MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO EM FITOQUÍMICA

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MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO EM FITOQUÍMICA
A investigação fitoquímica tem por objetivo verificar a presença de grupos de metabólitos secundários e caracterizar os constituintes químicos presentes nas espécies vegetais.
as plantas são fontes ricas em metabólitos com diferentes funções, que podem estar distribuídos de forma taxonômica mais restrita, como alcaloides, ou de forma ampla como os compostos fenólicos. Nesse contexto, o processo de caracterização química pode ter como objetivo a identificação de metabólitos específicos a uma determinada espécie, ajudando no processo de identificação do vegetal, procedimento chamado de quimiotaxonomia ou quimissistemática.
O processo de caracterização tem papel importante no controle de qualidade de drogas vegetais, identificação de compostos desconhecidos e busca de um grupo específico de metabólitos em uma espécie já caracterizada, visando o isolamento dos metabólitos de interesse.
RELEMBRAR O QUE SÃO METABÓLITOS PRIMÁRIOS E SECUNDÁRIOS.
A pesquisa fitoquímica busca conhecer os constituintes químicos das plantas ou conhecer o grupo de metabólitos secundários relevantes nas mesmas.
Quando não se dispõe de estudos químicos sobre as espécies de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode indicar o grupo de metabólitos secundário relevante da mesma. Caso o interesse esteja restrito a uma classe específica de constituintes ou às substâncias responsáveis por certa atividade biológica, a investigação deverá ser direcionada para o isolamento e a elucidação estrutural da mesma.
As análises fitoquímicas fornecem informações relevantes da presença de metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa chegar ao isolamento de princípios ativos importantes na produção de novos fitoterápicos.
É uma área multidisciplinar, e tem como objetivo a extração, isolamento, purificação e elucidação estrutural dos constituintes presentes em plantas, e que apresentam atividade biológica. Entre as classes de princípios ativos vegetais podemos citar os metabólitos secundários: alcalóides, cumarinas, esteróides, flavonóides, glicosídeos cardioativos, lignanas, óleos essenciais, saponinas, triterpenos, entre outros.
OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL
Antes do início da pesquisa fitoquímica, é necessário que o material vegetal passe pela autenticação e confirmação da espécie. Esses dados são obtidos a partir de parâmetros de identidade botânica por ensaios macro e microscópicos.
é essencial que se prepare uma exsicata para a identificação botânica e que a seleção do material coletado seja feita adequadamente, evitando coletar partes do vegetal afetadas por doenças, parasitas e também materiais estranhos. Parte integrante de uma identificação precisa e segura do material a ser utilizado na pesquisa fitoquímica, a determinação da época da coleta e da procedência do material pode evitar divergências na sua análise química, condicionada à sazonalidade e às condições do solo e do ar onde o vegetal cresce. A planta escolhida deve ser seguramente identificada por um botânico ou um técnico especializado.
Deve-se, ainda, atentar para o fato de que uma mesma espécie botânica pode possuir diferentes nomes populares ou, ao contrário, diferentes espécies botânicas com um mesmo nome popular, segundo a região ou população que as usa.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
A investigação pode ser realizada com o material fresco ou seco. O seco é preferível pois impede degradação do material por reações de hidrólise e crescimento microbiano. Entretanto, existem algumas determinações, como por exemplo de peróxidos, que deve ser realizada com o material fresco.
O material vegetal pode ser seco em estufas de ar circulante, ou dispostas ao ambiente. As temperaturas devem ser baixas (inferior a 60° para que não haja degradação dos componentes químicos) com um tempo relativo de aprox. 7 dias, no qual uma amostra do material previamente separada, deve ser pesada diariamente até que o peso do mesmo fique constante.
MOAGEM
Tem por finalidade reduzir, mecanicamente, o MV a fragmentos de pequenas dimensões, preparando-o para a extração. O aumento da área de contato entre o MV solido e o liquido extrator torna mais eficiente a operação. A escolha das dimensões mais adequadas depende também da textura do órgão vegetal. Quanto mais rígidos os tecidos, maior será o grau de divisão necessário. Pode ser de forma mais grosseira como seccionamento com tesouras, até a utilização de moinhos para pulverização do material vegetal.
ANÁLISE FITOQUÍMICA
Para algumas substancias, em certos vegetais, podem-se realizar reações de caracterização diretamente sobre os tecidos do MV. Entretanto, na maioria das vezes, para se proceder a caracterização de um determinado grupo de substancias presentes em um vegetal, deve-se primeiro extrair essas substancias com um solvente adequado, para então caracterizá-las no extrato. 
Os processos extrativos apresentam diferentes características e objetivos, e são genericamente divididos em processos a frio e a quente, que podem ser em sistemas abertos ou fechados.
Principais métodos de extração a frio:
Maceração: Realizada em recipiente fechado, onde a DV fica em contato com liquido extrator por vários dias geralmente, sem renovação de solvente e com agitação ocasional.
Percolação: Ocorre o arraste dos metabólitos em percolador, com a passagem contínua de solvente, levando ao esgotamento da DV.
Turboextração: Ocorre a extração e diminuição do tamanho das partículas ao mesmo tempo, causando rompimento das células vegetais com consequente liberação de metabólitos. Técnica simples, rápida e versátil.
Principais métodos a quente em sistemas abertos:
Infusão: famosos “chá”. Contato do material vegetal com água fervente em sistema aberto. Indicado para partes vegetais mais moles e delicadas. Tem menor poder de extração.
Decocção: Material vegetal fica em contato com líquido extrator em ebulição. Indicado para materiais mais duros.
Principais métodos a quente em sistemas fechados:
Extração sob refluxo: DV em contato com extrator em ebulição, porém acoplado a condensadores. Tem alto poder de extração, mas não é indicado para compostos termo sensíveis, e pode ser utilizado com solventes como álcool e acetona.
Soxlet: Semelhante ao refluxo, porém a DV e o liquido extrator ficam em compartimentos diferentes. O solvente pode ser renovado a cada ciclo, possibilitando uma extração com maior eficiência.
ANÁLISE FITOQUÍMICA
Reações de caracterização
A caracterização dos principais grupos de metabólitos secundários é realizada por meio de ensaios clássicos, em reações que resultam em aparecimento de cor e/ou precipitado nas amostras analisadas. A limitação é a possibilidade de ocorrência de reações inespecíficas gerando resultados falso-positivos ou vice-versa.
As principais reações são:
alcaloides
São uma classe bastante abrangente de metabólitos secundários, originados de várias vias metabólicas. A função nos vegetais é principalmente a defesa com predadores (desde vertebrados, até micro-organismos). Por isso a maioria das substâncias dessa classe apresenta efeitos tóxicos, tendo como alvo principal os receptores adrenérgicos, dopaminérgicos, colinesterases, entre outros. Farmacologicamente apresentam atividades antimicrobianas, antiparasitárias e citotóxicas (sendo amplamente estudados contra o câncer).
A análise de presença de alcaloides é baseada na propriedade de apresentarem padrões de solubilidade distintos de acordo com o pH. O ensaio mais utilizado é o de Stass-Otto. Com reação positiva com formação de precipitado ou turvação após a add dos reagentes clássicos (Bertrand, Dragendorff, Mayer ou Wagner).
Antraquinonas
São produzidas no vegetal para defesa contra predadores e também para atividade alelopática. Farmacologicamente apresentam principalmente atividade laxativa.
Reação de Bornträger é a mais empregada. Baseia-se na solubilização desses compostos em solventes apolares, que se tornam avermelhados após alcalinização. Baseado na ionização de hidroxilas fenólicas,gerando maior ressonância da molécula em consequência, e produção da coloração. 
 Para a identificação de heterosídeos, é necessário a realização de hidrólise prévia para a degradação dos açucares, pois a presença do mesmo pode dar resultados falsos.
Esteróides/triterpenos
Triterpenos são a classe de substâncias derivados do mevalonato, que conferem odor nas plantas. No vegetal, apresentam funções de atração de polinizadores ou repelir predadores. São principalmente encontrados em óleos voláteis. farmacologicamente apresentam principalmente ação inseticida, antimicrobiano e anti-inflamatório. 
Os esteróis são estruturas semelhantes ao colesterol, produzidos pelo vegetal. Que assim como o colesterol, também tem função de regulação da fluidez de membrana, dentre outas atividades metabólicas no vegetal. A principal ação farmacológica associada é a redução do colesterol LDL.
O principal teste para detecção desses compostos é a reação de Liebermann-Burchard, que consiste no tratamento da amostra com anidrido acético em presença de ácido acético e algumas gotas de ácido sulfúrico. A mistura desses causa desidratação e oxidação, formando esteroides aromáticos, causando o aparecimento de coloração azul-esverdeada. Para triterpenos ocorre formação de coloração avermelhada, rosa ou violeta.
Flavonoides
São uma importante classe de compostos fenólicos, presentes em relativa abundância nos vegetais. É a classe mais amplamente estudada, com o maior número de compostos identificados (mais de 7 mil em 2005). Nas plantas apresentam funções de proteção contra radiação solar, antimicrobiano, antioxidante e agente alelopático. O interesse farmacológico dessa classe é grande, apresentam atividade antioxidante, antiviral, antitumoral, etc. Também tem interesse industrial como pigmentos.
A reação de Shinoda ou da cianidina é a mais utilizada para identificar essas classe de compostos. O princípio do método é a redução dos derivados flavonoídicos, de cor amarela, a antocianinos (coloração vermelha). O processo de redução em geral acontece no anel C, gerando um núcleo antociânico. Outros ensaios também são utilizados, como o de Wilson e Marini Bertolo
heterosídeos cardiotônicos
Também podem ser encontrados no reino animal, em algumas espécies de anfíbios, geralmente atuando como veneno ou toxinas. Apresentam alta especificidade ação no musculo cardíaco. São utilizados no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, entre outras doenças cardíacas. Ex digoxina e lanatosídeo C. Contudo, são tóxicos apresentando baixo índice terapêutico (a dose tóxica é normalmente apenas 2 vezes maior que a efetiva). 
A caracterização dessa classe envolve reações que evidenciam isoladamente partes das moléculas dos heterosídeos: reações de caracterização de esteroides (Liebermann Burchard), reações relacionadas com o anel lactônico pentacíclico (Baljet e Kedde) e reações com desoxiaçucar (keller-Kiliani). Todas também produzem colorações.
Saponinas
São metabólitos muito comuns. são glicosídeos de esteroides ou de terpenos policíclicos, que apresentam como característica a formação de espuma abundante em meio aquoso. Apresentam ação hemolítica e também causam desorganização das células branquais de peixes (ação ictiotóxica) por isso apresentam um problema quando despejadas em rios. Também podem complexar esteroides, razão pela qual também apresentam atividade antifúngica e hipocolesterolemiante. O ensaio empregado é a avalição da formação de espuma. Para isso a amostra é dissolvida em água e vigorosamente agitada (em tubos de ensaio). A espuma formada deverá manter-se constante após a adição de algum ácido mineral.
Taninos
Historicamente plantas ricas em taninos são utilizadas no processo de transformação da pele animal em couro. Na qual se ligam as moléculas de colágeno da pele animal, conferindo a mesma resistência ao calor, água e abrasivos. Possuem sabor adstringente, sendo uma das suas maiores características. Formam complexos com proteínas e íons metálicos, sendo essas características as responsáveis pela maioria das ações farmacológicas. Nas plantas, agem como repelentes a herbívoros, também na defesa contra micro-organismos. Farmacologicamente possuem capacidade fortemente antioxidante, proteção contra diabetes, câncer, doenças neurodegenerativas, antimicrobiano, entre outros.
A caracterização desse grupo se dá por meio de reações que formam colorações ou precipitados, como a precipitação com geltatina e cloreto férrico. Também existe o ensaio de stiasny para diferenciação de taninos condensados e hidrolisáveis. E também o método de Folin-ciocalteu, que permite a quantificação.
FRACIONAMENTO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO	
Essa etapa tem como objetivo a obtenção de substâncias puras ou frações semipurificadas dos extratos de plantas. Com a finalidade de se obter amostras mais potentes ou com menor toxicidade.
A primeira etapa é a preparação do extrato, no qual podem ser realizados com vários solventes e feito o doseamento do grupo de metabólitos secundários de interesse. No qual será determinado qual sistema solvente apresentou maior rendimento para o grupo de metabólitos que se deseja obter. Após a produção do extrato, o mesmo passa por um processo chamado partição líquido-líquido, que fraciona os componentes do extrato de acordo com o coeficiente de partição em vários solventes. Então novas análises são realizadas para se determinar qual fração apresenta maior potência ou menos toxicidade. A partir daí são realizadas ténicas cromatográficas e procedimentos de isolamento e identificação.
As técnicas cromatográficas mais empregadas no estudo fitoquímico são CCD, que é uma ténica de baixo custo capaz de ajudar na identificação de um determinado composto em um extrato, pela comparação do padrão de mancha produzido na placa, com um padrão isolado. 
A CG e HPLC são os métodos cromatográficos mais descritos para produtos naturais, permitem a avaliação de fingerprints dos extratos, identificação e quantificação de substâncias. A desvantagem do CG é que só pode ser utilizado com amostras voláteis, como por exemplo óleos essenciais. Já o CLAE apresenta uma série de vantagens, sendo um equipamento altamente versátil para a análise de diferentes extratos. Suporta diferentes detectores, como por exemplo espectrômetros de massas.
A EC também é uma técnica utilizada para a caracterização química de extratos vegetais. Apresenta algumas vantagens em relação ao CLAE, como por exemplo corridas muito mais rápidas e não emprega solventes orgânicos. As fases móveis são basicamente soluções tampão. Considerada como uma técnica de “química verde”. 
Metabolômicas
O estudo metabolômico aplicado à bioprospecção pode ser feito em duas etapas. A primeira envolve o cruzamento de informações relativas aos perfis metabólicos dos extratos investigados e das atividades biológicas observadas para estes. Havendo diferenças de atividades biológicas entre amostras, a segunda etapa envolve análises metabólicas mais detalhadas. Nesta fase, as técnicas de separação acopladas às espectrométricas de alto desempenho (essas técnicas serão discutidas mais adiante neste manuscrito), são realizadas para a obtenção das informações quali- e quantitativas sobre a maior quantidade possível de constituintes de cada amostra. Por exemplo, a comparação simples entre um extrato ativo e um extrato inativo pode indicar os metabólitos essenciais à atividade observada para o primeiro (aqueles associados aos sinais espectrométricos e/ou cromatográficos observados apenas na amostra ativa). Se a comparação envolver muitos extratos ativos e inativos em um ensaio específico, a possibilidade de localizar com mais precisão os compostos candidatos a princípios ativos (hits) aumenta significativamente, o que agiliza a pesquisa de descoberta de ativos da biodiversidade. Geralmente os ensaios metabolômicos geram uma quantidade grande de dados, que normalmente são analisados por ferramentas quimiométricas (envolvem métodos estatísticos).
O perfil metabólico característico deuma amostra é chamado de impressão digital ou fingerprint. 15,20 Assim, o fingerprint (quali e/ou quantitativo) de uma amostra com as características desejadas pode ser utilizado como referência para, por exemplo, avaliar o controle de qualidade de extratos vegetais ou para verificação da estabilidade de produtos acabados, sendo uma estratégia recomendada pela Organização Mundial da Saúde para o controle de qualidade de produtos fitoterápicos. 
O isolamento de substâncias em maiores quantidades geralmente é feito por cromatografia em coluna clássica, ou contra-corrente. Onde as alíquotas recolhidas são avaliadas por CCD, CLAE ou EC. E a elucidação estrutural das substâncias isoladas se dá por EM, que fornece a massa molecular da substância e também o padrão de fragmentação; e RMN, que indica o número de carbonos da amostra, bem como os tipos de ligação de H e correlação entre eles. 
O dicroísmo circular também é normalmente utilizado para determinação da configuração absoluta de enantiômeros. 
A polarimetria também é utilizada para diferenciação de enantiômeros. O equipamento mede o desvio da luz polarizada pela substância, definindo sua rotação específica. Podemos usar como exemplo a talidomida. Essa substância apresenta dois isômeros ópticos: a forma S que é levogira (roda o plano da luz polarizada no sentido anti-horário) e a R que é dextrogira (gira o plano no sentido horário). O S está associado a má formação de fetos, enquanto o R tem ação analgésica e sedativa.
É importante ressaltar que somente a associação dessas técnicas é capaz de permitir a elucidação estrutural absoluta de uma substância de origem vegetal.
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referências:
Farmacognosia da planta ao medicamento e site
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/analise-fitoquimica/56896
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/analise-fitoquimica/56896
Barbosa WLR, Quignard E, Tavares ICC, Pinto LN, Oliveira FQ, Oliveira RM. Manual para análise fitoquímica e cromatográfica de extratos vegetais. Universidade Federal Do Pará. Revista Científica da UFPA http://www.ufpa.br/rcientifica Vol 4, 2004.
http://www.scielo.br/pdf/qn/v36n10/19.pdf