PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

Prévia do material em texto

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO-POP
COLORAÇÃO DE GRAM.
	
	ALUNA: MARIA GABRIELE DA SILVA GOMES 
OBJETIVO: Conscientiza sobre os métodos adequados, necessários para coloração de Gram.
LOCAL DE APLICAÇÃO: Laboratório de Bacteriologia.
MATERIAIS NECESSÁRIOS PARA PREPARAÇÃO DOS CORANTES: 
• 1 béquer de 500 ml; 
• 1 béquer de 1 litro;
 • 1 balança gramatária ou eletrônica;
 • 2 bastões de vidro;
 • 1 proveta de 200 ml; 
• 1 proveta de 500 ml;
 • 1 espátula ou uma colher de café; 
• violeta-de-metila;
 • álcool etílico (99,5º Gay-Lussac)
 • álcool metílico (99,5º Gay-Lussac) 
• axalato de amônia;
 • iodeto de potássio; 
• iodo metálico; 
• safranina; e 
• água destilada.
REFERENCIAS:
BIOMEDICINA EM AÇÃO: Disponivel em <http://www.biomedicinaemacao.com.br/2015/08/coloracao-de-gram-microbiologia-dia1.html >. Acessado em 15 de agosto de 2019.
MINISTÉRIO DA SAÚDE.Técnica de coloração de Gram. Brasilia 2001. Disponivel em< http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf>. Acessado em 18 de agosto de 2019.
PROCEDIMENTO:
Como preparar a violeta-de-metila?
 (A)Primeira solução: Se você utilizar uma balança gramatária ou eletrônica, coloque o papel de pasagem no prato e pese o papel. Adicione a este valor 2 gramas de violeta-de-metila. Siga atentamente as instruções contidas no manual do equipamento. Assegur-se de que sua balança foi certificada pelo INMETRO. Transfira a violeta-de-metila para o béquer de 500 ml. Junte 100 ml de álcool etílico e, em seguida, 100 ml de álcool metílico. Misture lentamente com o auxílio do bastão de vidro. Deixe descansar por alguns minutos e repita o procedimento de mistura várias vezes, até conseguir a completa dissolução do corante. 
	
	PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO-POP
COLORAÇÃO DE GRAM.
	
	ALUNA: MARIA GABRIELE DA SILVA GOMES
 (B) Segunda solução: Pese 4 gramas de oxalato de amônia. No béquer de 1 litro, junte o oxalato de amônia à metade da água destilada (200 ml). Misture lenta e constantemente como na 1ª solução, até conseguir a completa dissolução, observando se não restaram resíduos no fundo do béquer. Você observará que o preparo desta solução vai desencadear uma reação endotérmica, isto é, a solução ficará ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de dissolução do sal, você pode aquecer em banho-Maria a 37º C. C) Preparo final: Junte as duas soluções (A e B) e utilize o restante da água destilada (200 ml) para recuperar os resíduos da violeta-de-metila no béquer. Deixe descansar por 24 horas e filtre em papel de filtro comum, acondicionando o corante em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.
5.2 Como preparar o lugol? 
Para preparar essa solução, pese 4,5 gramas de iodeto de potássio. Transfira o iodeto de potássio para um béquer contendo 450 ml de água destilada. Com o auxílio de um bastão de vidro, misture até a completa dissolução. Em seguida, pese 3 gramas de iodo metálico e junte à solução de iodeto de potássio. Continue misturando até a completa dissolução. Armazene em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.
5.3 Como preparar a safranina? 
Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o pó em 500 ml de água destilada, misturando bem até conseguir a completa dissolução. Guarde em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.
COLORAÇÃO DE GRAM:
Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violetade-metila já contém fixador químico. Para fazer a coloração, siga os seguintes passos:
após a fixação, coloque sobre toda a lâmina o cristal violeta, que é um corante de cor púrpura, e aguarde de 30 segundos a 1 minuto. Neste passo, todas as bactérias estarão coradas igualmente, pois absorverão o corante.
Após este período, lave a lâmina com água destilada, e posteriormente, aplique o lugol (solução de iodo). Esta solução fixará o corante cristal violeta nas bactérias gram-positivas, que tem a parede mais espessas.
Lave a lâmina novamente com água destilada e logo após, lave com álcool-acetona, por cerca de 15 segundos ou até o corante azul sair da lâmina. O álcool fará a descoloração das bactérias gram-negativas, que possuem a parede menos espessa, e é imprescindível uma atenção a este passo, para que não descolore muito a lâmina. Coloque rapidamente a lâmina em água corrente, para tirar o excesso de álcool.
Coloque por toda a lâmina a fucsina ou a safranina. Estes são contracorantes, de tom avermelhado, que servirão para corar as bactérias gram-negativas que foram descoradas no passo anterior. Deixe o corante por 30 segundos a 1 minuto, e lave com água destilada.Seque a lâmina com secador, e leve ao microscópio para a análise, na objetiva de 100x.
	
	PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO-POP
COLORAÇÃO ZIEHL- NEELSEN.
	
	ALUNA: MARIA GABRIELE DA SILVA GOMES
OBJETIVO: Conscientizar sobre os métodos adequado da coloração de ZIEHL-NEELSEN.
LOCAL DE APLICAÇÃO: Laboratório de Bacteriologia 
MATERIAL: 
Fucsina Fenicada 
Azul de Metileno concentrado 
Descorante para Ziehl ou Descorante para B.A.A.R
Alça bacteriológica, 
bico de Bunsen, 
lâminas de microscopia, 
papel de filtro 
 lamparina à álcool.
MÉTODO DE COLORAÇÃO:
 Cobrir a lâmina com a solução de Fucsina Fenicada de Ziehl.
 Com uma chama fraca sob a lâmina (de lamparina a álcool, p. ex.), aquecer suavemente até a emissão de vapores, durante 5 minutos. Evitar a ebulição e evaporação do corante.
 Lavar rapidamente em água corrente.
Inclinar a lâmina e gotejar a solução descorante sobre o esfregaço, até que não escorra mais o liquido vermelho.
Lavar em água corrente novamente.
 Cobrir a lâmina com a solução de azul de metileno e deixar agir por 40 segundos a 1 minuto.
 Lavar em água corrente e secar entre duas folhas de papel de filtro.
 Levar ao microscópio para proceder a leitura.
Proceder a leitura com objetiva de imersão. Os bacilos álcool-ácido resistentes aparecem como bastonetes finos vermelhos, isolados ou agrupados, frequentemente encurvados e nodulados, sobre fundo azul.
REFERENCIA:
Disponível em <https://www.consalab.com.br/coloracao-de-ziehl-neelsen-newprov/p> acessado em 30 de agosto de 2019.