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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ Departamento de Farmácia Laboratório de Biologia Farmacêutica PALAFITO Programa de Pós-Gradua ç ã o e mP C F C iênc ias Farmacêuticas Apostila Prática Métodos Cromatográficos Aplicados à Análise e Controle de Qualidade de Drogas Vegetais e Extratos Vegetais e Medicamentos Fitoterápicos Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello Maringá, 2018 Colaboradores na elaboração do material didático Ana Luiza Sereia André Oliveira Fernandes da Silva Cláudio Roberto Novello Daniela Cristina de Medeiros Danielly Chierrito João Carlos Palazzo de Mello Luana Magri Tunin Mariana Nascimento de Paula Mariane Roberta Ritter Naiara Cássia Gancedo Raquel Garcia Isolani SUMÁRIO Cromatografia em Papel .................................................................................... 4 Cromatografia em Camada Delgada .................................................................. 6 Cromatografia Líquida em Coluna .................................................................... 10 Cromatografia em Coluna Flash ....................................................................... 13 Cromatografia Líquida à Vacuo ........................................................................ 17 Cromatografia em Contracorrente .................................................................... 20 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................................... 24 Eletroforese Capilar .......................................................................................... 30 4 AULA 1 Cromatografia em Papel Introdução A Cromatografia em Papel (CP) é uma técnica utilizada para analisar pequenas quantidades de amostras, principalmente aplicada na separação e identificação de compostos polares, como açúcares, antibióticos hidrossolúveis, aminoácidos, pigmentos e íons metálicos. Nesta técnica, a separação dos componentes de uma mistura é baseada na migração diferencial nas fases estacionária (papel cromatográfico) e móvel (solvente puro ou mistura de solventes). O mecanismo de partição favorece a separação devido ao conteúdo de água intrínseco do papel, ou inibição seletiva do componente hidrofílico da fase líquida pelas fibras de papel. O cromatograma é desenvolvido pela passagem lenta da fase móvel sobre a fase estacionária. O desenvolvimento pode ser ascendente, no caso de solvente carreado para cima através de forças capilares, ou descendente, no caso em que o fluxo do solvente é auxiliado por força da gravidade. Procedimentos 1- Fase estacionária - Recortar papel filtro em quadrados de 5,0 cm x 5,0 cm; - Fazer uma linha suave a lápis a 0,5 cm do limite superior, e a 1,0 cm do limite inferior, onde deve ser marcado os pontos de aplicação das amostras, com 1,0 cm de distância das bordas laterais e entre eles. 2- Saturação da cuba cromatográfica - Colocar papel filtro nas paredes internas da cuba cromatográfica; - Adicionar a fase móvel (álcool) de modo que não ultrapasse 1 cm de altura; - Tampar a cuba e aguardar tempo necessário para que o eluente percorra todo papel filtro. 3- Aplicação da amostra - Utilizar 3 tintas diferentes de canetas esferográficas e aplicá-las na fase estacionária nos pontos determinados acima; 5 - Colocar na cuba cromatográfica; - Aguardar tempo necessário para que ocorra, por capilaridade, a separação dos componentes da mistura, ou seja, as cores das tintas das canetas esferográficas; - Retirar da cuba e secar. 4- Resultados - Anotar os valores do fator de retenção (Rf) de cada mancha observada. Figura 1. Representação do procedimento de Cromatografia em Papel. Referências Braibante, M. Cromatografia. Química Analítica Qualitativa Experimental. Disponível em: <http://w3.ufsm.br/laequi/wp- content/uploads/2012/07/Cromatografia.pdf>. Acesso em: 14 fev. 2018. Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos cromatográficos, 7ª Ed. Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Cromatografia em Papel, 5ª Ed., vol. 1. Oliveira, G.A., Silva, F.C, 2017. Cromatografia em papel: reflexão sobre uma atividade experimental para discussão do conceito de polaridade. Química Nova, 39(2):162-169. 6 AULA 2 Cromatografia em Camada Delgada Introdução A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais. A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura, por meio da migração diferencial das substâncias sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana, que constitui a fase estacionária. As vantagens desta técnica são: fácil compreensão e execução, separações rápidas, reprodutibilidade e baixo custo. Pode ser uma técnica analítica (qualitativa) ou preparativa (quantitativa). O processo de separação, normalmente é o de adsorção, podendo ocorrer também partição ou troca iônica, quando são utilizadas fase estacionárias tratadas. Entre os adsorventes disponíveis, ou seja, a fase estacionária, tem-se a sílica (SiO2), alumina (Al2O3), poliamida e celulose. A sílica é um dos adsorventes mais utilizados em cromatografia em camada delgada, sendo empregada na separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides e esteroides, usando o mecanismo de adsorção. Em alguns casos, pode ser necessário a ativação das placas. A sílica e alumina, podem ser ativadas em estufa a 105-110 ºC por 30-60 min. Outra etapa importante é a escolha da fase móvel, devendo ser considerado a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel, que pode ser pura ou uma mistura de solventes. As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, com o auxílio de capilares, utilizando solventes bem voláteis, que são facilmente eliminados após a aplicação e com a distância de 1 cm entre cada amostra. As placas são então colocadas em uma cuba, contendo a fase móvel cobrindo todo 7 o fundo da cuba em uma altura inferior a aplicação das amostras (~ 1 cm de FM). Junto às paredes da cuba são colocados pedaços de papel filtro que permitem que a fase móvel suba por ele e sature o interior da cuba (Figura 2). Figura 2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Após o desenvolvimento das cromatoplacas, as placas são secas e reveladas, para que seja possível visualizar as substâncias incolores presentes na amostra. Os métodos de revelação empregados podem ser físicos, não destrutivos (luz UV nos comprimentos de 254 nm e 366 nm, câmara de iodo, vapores de amônia) ou químicos, destrutivos (H2SO4, vanilina sulfúrica, cloreto férrico (FeCl3)), e, após alguns são aquecidos à 100-120 °C para que a reação cromogênica ocorra. Não se deve esquecer de marcar a distância percorrida pela fase móvel e pela amostra para realizar o cálculo do Rf (fator de retenção). O valorde Rf (Figura 3) é um parâmetro físico da substância que pode ser utilizado para a sua identificação, por exemplo, aplicando na mesma cromatoplaca, além da amostra, uma substância padrão. Para isso, algumas condições devem ser mantidas como a utilização da mesma fase móvel, fase estacionária, condições ambientais, espessura da camada de FE na cromatoplaca e quantidade de amostra aplicada. Cromatoplaca com amostra Cromatoplaca dentro da cuba Solvente Papel filtro Cromatografia em desenvolvimento Cromatografia concluída 8 Figura 3. Cálculo do Fator de Retenção (Rf). x: distância percorrida pela amostra e y: distância percorrida pelo solvente. Procedimentos Material vegetal: Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reissek., Celastraceae. Objetivo: realizar uma das etapas do controle de qualidade de M. ilicifolia, utilizando a técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para a identificação da espécie vegetal (Farmacopeia Brasileira, 2010). Materiais e Método: Utilizar sílica-gel F254, com espessura de 250 μm, como suporte, e mistura de acetato de etila, ácido fórmico e água (90:5:5; v/v), como fase móvel. Aplicar, separadamente, à placa, em forma de banda, 10 µL da Solução (1) e 3 µL da Solução (2), recentemente preparadas, como descrito a seguir: Solução (1): pesar exatamente cerca de 5 g da droga moída, acrescentar 50 mL de água e aquecer sob refluxo durante 15 min. Após resfriamento à temperatura ambiente, filtrar a solução obtida em algodão, sob pressão reduzida, transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com água destilada. Solução (2): pesar cerca de 1 mg de epicatequina SQR (substância química de referência) e dissolver em 1 mL de metanol. Desenvolver o cromatograma. Remover a placa e deixar secar em capela de exaustão. Examinar sob luz ultravioleta (254 nm). O cromatograma obtido com a Solução (1) apresenta uma mancha de coloração bordô, na mesma altura que a obtida no cromatograma da Solução (2) (Rf de aproximadamente 9 0,82). Em seguida, nebulizar a placa com vanilina sulfúrica SR (solução reagente) e deixar em estufa a 110 ºC, durante 10 min. Após a visualização deverão ser observadas na Solução (1) duas manchas de coloração bordô com Rf de aproximadamente 0,82 para epicatequina e 0,72 para banda bordô que aparece logo abaixo (Figura 4). Figura 4. Cromatografia em camada delgada das soluções 1 e 2 de Maytenus ilicifolia. Placa ativada (A); placa não ativada (B); ambas reveladas com vanilina sulfúrica. Amostra (vermelho), padrão (azul). Referências: Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 5ª Ed., vol. 2. Brasília. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm>. Acesso em: fev. 2018. Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 2006. Fundamentos de cromatografia. Campinas: Editora da UNICAMP, p. 452. A B 10 AULA 3 Cromatografia Líquida em Coluna Introdução A cromatografia líquida é dividida em dois grupos, cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta pressão. A cromatografia líquida clássica, que é realizada sob pressão atmosférica, com a vazão da fase móvel sendo a força da gravidade. A coluna consiste em um tubo de vidro vertical, com a extremidade superior aberta e a inferior afilada, terminando em uma torneira, permitindo o controle da vazão da fase móvel (Figura 5). A coluna será preenchida com um sólido (fase estacionária), que será suportado por um chumaço de algodão, lá de vidro ou placa de vidro sinterizada na parte inferior. O preenchimento da coluna deve ser feito da maneira mais uniforme possível para garantir maior eficiência da separação. O ar retido entre as partículas da fase estacionária, forma canais prejudicando a separação das substâncias. A fase estacionária deve ser misturada com a fase móvel e adicionada no topo da coluna, deixando que assente gradualmente. A fase móvel é responsável por promover o desenvolvimento dos componentes presentes na amostra. A seleção desse eluente é feita levando em consideração o poder eluente dos solventes, ou seja, de acordo com a habilidade de dessorver da fase estacionária as substâncias nele fixadas. 11 Figura 5. Coluna Cromatográfica - Fase estacionária Sephadex LH-20. Procedimentos a. Preparação da coluna: Em uma bureta de 20 mL, com a torneira fechada, colocar um pequeno chumaço de algodão embebido na fase móvel com um bastão de vidro, até o acomodar na conexão do corpo da bureta com a torneira (o algodão não deve ficar muito comprimido para não prejudicar a vazão). Adicionar 1/3 da fase móvel na bureta. Em seguida adicionar a suspensão da fase estacionária na fase móvel. Abrir a torneira e deixar o líquido escoar e a fase estacionária se sedimentar. Após toda a fase estacionária estar dentro da coluna, passar 2 ou 3 vezes o volume da fase móvel para acertar o enchimento. b. Preparação da fase móvel: Gradiente 1: Metanol: TFA: água – 19,8: 0,2: 80,0 (v/v) Gradiente 2: Metanol: TFA: água – 69,8: 0,7: 29,5 (v/v) c. Preparação da amostra: Preparar o extrato bruto de Juçara (Euterpe edulis Mart.) em água. 12 d. Procedimento: Com a torneira da coluna fechada, adicionar a amostra cuidadosamente a amostra no topo da coluna, para que não formem buracos na fase estacionária. Adicionar com cuidado alguns mL da fase móvel e abrir a torneira para começar a eluição. Adicionar mais fase móvel, recolhendo frações a cada 5 mL. Referências Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 2006. Fundamentos da Cromatografia. Campinas, SP: Editora Unicamp. 13 AULA 4 Cromatografia em Coluna Flash Introdução A cromatografia é um método físico-químico de separação fundamentado na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas de síntese (COLLINS, et al., 1997; DEGANI, et al. 1998). Dentre as mais diversas formas de cromatografia, temos o sistema flash, um tipo particular de cromatografia em coluna. Na cromatografia em coluna, usamos um suporte sólido (fase estacionária), acondicionado em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. O adsorvente, comumente sílica gel 60, possui partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razoável do solvente através da coluna. O uso de sílica de partícula menor (230- 400 mesh) para essas colunas, requer a utilização de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo este sistema conhecido como cromatografia flash. Este sistema utiliza baixas pressões de ar ou nitrogênio gasoso pressurizados no topo da coluna para impelir a fase móvel através da fase estacionária com um fluxo adequado, uma vez que a pressão atmosférica geralmente não é suficiente. O controle do fluxo da coluna é obtido controlando-se a pressão do gás. São utilizadas colunas de pequeno porte para obter separações mais rápidas que nas colunas ordinárias e com menor difusão dos componentes da mistura. É uma técnica que pode oferecer resolução, reprodutibilidade, e garantir a purificação rápida de misturasa níveis aceitáveis, desde que o fator de retenção (Rf), determinado por CCD, seja igual ou superior a 0,15 (SILVA et al. 2015; RANI et al., 2014; STEVENS JUNIOR; HILL, 2009; DEGANI, et al. 1998). O objetivo desta aula é utilizar a cromatografia flash para separar os pigmentos de pimentões vermelhos. O pimentão (Capsicum annuum L.) é uma 14 planta da família Solanaceae, cuja cor depende da capacidade de sintetizar carotenoides e de reter pigmentos de clorofilas. Os pimentões verdes e amarelos devem sua coloração principalmente à presença de carotenos e de carotenoides oxigenados, tais como as criptoxantinas. Nos pimentões vermelhos, há também carotenoides polioxigenados, tais como as capsantinas e capsorubina. São encontrados na natureza vários derivados da capsantina, sobretudo derivados epoxidados, e os carotenoides hidroxilados ocorrem na natureza sob a forma de ésteres (RIBEIRO e NUNES, 2008). Procedimentos 1- Obtenção dos extratos Picar 30 g de pimentões vermelhos em pedaços pequenos. Adicionar 10 mL de acetona e 50 mL de hexano. Triturar com auxílio de gral de porcelana com pistilo, e deixar em repouso por 1 h. Após, filtrar a mistura em funil comum, com papel de filtro pregueado. Em seguida separar a fase aquosa dos filtrado em funil de separação. Adicionar sulfato de sódio anidro na fração hexânica. Filtrar e concentrar até o volume final de aproximadamente 1 mL. 2- Preparação da fase móvel Preparar 200 mL de uma mistura de hexano/acetona (70:30) em uma proveta com tampa. Agitar a mistura. 3- Empacotamento da coluna Prepare uma coluna para cromatografia flash utilizando silica gel 60 (230- 400 mesh) como fase fixa, da seguinte maneira: agite com um bastão em um béquer, 15 a 20 g de silicagel no eluente inicial (fase móvel), até obter uma pasta fluida, homogênea e sem bolhas de ar incluídas. Encha a terça parte da coluna cromatográfica com a fase móvel e derrame, então, a pasta fluida de silicagel, de modo que ela sedimente aos poucos e de forma homogênea. Caso haja bolhas de ar oclusas na coluna, golpeie-a suavemente, de modo a expulsá-las. Controle o nível do solvente abrindo ocasionalmente a torneira da coluna, e/ou adicionando pressão de ar ou nitrogênio no topo da coluna. Terminada a preparação, o nível de eluente deve estar 1 cm acima do topo da coluna. 15 4- Aplicação da amostra e separação dos componentes Distribua a fração hexânica de pimentão homogeneamente sobre o topo da coluna, com auxílio de uma pipeta ou conta-gotas. Abra a torneira e, após a adsorção pela coluna, proceda a eluição com a fase móvel, vertendo cuidadosamente o eluente pelas paredes internas da coluna, tomando cuidado para não causar distúrbios ou agitação na coluna. Ao mesmo tempo, abra a torneira para escoar o solvente e adicione pressão, ajustando cuidadosamente o fluxo. Elua a coluna, coletando as frações em tubos de ensaio, até que toda a amostra seja separada (Figura 6). Figura 6. Representação do procedimento de Cromatografia Flash. (Adaptado de: Chemistry Olympiad. Problemas Experimentais. 12 de Julho de 2011. Ankara, Turkey) Referências Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos cromatográficos. 7ª Ed. Degani, A.L.G., Cass, Q.B., Vieira, P.C., 1998. Cromatografia um breve ensaio, Química Nova na Escola, n.7. 16 Rani, E.M., Shilpa, K., Rao, V.U., 2014. Flash chromatography and its advancement: an overview. International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis, 4: 328-334. Ribeiro, N.M., Nunes, C.R., 2008. Análise de Pigmentos de Pimentões por Cromatografia em Papel. Química Nova na Escola, 29. Silva, L.M.A.E, Ribeiro, P.R.V.; Rodrigues, T.H.S.; Brito, E.S. de, Canuto, K. M., Zocolo, G.J. Uso da cromatografia flash para a separação dos principais componentes do líquido da castanha-de-caju técnico, em escala preparativa. Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical, 2015. Páginas: 6 p. Série: (Embrapa Agroindústria Tropical. Comunicado Técnico). Stevens Jr.W.C., Hill, D.C., 2009. General methods for flash chromatography using disposable columns. Molecular Diversity, 13:247-252. 17 AULA 5 Cromatografia Líquida à Vacuo Introdução A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais. O isolamento de substâncias a partir de drogas vegetais pode ser realizado empregando-se métodos cromatográficos, sendo a cromatografia em coluna a mais utilizada. A Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV), uma variante da cromatografia em coluna, foi proposta inicialmente por Targett et al. (1979), como método alternativo com finalidade de separação de pequenas e grandes quantidades de misturas de substâncias. A CLV é uma técnica eficiente e de baixo custo, podendo ser empregada com fins analíticos qualitativos ou mesmo quantitativos. Uma etapa importante na realização de qualquer método cromatográfico é a escolha da fase estacionária e da fase móvel, devendo ser considerado a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase estacionária e móvel, sendo que a última pode ser pura ou uma mistura de solventes. Procedimento Material vegetal: cascas secas e cominuídas de Croton floribundus Spreng., Euphorbiaceae. Objetivo: realizar o fracionamento do extrato bruto de acetato de etila das cascas de C. floribundus, utilizando a técnica de Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV). Materiais e Método: Utilizar uma coluna de vidro (d= 1,5 cm; h= 32,5 cm) acoplada com compressor de ar (sistema de vácuo). Empacotar a coluna com o gel de sílica 60 (FE) (70-230 Mesh ASTM, Merck), preenchendo 2/3 do volume da coluna. Aplicar a fórmula v=π.r2.h para descobrir o volume da coluna (DICA: 18 sabe-se que para uma coluna com volume de 25 mL, utilizam-se 10g de FE). Reservar ¼ de FE para preparar a amostra. Para o preparo da amostra, pesar 0,2 g de extrato bruto e misturar com ¼ de FE, homogeneizando em grau de vidro com diclorometano. Esperar a mistura amostra/FE secar totalmente, e após, solubilizar com o primeiro solvente da FM e aplicar na coluna já empacotada e estabilizada com o primeiro solvente da FM. Fase Móvel: n-hexano; n-hexano: acetona (5:5, v/v); acetona; acetona: metanol (5:5, v/v); metanol, metanol: água (5:5, v/v); água. Preparo do extrato bruto: pesar 5 g da droga moída, acrescentar 50 mL de acetato de etila (1:10, p/v) e realizar a extração utilizando o aparelho de Ultra- turrax® (turbólise) durante 15 min, com pausas de 5 min. Após filtrar a solução obtida em algodão, sob pressão reduzida, transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com acetato de etila (extrato bruto, EB). Concentrar o EB sob pressão reduzida e liofilizar. Acondicionar em frasco hermeticamente fechado em freezer a -20 ºC até o momento de uso. Figura 7. Cromatografia Líquida à Vácuo - Extrato bruto acetato de etila de Croton floribundus. 19 Referências: Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S. Fundamentos de cromatografia. Campinas: Editorada UNICAMP, 2006. 452p. Saito, E., Furlan, C., Lopes, G.C., Mello, J.C.P. A cromatografia líquida a vácuo na análise qualitativa e quantitativa de flavonoides em Achyrocline satureioides. Revista Fitos, 1(1), 2005. 20 AULA 6 Cromatografia em Contracorrente Introdução Na cromatografia em contracorrente a separação ocorre por um processo conhecido como partição líquido/líquido, pois ambas as fases (móvel e estacionária) são líquidas (BERTHOD, 1991). A ausência de suportes sólidos pode evitar uma possível adsorção irreversível da amostra e a degradação de substâncias ativas, presentes na mesma (MARSTON; HOSTETTMANN, 1994), e possibilita a injeção de uma quantidade significativa de amostra, não sendo necessária sua pré-purificação. Possui como vantagem pouca perda de amostra, assim como um baixo consumo de solventes orgânicos (MANDAVA; ITO, 1998). A eficiência dessa técnica está relacionada com a definição ideal do sistema eluente a ser utilizado (CONWAY, 1989). Existem três tipos de cromatógrafo em contracorrente: 1) Contracorrente em gotas ("DCCC: Droplet Counter-Current Chromatography"): gotas da fase móvel passam pela fase estacionária, assim, o soluto é particionado entre as duas fases imiscíveis. Colunas de vidro dispostas verticalmente e em série, são acopladas uma a outra por tubos de teflon. A fase móvel é administrada de forma ascendente ou descendente, dependendo de sua densidade se comparando com a fase estacionária. Nesta técnica utiliza-se sistema eluente ternário ou quaternário. O uso de sistema binário quase não ocorre, pois o uso de um sistema eluente com três ou mais solventes diferentes, ajuda a diminuir a diferença de polaridade entres as duas fases, como também, possibilita uma maior seletividade do sistema (MARSTON; HOSTETTMANN,1994). 2) Contracorrente Locular Rotacional ("RLCC: Rotation locular Counter-Current Chromatography"): o equipamento é composto por 16 colunas, em geral de vidro, cada uma possui 16 compartimentos e ficam posicionadas ao redor de um eixo rotacional, no qual seu ângulo de inclinação e sua velocidade rotacional podem variar (SNYDER et al., 1984). As análises podem ocorrer de forma ascendente ou descendente. Em relação à técnica 21 acima descrita, a RLCC, possui baixa resolução, porém, existem estudos que descrevem o seu uso em separações de substâncias naturais (DOMON et al., 1982; KUBO, 1991). 3) Contracorrente de Alta Velocidade (CCCAV) ("HSCCC: High-Speed Counter-Current Chromatography"): é o método em contracorrente mais usado para a separação de produtos naturais. Possui uma bobina de tubo de teflon enrolada, em formato espiral, em multicamadas. Ao redor de um eixo central apresenta uma coluna, na qual se induz um movimento de natureza rotacional e translacional ou planetária, em alta velocidade ou cerca de 800 rpm. Esse movimento planetário exerce duas importantes funções para que ocorra uma separação eficiente: um mecanismo de rotação do sistema eluente livre de interferentes, de modo que a fase móvel flui continuamente através da coluna de separação e a segunda que realiza um movimento hidrodinâmico do sistema eluente no interior da coluna, quando as duas fases (móvel e estacionária), que são dois líquidos imiscíveis, são injetadas em uma das extremidades da coluna, a rotação separa por completo as duas fases ao longo da coluna, à medida que a fase mais leve ocupa a região chamada cabeça e a fase mais pesada ocupa a região chamada cauda (ITO,2005). Comumente encontram-se sistemas eluentes compostos por três (ternário) ou quatro (quaternário) solventes diferentes, isso para proporcionar uma separação mais eficiente (SANTOS; MELLO, 2007). Neste método a fase estacionária fica retida dentro do equipamento por uma força centrífuga, enquanto que, a fase móvel percorre todo o conjunto a uma vazão de cerca de 1,0 mL/min dependendo do sistema, garantido assim, um menor tempo de trabalho, em relação às outras técnicas de contracorrente. A CCCAV possui algumas vantagens se comparado aos outros métodos de contracorrente, tais como, menor tempo na realização da análise e menor consumo de solventes (MARSTON; HOSTETTMANN, 1994). Equipamento utilizado no laboratório Palafito O cromatógrafo em contracorrente de alta velocidade (CCCAV) utilizado no laboratório Palafito foi manufaturado nas dependências da Universidade Estadual de Maringá e é equipado com coluna de politetrafluoroetileno (PTFE) 22 de 2,5 mm de diâmetro interno, possuindo capacidade total de 325 mL, injetor com capacidade de 10 mL de amostra e bomba de solvente de duplo pistão, com capacidade de vazão máxima de 10 mL/min (Figura 7). O sistema eluente deve ser previamente estabelecido de acordo com as características da amostra, como também por semelhança de polaridade das substâncias presentes na amostra e a polaridade do sistema eluente. Procedimentos Entre 100 e 300 mg de uma subfração obtida a partir da fração acetato de etila, da Trichilia catigua (catuaba), obtidas a partir de coluna clássica, podem ser injetadas na coluna do equipamento, respeitando a capacidade total da mesma (325 mL). Serão coletadas alíquotas em tubos de ensaios sempre com volume definido (cerca de 5 mL), as quais serão monitoradas por CCD e reunidas por semelhança cromatográfica. A vazão da fase móvel deverá ser determinada para cada amostra individualmente, variando entre 0,7 a 1,0 mL/min (RESENDE, 2007). Figura 8. Equipamento CCCAV. A. Coletor com tubos; B. Sistema CCCAV (Contrapeso e coluna); C. Bomba purificadora de amostras. Fonte: Letícia Maria Krzyzaniak, 2015. Referências Berthod, A., 1991. Practical approach to high-speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography, 550:677-693. Conwa, Y.W.D., 1989. Countercurrent Chromatography: Apparatus, Theory and Application. VCH: Weinheim. 23 Domon, B., Hostettmann, K., Kovacevic, K., Prelog, V., 1982. Separation of the enantiomers of (±)-norephedrine by rotation locular counter-current chromatography. Journal of Chromatography, 250:149-151. Ito, Y., 2005. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography A, 1065:145-168. Kubo, I., 1991. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. Journal of Chromatography A, 538:187-191. Mandava, N.B.; Ito, Y., 1998. Countercurrent Chromatography - Theory and practice, Marcel Dekker: New York. Marston, A.; Hostettmann, K., 1994. Counter-current chromatography as a preparative tool - applications and perspectives. Journal of Chromatography A, 654:315-341. Resende, F.O., 2007. Trichilia catigua: avaliação farmacognóstica, fitoquímicaebiológica in vitro, Ciências Farmacêuticas. Universidade Estadual de Maringá, Maringá. Santos, S.C.; Mello, J.C.P. Taninos, 2007. In: SIMÕES, C.M.O. et al. (Org.). Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Porto Alegre, Florianópolis: Editora da UFSC e Editora da UFRGS. Snyder, J.K.; Nakanishi, K.; Hostettmann, K.; Hostettmann M., 1984. Applications of rotation locular counter-current chromatography in natural products isolation. Journal of Liquid Chromatography, 7:243. 24 AULA 7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Introdução A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica amplamente empregada para caracterização e análises quantitativasde diferentes amostras, sejam elas biológicas, sintéticas ou de material vegetal (FERNANDEZ et al., 2009). Na fitoquímica o método pode ser utilizado para o isolamento de substâncias, assim como, para o controle de pureza de compostos isolados. A CLAE também permite a caracterização e a análise quantitativa dos marcadores químicos em extratos vegetais, possibilitando a criação de um perfil cromatográfico da espécie em estudo, sendo este, um parâmetro comparativo para se detectar diferenças e semelhanças entre extratos obtidos nas mesmas condições de extração e análise, sendo esta uma das formas de se manter um padrão de qualidade dos extratos (HENDRIKS, et al., 2005). O método de análise por CLAE tem como princípio a interação diferenciada dos componentes da amostra com uma fase estacionária (sólida) e uma fase móvel (líquida). Os sinais analíticos das substâncias presentes na amostra são identificados com auxílio de detectores apropriados, que aumentam consideravelmente a sensibilidade e a seletividade na análise das substâncias de interesse, tais como, o detector ultravioleta (UV), detector de arranjo de diodos (DAD) e o espectrômetro de massas (EM) (DINELLI, et al., 2009). Dentre as principais vantagens do método de análise por CLAE destacam- se a rapidez e desempenho analítico satisfatórios, automação, análises qualitativas e quantitativas e sistema de alta pressão (coluna analítica e fase móvel). Num sistema ideal de CLAE (Figura 8) a fase móvel (FM) deve ser bombeada sob pressão para dentro da coluna (200-300 atm) e para não sacrificar a eficiência, a velocidade da FM deve ser constante. As colunas não devem ser grandes para evitar excessivas diferenças entre as pressões da FM na entrada e na saída da coluna. Como as colunas são pequenas, o material de empacotamento (enchimento) destas colunas deve ter grande superfície e uniformidade (partículas de 5-50 µm de diâmetro). A amostra a ser injetada na 25 coluna deve ser pequena (10-500 µL) para permitir boas resoluções, o que torna crítico o sistema de detecção. A aplicação da amostra é problemática: é praticamente impossível injetar, com seringa, uma amostra num líquido que está a uma pressão de 30 atm na cabeça da coluna. Como esta pressão é quase o mínimo com que se trabalha em CLAE, é comum o uso de válvulas de injeção, contornando assim este problema. É importante explicar operacionalmente o termo eficiência a fim de justificar o nome CLAE. A eficiência de um sistema cromatográfico se traduz por picos agudos no cromatograma. Todos os sistemas de CLAE possuem esta característica, o que lhe assegura, invariavelmente, excelentes Resoluções (capacidade de separar componentes). Figura 9. Esquema simplificado dos componentes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência. 26 Figura 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiência - Laboratório Palafito, bloco K80. Figura 11. Cromatógrafo líquido de alta eficiência (Thermo) - Laboratório Palafito, bloco T22. 27 Sistemas cromatográficos utilizados para a espécie Euterpe edulis Mart. (Juçara): 1. Sistema para isolamento da substância Cianidina-3-O-rutinosídeo: (Fossen, et al., 2000) Sephadex LH-20 Metanol : TFA : Água Gradiente 1 19,8 : 0,2 : 80,0 (v/v) Gradiente 2 69,8 : 0,7 : 29,5 (v/v) - Extrato: Fase Móvel = 1:1 (3,0 g: 3,0 L) - Proporção solvente: Fase móvel 1: Fase móvel 2 = 0,25:0,75 (v/v) - Proporção tempo: Fase móvel 1: Fase móvel 2 = 0,3:0,7 (v/v) OBS.: Fase móvel 1 usada até eluição total da substância que está em menor quantidade e que forma inicialmente como um anel bem definido na parte superior da coluna, esta substância elui por todo volume da coluna (correspondendo a aproximadamente 25% do total de fase móvel) em seguida a fase móvel 1 é substituída pela 2 para eluição da substância de interesse (Cianidina-3-O-rutinosídeo). - Preparar o extrato bruto em água destilada na proporção 40 mg/mL. *O extrato é altamente solúvel em água sendo necessário somente auxílio de bastão de vidro para homogeneização. 2. Sistema cromatográfico para CLAE: Fase estacionária: Coluna Gemini 5 μm RP-18 (150 mm×4.6 mm) Vazão: 0,4 mL/min Detecção em 520 nm Injeção: 10 µL Extrato bruto: 500 mg/mL metanol 20% 28 Tempo (min) A (água + 0,25% de ácido fórmico) B (metanol + 0,25% de ácido fórmico) 0 90% 10% 5 80% 20% 13 75% 25% 20 60% 40% 30 55% 45% 34 30% 70% 38 90% 10% 40 90% 10% 44 90% 10% Referências Borges, G.S.C., Vieira, F.G.K., Gonzaga, C.C.L.V., Zambiazi, R.C., Filho, J.M., Fett, R., 2011. Chemical characterization, bioactive compounds, and antioxidant capacity of jussara (Euterpe edulis) fruit from the Atlantic Forest in southern Brazil. Food Research International, 44:2128-2133. Março, P.H, Poppi, R.J. Procedimentos Analíticos para identificação de antocianinas presentes em extratos naturais. Química Nova, 31(5):1218- 1223, 2008. Dinelli, G., Carretero, A.S., Di Silvestro, R., Marotti, I., Fu, S., Benedettelli, S., Ghiselli, L.; Gutierrez, A.F., 2009. Determination of phenolic compounds in modern and old varieties of durum wheat using liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216:7229-7240. Fernandez, R. S., et al., 2009. Validação do método de extração e quantificação de 7-hidróxi- 4’,6-dimetóxi-isoflavona em culturas de células em suspensão e calos de Dipteryx odorata. Eclética Química, 34(1). Fossen, T.; Slimestad, R.; Ovstedal, D.O.; Andersen, O.M., 2000. Covalent anthocyanin -flavonol complexes from flowers of chive, Allium schoenoprasum. Phytochemistry, 54:317-323, 2000. 29 Hendriks, M.M.W.B., et al., 2005. Preprocessing and exploratory analysis of chromatographic profiles of plant extracts. Analytica Chimica Acta, 545:53- 64. 30 AULA 8 Eletroforese Capilar Introdução A eletroforese foi primeiramente descrita por Tiselius na década de 30, que definiu a técnica como a migração de espécies eletricamente carregadas em um condutor líquido, sob a ação de um campo elétrico. Tal técnica foi denominada “eletroforese de fronteira móvel” (Tavares, 1996). Atualmente, a separação de substâncias em técnicas de eletroforese se dá por diferenças de mobilidades eletroforéticas, partição de fase, pH, tamanho molecular, ou a combinação de uma ou mais dessas propriedades (Kvasnicka, 2007). A Eletroforese Capilar (EC) representa uma fusão das tecnologias derivadas da eletroforese tradicional e da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e permite a separação de moléculas baseada na migração dessas espécies por meio de um fluido sobre a influência de um campo elétrico. O fluido, conhecido como tampão de corrida, é uma solução que mantém o pH e fornece condutividade suficiente para permitir a passagem da corrente necessária para a separação. Esta técnica tem se sobressaído nas últimas décadas por sua automação, reprodutibilidade e confiabilidade e apresenta vantagens como alta eficiência, alta resolução, alta seletividade, curto tempo de análise, baixo consumo de reagentes, pequeno volume de amostra, boa recuperação e menor custo quando comparada à CLAE (Baker, 1995; Chu et al., 2008; Evans & Stalcup, 2003; Heegaard et al., 1998; Hu & Martin, 1999; Lunte et al., 2002; Mello & Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). O sistema de EC (Figura 12) consiste em um capilar de sílica fundida, com 10 a 120 cm de comprimento e 5 a 100 µmde diâmetro interno, preenchido com um tampão e colocado entre dois reservatórios com eletrodos imersos no tampão. Uma fonte de energia de alta voltagem é utilizada para aplicar um campo elétrico através do capilar de até 30 kV e corrente elétrica de 0 a 300 µA. Em polaridade normal, a carga na parede interna do capilar, provoca o fluxo eletro-osmótico na direção do ânodo (eletrodo positivo, onde a amostra é aplicada) para o cátodo (eletrodo negativo, onde a amostra é analisada). A detecção pode ser realizada diretamente no capilar (on-line) em tempo real, criando-se uma janela óptica pela remoção de uma pequena parte do 31 revestimento de poliamida do capilar. Os detectores comumente utilizados são por ultravioleta (UV), espectrofotometria de massas (EM) e fluorescência induzida por laser. A injeção da amostra pode ser realizada por duas formas: eletrocinética ou sifonamento (Heegaard et al., 1998; Hu & Martin, 1999; Linhardt & Toida, 2002; Lunte et al., 2002; Mello & Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). Figura 12. Representação esquemática do sistema de Eletroforese Capilar (EC). Fonte: Mello & Ito, 2011. No capilar, os analitos migram baseados na combinação entre as forças eletroforética e eletro-osmótica. Esta última controla a velocidade e a resolução da separação. Em geral, os íons positivos (cátions) migram primeiro, seguidos pelos compostos neutros e, finalmente, os íons negativos (ânions) (Guterres, 2005; Hu & Martin, 1999; Linhardt & Toida, 2002; Lunte et al., 2002; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). Os modos utilizados de EC são eletroforese capilar em gel (ECG), eletroforese capilar de zona (ECZ), cromatografia capilar eletro-osmótica (CCE), cromatografia capilar eletrocinética micelar (CCEM), focalização isoelétrica capilar (FIC) e isotacoforese capilar (ITFC) (Baker, 1995; Guterres, 2005; Hu & Martin, 1999; Mello & Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). Dentre os modos, a ECZ destaca-se como a mais reprodutível (Weinberger, 1993) e utilizada, devido ao seu poder de separação, versatilidade e simplicidade de operação (Guterres, 2005; Hu & Martin, 1999; Wang, 2000). Os tampões normalmente empregados são fosfato, borato, citrato ou fosfato-borato, em altas concentrações, por apresentarem melhor capacidade tamponante e reduzirem a 32 adsorção de analitos à parede do capilar, principalmente em análises de amostras biológicas (Tagliaro et al., 1998). A EC aplica-se à análise de uma variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, substâncias hidro ou lipossolúveis, metabólitos, aminoácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, carboidratos, poluentes ambientais, nucleosídeos e nucleotídeos, fármacos, catecolaminas, peptídeos, proteínas, biomarcadores, herbicidas, drogas, biopolímeros e extratos vegetais (Baker, 1995; Evans & Stalcup, 2003; Heegaard et al., 1998; Hu & Martin, 1999; Lunte et al., 2002; Mello & Ito, 2011; Sereia et al., 2017; Tagliaro et al., 1998). Procedimentos Soluções eletroforéticas Água ultrapura (Milli-Q Water System); Metanol grau HPLC; Ácido Clorídrico (HCl) 1 mol/L (para condicionamento de capilares novos); Hidróxido de sódio 1 mol/L; Solução tampão borato 80 mmol: Preparar solução de tetraborato de sódio (A) e ácido bórico (B) a 80 mmol. Utilizando um pHmetro, adicionar 2 mL da solução A e 8 mL da solução B, ajustar o pH para 8,8; Solução amostra 1 mg/mL. Preparo de amostra Pesar 10 mg da amostra, adicionar em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com metanol 20%. Posteriormente as amostras devem ser submetidas a extração em fase sólida (SPE) utilizando cartucho C18 de 3 mL (Agilent SampliQ - Agilent Technologies), previamente condicionado com metanol e água ultrapura. Caso o limite de detecção do equipamento seja ultrapassado deve-se ajustar a concentração da amostra. A solução amostra, tampões de corrida e soluções de limpeza devem ser filtradas em membrana 0,45 µm (Merck Millipore – HAWP 01300). 33 Procedimento Preparar 3 vials de 1,8 mL contendo tampão, 2 com água ultrapura, 2 com solução de limpeza de NaOH 1 mol/L e 4 vials vazios para secagem e descarte. Primeiramente deve ser realizada a sequência de limpeza do capilar, previamente programa no equipamento. Essa sequência deve ser realizada sempre entre amostras diferentes. Em caso de capilares novos, deve ser realizado o condicionamento prévio com HCl 1 mol/L por 20 min, com posterior sequência de lavagem. Ao final dos trabalhos, deve ser realizada a sequência de enxague final, com passagem de ar para secagem do capilar. Condições Eletroforéticas As corridas serão realizadas em Sistema de Eletroforese Capilar Beckman P/ACETM MDQ, equipado com detector UV/Vis (Figura 13) com Software Karat 8.0. Será utilizado capilar de sílica fundida (Beckman-Coulter), com comprimento total de 60,2 cm e efetivo de 50,0 cm, diâmetro interno de 50 µm. As amostras serão injetadas hidrodinamicamente a 5 psi durante 5 s. O comprimento de onda utilizado será de 214 nm, voltagem de 30 kV com tempo de corrida de 10 min. Figura 13. Sistema de Eletroforese Capilar Beckman P/ACETM MDQ. 34 A aquisição dos dados se dá em tempo real, e os eletroferogramas (Figura 12) também ficam salvos na pasta de sua escolha, indicada no momento da programação das corridas. Figura 14. Eletroferograma da fração acetato de etila de Trichilia catigua. (Sereia, 2017). Referências Baker, D.R., 1995. Capillary Electrophoresis. John Wiley & Sons, Inc., New York. Chu, Q., Lin, M., Yu, X., Ye, J., 2008. Study on extraction efficiency of natural antioxidant in coffee by capillary electrophoresis with amperometric detection. European Food Research Technology, 226:1373-1378. Evans, C.E., Stalcup, A.M., 2003. Comprehensive strategy for chiral separations using Sulfated Cyclodextrins in Capillary Electrophoresis. Chirality, 15:709- 723. Guterres, S.B., 2005. Estudo dos extratos dos frutos de Sapindus saponaria enriquecidos em saponinas e outros glicosídeos e sua aplicação em eletroforese capilar, Química Analítica. Instituto de Química de São Paulo, Universidade de São Paulo, São Carlos, p. 90. Heegaard, N.H.H., Nilsson, S., Guzman, N.A., 1998. Affinity capillary electrophoresis: important application areas and some recent developments. Journal of Chromatogaphy B, 715:29-54. Hu, B., Martin, L.M., 1999. Capillary electrophoresis of peptides and proteins, in: Millner, P.A. (Ed.), High resolution chromatography: a practical approach. Oxford University Press, New York, pp. 77-116. Kvasnicka, F., 2007. Application of CE in hydrodynamically closed systems for analysis of bioactive compounds in foods. Electrophoresis, 28:3581-3589. 35 Linhardt, R.J., Toida, T., 2002. Ultra-high resolution separation comes of age. Science, 298:1441-1442. Lunte, S.M., Martin, R.S., Lunte, C.E., 2002. Capillary Electrophoresis/Electrochemistry, in: Brajter-Toth, A., Chambers, J.Q. (Eds.), Electroanalytical methods for biological materials. Marcel Dekker, Inc., New York, p. 461-490. Mello, J.C.P., Ito, L.A., 2011. Aplicação da eletroforese capilar na análise de produtos naturais, in: Souza, G.H.B., Mello, J.C.P., Lopes, N.P. (Eds.), Revisões em processos e técnicas avançadas de isolamento e determinação estrutural de ativos de plantas medicinais. Editora UFOP, Ouro Preto, p. 209- 242. Sereia, A.L., Longhini, R., Lopes, G.C., Mello, J.C.P., 2017. Capillary electrophoresis as tool for diastereomericseparation in a Trichilia catigua fraction. Phytochemical Analysis, 28:144-150. Tagliaro, F., Manetto, G., Crivellente, F., Smith, F.P., 1998. A brief introduction to capillary electrophoresis. Forensic Sci. Int. 92:75-88. Tavares, M.F.M., 1996. 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