DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

Prévia do material em texto

13
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
ALUNOS: Christina Real
 Ingrid Pinho
Jonathan Nascimento 
Gabriel Luiz 
Maria Júlia Farrôco 
Mariana Toledo G. Moreira 
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
ALUNOS: Christina Real
 Ingrid Pinho 
Jonathan Nascimento
 Gabriel Luiz
Maria Júlia Farrôco
Mariana Toledo G. Moreira
	
Relatório de determinação da concentração de proteínas pelo método de biureto de Bioquímica Experimental do curso de Química ministrado pela Prof.ª Thiago Novotny no dia 10 de outubro de 2018.
FUNDAÇÃO TÉCNICO-EDUCACIONAL SOUZA MARQUES
QUÍMICA-BACHARELADO
Rio de Janeiro 
2018.2
Sumário
INTRODUÇÃO TEÓRICA	3
OBJETIVO:	4
MATERIAIS E REAGENTES	5
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	6
RESULTADOS E DISCUSSÕES	8
CONCLUSÃO	12
REFERÊNCIAS	13
INTRODUÇÃO TEÓRICA
É um método analítico que consiste no estudo da interação da matéria com radiação eletromagnética a fim de determinar a concentração de espécies químicas. Essa interação é calculada através da transmitância e absorbância de tal radiação. Ao incidir um feixe de luz sobre uma matéria, parte dessa luz é absorvida. Absorbância é, justamente, o quanto de luz é absorvido pela matéria. A porção de radiação, que não é absorvida, é transmitida através da matéria. O quanto a matéria permite transmitir, em termos de radiação, é chamado de transmitância. 
Estimando-se a quantidade de luz absorvida, é possível determinar a concentração de determinado composto em solução sabendo que, quanto maior a concentração, maior será a absorbância e, por consequência, menor será a transmitância. 
Boa parte das biomoléculas absorve a luz em comprimentos de onda característicos, sendo assim mede-se a absorção da luz por um meio de um espectrofotômetro para detectar, identificar moléculas e para determinar suas concentrações em solução. Sendo assim as leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. As duas relações combinadas descrevem que a fração da luz incidente absorvida pela solução em um determinado comprimento de onda está relacionada à espessura da camada de absorção, e à concentração da substância que absorve. Conforme a equação a seguir:
Em que Io é a intensidade da luz incidente, I é a intensidade da luz transmitida, a relação I/Io o inverso da razão na equação é a transmitância, Ɛ é o coeficiente de extinção molar, C é a concentração da substância absorvida, e l é o comprimento do caminho de luz da amostra absorvente de luz.
A lei de Lambert-Beer pressupõe que a luz incidente é paralela e monocromática, onde moléculas de solvente e soluto são orientadas aleatoriamente. A expressão log (Io/I) é denominada absorbância e designada A.
Compostos que absorvem luz são, naturalmente, coloridos. Entretanto, é possível analisar a concentração de compostos que são incolores desde que passíveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. O biureto é um composto formado pelo aquecimento da ureia a 180°C. Soluções fortemente alcalinas de biureto em presença de sulfato de cobre diluído desenvolvem uma cor azul. Apesar disso, o nome “reação do biureto” para a formação de complexos corados na presença de sulfato de cobre, mesmo na ausência de biureto, foi mantido. O princípio do método baseia-se na formação, em meio alcalino, de um complexo entre os íons de cobre presente no reagente de Biureto e os átomos de nitrogênio presentes na solução, resultando em uma coloração azul. (BELLÉ, L.P. SANDRI, S., 2014) 
A formação do complexo corante-proteína de cor azulada promove a possibilidade de quantificar a concentração de proteínas em soluções, inicialmente, incolores. 
 
	
OBJETIVO: 
Identificar a importância dos métodos espectrofotométricos na determinação da concentração de diferentes compostos bem como elaborar uma curva de calibração e determinar a concentração de proteínas na amostra de urina, por meio de cálculos específicos.
MATERIAIS E REAGENTES
Materiais: 
Bastão de vidro;
Balão volumétrico ( 100mL e 500mL);
Béquer (100mL e 500mL);
Espátula;
Frasco âmbar;
Pêra;
Pipeta Pasteur;
Pipeta volumétrica(10mL);
Tubo de ensaio.
Equipamentos:
Balança Analítica;
Espectofotômetro. 
Reagentes: 
Albumina bovina;
Amostra biológica (urina);
Hidróxido de sódio;
Iodeto de potássio;
Sulfato de cobre pentahidratado;
Tartarato duplo de sódio e potássio.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
I) Preparo de reagente de Biureto:
Em um béquer, pesou-se 750mg de cobre penta hidratado e em seguida pesou-se 3g de tartarato duplo de sódio e potássio;
Após isso, solubilizou-se as substâncias em 250mL de água destilada;
Sob constante agitação, adicionou-se 150mL de hidróxido de sódio (NaOH) 10% e posteriormente adicionou-se 0,5g de iodeto de potássio;
Logo após feita a solubilização, avolumou-se até completar 500mL do béquer com o auxílio de um bastão de vidro e armazenou-se o volume em um frasco âmbar.
II) Preparo da Albumina Bovina:
Em um béquer, pesou-se 0,8g de albumina bovina;
Após isso, adicionou-se nesse béquer 50mL de água destilada, executando-se a primeira diluição;
Transferiu-se a solução para um balão de 100mL;
Com o auxílio de uma pipeta, retirou-se 1mL da solução e transferiu-se para um tubo de ensaio; 
Adicionou-se no balão mais 50mL de água destilada, executando-se a segunda diluição;
Com o auxílio de uma pipeta, retirou-se 1mL da solução e transferiu-se para um tubo de ensaio; 
Adicionou-se no balão mais 50mL de água destilada, executando-se a terceira diluição;
Com o auxílio de uma pipeta, retirou-se 1mL da solução e transferiu-se para um tubo de ensaio; 
 Adicionou-se no balão mais 50mL de água destilada, executando-se a última diluição;
Com o auxílio de uma pipeta, retirou-se 1mL da solução e transferiu-se para um tubo de ensaio;
Adicionou-se em cada tubo de ensaio 5mL de Biureto.
III) Preparo da urina:
Em um tubo de ensaio, adicionou-se 10mL de urina e 10mL de água destilada;
Em outro tubo de ensaio, adicionou-se 10mL de urina e 30mL de água destilada;
 Adicionou-se em cada tubo 5mL de Biureto. 
 RESULTADOS E DISCUSSÕES 
A fim de descobrir a concentração de proteínas, em uma amostra de urina, é preciso considerar um padrão e tê-lo como base para os cálculos. Para tanto, foram preparadas soluções de albumina bovina com diferentes concentrações. Teoricamente, para uma mesma substância que possui o mesmo coeficiente de extinção molar, os valores lidos no espectrofotômetro devem ser proporcionais às concentrações, como rege a lei de Lambert-Beer, desenhando uma curva linear. Vale ressaltar que, as soluções são inicialmente incolores e para que fosse possível realizar a análise, utilizou-se o Biureto, que reage com proteínas formando um complexo corado. 
Ao obter os valores de absorbância para as soluções-padrão preparadas, como mostra a Tabela 1 a seguir, foi possível plotar uma curva de calibração a fim de usar o coeficiente angular da reta obtida para determinar a concentração proteica na amostra de urina em questão. Isso é possível porque o Biureto reage da mesma forma com qualquer proteína, ou seja, mesmo que a proteína presente na urina não fosse a albumina bovina, ainda seria viável admitir o mesmo coeficiente de extinção molar, sendo as soluções de coloração mais fortes as mais concentradas e com maiores valores de absorbância. 
 
Tabela 1- Concentração x Absorbância da solução padrão
	Padrão
	Concentração (mg/mL)
	Absorbância
	1
	1
	0,01
	2
	2
	0,05
	3
	4
	0,12
	4
	8
	0,26
Ao obter a curva de calibração, há diversas maneiras de determinar a concentraçãode uma solução desconhecida. Utilizou-se, então, a seguinte expressão: 
Aa = Ɛ. Ca
Onde,
Aa = absorbância da amostra;
Ɛ =0,0314= coeficiente angular obtido através do gráfico;
Ca = concentração da amostra.
Dessa forma, tem-se que a absorbância das amostras de concentração desconhecida 1 e 2 é, respectivamente, 0.32 e 1.27 mg/mL, como mostram os cálculos. É importante ressaltar que as amostras foram diluídas devido à forte coloração que, possivelmente, interferiria no método. Dessa forma, é preciso levar em consideração o fator de diluição sabendo que a amostra 1 é composta de três partes de água para cada uma parte de urina enquanto a amostra 2 é a diluição de 1:1. 
I) Amostra 1
0,01= 0,0314. Ca
Ca= 0,32 mg/mL
C1V1= C2V2[1: É importante lembrar que a equação “C1V1= C2V2” é proveniente da relação entre as concentrações inicial e final da solução, sendo uma forma de corrigir os valores após fazer diluições.]
C1.10=0,32.30
C1= 0,96 mg/mL
II) Amostra 2 
0,04= 0,0314. Ca
Ca= 1,27 mg/mL 
C1V1= C2V2*
C1.10=1,27. 20
C1= 2,54 mg/mL
Discutiu-se acerca da quantidade de proteína encontrada na urina. Sabe-se que não é comum a presença de proteínas na excreta humana, já que estas moléculas são muito grandes –macromoléculas- e são, comumente, digeridas e quebradas em moléculas menores. Segundo José V. Morales, apesar da presença anômala das macromoléculas, a proteína urinária predominante é a albumina. Ainda segundo ele, são valores considerados normais de proteinúria (excreção urinária de proteína) a excreção de até 150 mg em 24 horas. Um aumento persistente da excreção urinária de proteínas é, em princípio, de natureza patológica. Não é objetivo, nem capacidade, dos componentes do grupo diagnosticar o participante que cedeu o material para o estudo, porém ao que indicam os resultados, sua excreção de proteínas está dentro dos padrões, visto que seria necessário excretar aproximadamente sessenta vezes a concentração de proteínas encontrada em sua urina, em um dia. 
Vale ressaltar a divergência dos valores de concentração encontrados. Já que as duas amostras são diluições de uma mesma solução, espera-se que apresentem a mesma concentração após a correção dos valores considerando as diluições. Entretanto, os valores não correspondem. Possivelmente, a causa da discrepância gerada é que valores de concentração muito baixos e muito altos tendem a gerar valores errôneos de absorbância no espectrofotômetro. Sendo assim, é razoável que a absorbância da amostra 1, mais diluída, esteja errada devido a sensibilidade do método. 
CONCLUSÃO
Concluiu-se mediante aos resultados obtidos que, o método do biureto utilizado e realizado em laboratório para determinação de proteína manteve suas características segundo a literatura, proporcionando assim melhores condições para tais determinações. O fator essencial a ser levado em consideração para análises de proteínas, deve-se ao entendimento, de precisão, com relação a natureza dos constituintes das amostras assim como das concentrações aproximadas. Diversas condições distintas para tal determinação podem ser abordadas, como propriamente a rapidez e o custo da metodologia; a sensibilidade que está diretamente ligada a concentração de proteínas e volume da amostra disponível; e a credibilidade dos resultados, apesar dos interferentes em amostras que, podem influenciar negativamente nos mesmos, fazendo com que haja alteração nos resultados.
	 
REFERÊNCIAS 
 	
BIBLIOGRÁFICAS
2 NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger [recurso eletrônico] –6.ed. – Dados eletrônicos. – Porto Alegre: Artmed, 2014.
BELLÉ, L.P. SANDRI, S. Bioquímica aplicada reconhecimento e caracterização de biomoléculas. 1.ed. São Paulo: Erica, 2014 1 recurso online ISBN 9788536519623.
MEIO ELETRÔNICO
MORALES, J.V. et al. Proteinúria: avaliação clínica e laboratorial. Revista HCPA Porto Alegre: 2000; vol. 20(3) pag 264-274. Disponível em: < https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/163996/000342801.pdf?sequence=1 > Acesso em 19 de Nov. de 2018