
 Desenhar as estruturas observadas. 
4) Repicar fungo em placa no meio BDA utilizando alça de platina em picada: 
 
 
Obs.: O uso dos EPIs são obrigatórios! 
4 – BIBLIOGRAFIA 
 
Ribeiro, Mariangela Cagnoni et al. Microbiologia Prática – Roteiro e Manual. Ed. Atheneu. São Paulo, 
1993 
Olavo Cardoso, Jorge. Microbiologia Atividades Práticas-Ed. SANTOS 2ª, 2008.