bio cel

codificadora do dominante negativo da GRK2 (K220M, 
GRK2DN, gentilmente cedidos pela Drª Maria de Fátima Lázari – UNIFESP) foram 
selecionadas com 400 
g/ml do antibiótico G418 (Geneticin® - Gibco). 
As células HEK293 ou GRK2DN foram transfectadas de forma transiente com 
os vetores pEGFP-N3 contendo a sequência codificadora dos �1A-ARs fundidos à 
proteína fluorescente verde GFP na porção C-terminal (20 
g DNA/placa) e, 24 
horas após a transfecção, foram transferidas para placas de 6 poços e deixados 
overnight para aderência. Poços confluentes foram mantidos em 1 ml de DMEM sem 
fosfato contendo [32P]Pi (100 μCi/ml) a 37°C por 3 horas. As células foram então 
estimuladas com os agonistas, lavadas 2 vezes com 1 ml de PBS (Na2PO4 20 mM, 
NaCl 154 mM, pH 7.4) gelado e solubilizadas em tampão gelado contendo 1% Triton 
X-100, 0,05% dodecil sulfato de sódio, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10 mM β-
glicerofosfato, 10 mM pirofosfato de sódio, 1 mM p-serina, 1mM p-treonina, 1 mM p-
tirosina e inibidores de protease (leupeptina 20 mg/ml, fenilmetilsulfonil fluorido 100 
mg/ml, bacitracina 500 mg/ml e inibidor de tripsina 50 mg/ml). As placas foram 
mantidas no gelo por 1 hora e então os extratos celulares foram centrifugados a 
12.700g por 15 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram imunoprecipitados com 10 
l de soro de coelho imunizado contra GFP. Foram feitos ao menos três 
experimentos independentes para cada tratamento. A fosforilação do receptor foi 
detectada através do leitor de varredura Typhoon9400 (GE Healthcare) e 
quantificado através do software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health - NIH, 
Estados Unidos). 
 Material e Métodos 
 
17 
 
 
Quantificação da ligação específica do [3H]Prazosin em células intactas 
Os ensaios foram realizados de acordo com protocolo descrito anteriormente 
(Leeb-Lundberg et al., 1987), padronizado previamente para as condições do 
presente estudo. Nestes experimentos, as células HEK293 ou GRK2DN foram 
transientemente transfectadas com o vetor pDT contendo a sequência codificadora 
dos �1A-ARs (20 
g DNA/placa) e 24 horas após a transfecção, as células foram 
colocadas em uma placa de 24 poços pré-tratados com poli-d-lisina (120.000 
células/poço) e deixadas overnight para aderência. 
Nos ensaios de saturação da ligação específica do [3H]Prazosin, as células 
foram pré-tratadas com noradrenalina ou oximetazolina 10 
M por 5 minutos à 37ºC, 
lavadas 2 vezes com 1ml de PBS gelado e incubadas com diferentes concentrações 
de [3H]Prazosin (20-2000pM) à 4ºC por um período mínimo de 8 horas. A ligação 
não-específica foi determinada na presença de fentolamina 100 
M. As curvas de 
saturação foram analisadas por regressão não-linear utilizando o GraphPad Prism 
versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California USA) para a 
determinação da capacidade máxima de ligação (Bmáx) e a constante de dissociação 
no equilíbrio do radioligante (KD). 
Para os ensaios do curso temporal da internalização, as células foram 
tratadas com noradrenalina ou oximetazolina 10 
M à 37ºC por diferentes períodos 
de tempo (5 a 60 minutos). Em seguida os poços foram lavados 2 vezes com 1 ml 
de tampão PBS gelado. Após a lavagem, os poços foram incubados com 1 nM de 
[3H]Prazosin (80 Ci/mmole, Amershan Biosciences) à 4ºC por pelo menos 8 horas. A 
ligação não-específica foi determinada com a adição de 100 
M de fentolamina. 
 Material e Métodos 
 
18 
 
Passado o período de incubação, os poços foram lavados 2 vezes com 500 
l de 
PBS gelado contendo 0.1% de BSA (albumina sérica bovina) para a retirada do 
radioligante não incorporado e então as células foram ressuspendidas por agitação 
em 500 
l de água ultrapura. Em cada amostra foram adicionadas 4 ml de líquido de 
cintilação e a leitura realizada em um contador de cintilação TriCarb1900 (Packard). 
Para análise, as leituras foram normalizadas pela leitura dos respectivos controles 
sem pré-tratamento com os agonistas 
 A quantidade de proteína de cada amostra foi determinada através do 
método de Bradford (Bradford, 1976) e os valores foram utilizados, nas curvas de 
saturação, para estimar a quantidade de receptores presentes nas preparações 
(fmol/mg de proteína). 
 
Microscopia confocal 
Os experimentos de microscopia confocal foram realizados no Departamento 
de Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo (INFAR/UNIFESP). 
As células HEK293 transientemente transfectadas e expressando �1A-ARs 
conjugado com GFP foram cultivadas em lamínulas de quartzo tratadas com poli-D-
lisina. As imagens foram capturadas em tempo real por microscópio confocal 
(LSM510, Carl Zeiss) a cada 5 minutos a partir da incubação dos agonistas 
noradrenalina (10 
M) e oximetazolina (10 
M) até o tempo total de 30 minutos. Nos 
experimentos com o antagonista prazosin, o antagonista foi incubado na 
concentração de 10 nM, 30 minutos antes da adição do agonista oximetazolina. 
Todas as imagens foram feitas em imersão em óleo utilizando objetivas (Plan-
Neofluar) em aumento de 40X. A excitação foi feita por laser de argônio e filtro HFT 
 Material e Métodos 
 
19 
 
em comprimentos de onda de 488nm e a emissão captada por filtro LP em 
comprimento de onda de 505nm. 
A mensuração da fluorescência foi feita com o auxílio do software ImageJ 
1.38x (National Institutes of Health - NIH, Estados Unidos). A fluorescência foi 
determinada como média de intensidade em áreas circulares selecionadas em 
regiões adjacentes à membrana plasmática. 
 
Ensaios de acúmulo de Ca2+ intracelular 
Células HEK293 estavelmente transfectadas com o vetor pDT contendo a 
sequência codificadora dos �1A-ARs foram selecionadas com 800 
g/ml do 
antibiótico G418 (Geneticin® - Gibco). 
Aproximadamente 24 horas antes do experimento, as células foram 
transferidas para placas de 96 poços (ViewPlate96, PerkinElmer; 30.000 
células/poço) pré-tratadas com poli-d-lisina para aderência. Antes da incubação com 
o marcador fluorescente, as células foram incubadas com noradrenalina (10 µM) ou 
oximetazolina (10 µM) por 5 minutos e então lavadas com 150 μl de solução DPBS 
(NaCl 8g/l; KCl 0.2g/l; KH2PO4 0.2g/l; Na2HPO4.7H2O 2.16g/l) sem Ca2+ e sem Mg2+ 
(Gibco). Após o tratamento com os agonistas (protocolo de dessensibilização), as 
células foram incubadas com 100 
l do indicador fluorescente de Ca2+ FLUO-4 NW 
(Invitrogen - preparado de acordo com instruções do fabricante) e 2.5 mM 
probenecid por 60 minutos a 37°C. Células carregadas com este indicador 
fluorescente de Ca2+ não requerem lavagem para remoção de excesso de indicador 
não incorporado. As placas foram então inseridas no leitor de microplacas Synergy 4 
(BioTek Instruments Inc., Estados Unidos) e estimuladas com noradrenalina para 
 Material e Métodos 
 
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mensuração de fluorescência (excitação a 485 nm - filtro 485/20 nm e emissão a 525 
nm - filtro 516/20 nm). Os dados foram coletados online em microcomputador pelo 
software Gen5 (BioTek Instruments Inc., Estados Unidos) e expressados na forma 
da razão: 
 
(F-F0)/F0 
onde F é fluorescência máxima e F0 a fluorescência mínima detectada. 
 
 Para os ensaios utilizando o marcador