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SISTEMA ABO, TIPAGEM SANGUÍNEA E OUTROS SISTEMAS IMPORTANTES
INTRODUÇÃO
De acordo com dados disponibilizados pelo Ministério da Saúde, a discussão acerca da compatibilidade sanguínea é relativamente antiga. Por volta de 1900, um médico chamado Karl Landsteiner constatou que quando amostras de sangue de determinadas pessoas eram misturadas, as hemácias se juntavam, formando aglomerados semelhantes a coágulos. A partir disso, verificou-se que determinadas pessoas têm sangues incompatíveis e pesquisas posteriores revelaram a existência de diversos grupos sanguíneos na população. Em 1910 Von Dungern e Hirchfeld confirmaram que a herança genética do A e B obedeciam às leis de Mendel, com a presença do A e B como dominantes. Sendo então o Sistema ABO o primeiro a ser descrito. 
Dentre os sistemas conhecidos, o ABO é o mais importante na medicina transfusional, seguido pelo sistema Rh, porém é importante ressaltar que existem outros sistemas relevantes, tais como o Kell, Kid, Duffy, Lewis e MNS.
O sistema ABO consiste em três genes alelos: A, B e O. Diferentes antígenos podem ser componentes do glicocálice da membrana plasmática das hemácias. E é com base na ausência ou na presença de determinado antígeno que se pode determinar o grupo sanguíneo apresentado por um indivíduo.
O sistema Rh é o mais complexo dos sistemas eritrocitários, foi descoberto em 1939, por Levine e Stetson, e é o segundo mais importante, depois do sistema ABO, na medicina transfusional. 
Atualmente as pessoas têm a possibilidade de descobrir rapidamente a qual grupo de sangue pertencem através da tipagem sanguínea, que é um processo que utiliza a amostra de sangue do paciente e faz testes rápidos de compatibilidade através do uso de reagentes específicos. 
DESENVOLVIMENTO
SISTEMA ABO
Consiste em três genes alelos: A, B e O. Os dois primeiros genes (A e B) controlam a síntese de enzimas específicas responsáveis pela adição de um único resíduo de carboidrato (N-acetil-galactosamina no grupo A e D-galactose no grupo B) em uma glicoproteína básica antigênica ou em um glicolipídio com terminal açúcar de L-frucose no eritrócito, conhecida como substância H. O gene O é amorfo e por conta disso não transforma a substância H. (HOFFBRAND, A.V; 2013). 
De forma geral, existem dois tipos de aglutinogênio ou antígeno – A e B – e dois tipos de aglutinina ou anticorpo – anti-A e anti-B. Pessoas do grupo A possuem aglutinogênio A nas hemácias e aglutinina anti-B no plasma; as do grupo B têm aglutinogênio B nas hemácias e aglutinina anti-A no plasma; pessoas do grupo AB têm aglutinogênios A e B nas hemácias e nenhuma aglutinina no plasma; já as do grupo O não apresentam aglutinogênios nas hemácias, mas possuem os anticorpos anti-A e anti-B no plasma. E de acordo com esses pressupostos é possível entender brevemente o princípio da doação de sangue. A imagem a seguir foi disponibilizada pelo curso de licenciatura em ciências da USP e esquematiza o que foi abordado anteriormente. 
Tabela 1 – antígenos e anticorpos. 
Fonte: https://midia.atp.usp.br/plc/plc0030/impressos/plc0030_top03.pdf
É importante ressaltar que os antígenos do Sistema ABO não são restritos à membrana eritrocitária, mas também estão presentes na saliva e em outros líquidos biológicos, exceto fluido espinhal. A presença de substância ABO específica nos líquidos biológicos ocorre em indivíduos que apresentam o gene secretor (Se) – 80% das pessoas. (Ministério da Saúde, 2014). Segundo Batissoco AC et al (2013), diferentes níveis de expressão de antígenos A ou B nos eritrócitos podem ser encontrados, sendo chamados de subgrupos de A ou B, conforme a intensidade de aglutinação dos eritrócitos com os reagentes. 
Em relação à parte genética, segundo dados disponibilizados pelo Ministério da Saúde, os genes ABO se localizam no braço longo do cromossoma 9 (posição 9q34.1‑q34.2). Foram definidos quatro genes: A1, A2, B, O. A estrutura do DNA dos três principais alelos do sistema ABO, A1, B e O foi primeiramente descrita em 1990. Os avanços da genética molecular permitiram o entendimento da base molecular dos genes ABO e o conhecimento do polimorfismo dos alelos comuns a esse locus.
SISTEMA Rh
De acordo com Batissoco AC et al (2013), o sistema Rh é o mais complexo dos sistemas eritrocitários e o segundo mais importante, depois do sistema ABO, na medicina transfusional. Foi descoberto em 1939, por Levine e Stetson, por meio de um caso de Doença Hemolítica Perinatal (DHPN). 
O lócus do grupo sanguíneo Rh é composto de dois genes estruturais relacionados, RhD e RhCE, que codificam proteínas de membrana que têm os antígenos D, Cc e Ee. O gene RhD pode estar presente ou ausente, resultando nos fenótipos Rh D+ e Rh D-, respectivamente. Emendas alternativas do RNA do gene RhCE geram duas proteínas que codificam os antígenos C, c, E ou e. É comum o uso de uma nomenclatura simplificada para o fenótipo Rh. (HOFFBRAND, A.V; 2013, página 401.)
Os antígenos do sistema Rh, diferente do sistema ABO, são encontrados exclusivamente nas hemácias. Embora o sistema Rh apresente mais de 50 antígenos, apenas a classificação RhD (que se refere a presença ou ausência do antígeno RhD) é obrigatória nas rotinas pre‑transfusionais e em doadores de sangue. O antígeno RhD apresenta um extenso polimorfismo e pode se apresentar como um antígeno com fraca expressão (chamado de D fraco) ou como um antígeno modificado (D parcial). 
Os antígenos D fracos são variações quantitativas do antígeno RhD e todos os epítopos (regiões reconhecidas por anticorpos) estão íntegros na membrana eritrocitária, porém expressos fracamente. Os antígenos D parciais são caracterizados pela ausência de um ou mais epítopos da proteína D, que são substituídos por epítopos da proteína CcEe. Essas características muitas vezes só podem ser determinadas por estudos moleculares. 
OUTROS SISTEMAS
3.1 Sistema LEWIS
De acordo com Daruge (1998), o sistema Lewis foi descoberto em 1946 por Mourant. Porém, Beilgueman que descreveu o anticorpo usando o soro de uma mulher chamada Lewis, que foi denominado como Anti-Lea, que aglutinava as hemácias de 22% de europeus. Silva (2010), afirma que dois anos depois Andressen descreveu um antígeno com características semelhantes que foi chamado de Lewis b ou Leb.
Segundo afirma Rodrigues (2016), o sistema de grupo sanguíneo Lewis apesar de possuir genes muito parecidos aos genes ABO, ele diferencia-se por possuir genes geneticamente independentes. 
O sistema Lewis é composto por dois antígenos glicolipidicos, o Lea e Leb, segundo Cintra (2008), é resultado da interação dos genes FUT3 (19p.13.) e FUT2 (19q13.3). O gene FUT3 codifica a fucosiltransferase FUTIII a qual fucosila o oligossacarídio precursor lactotetraosilceramídio (Gal β1→3NAcGlc β1→3Gal β1→4Glcβ 1→1-CER), para formar o antígeno Lea. Paralelamente, a fucosiltransferase FUTII, codificada pelo gene FUT2, fucosila o mesmo precursor para formar o antígeno H tipo 1. A posterior fucosilação desse antígeno pela FUTIII dá origem ao antígeno Leb.
Esses antígenos são expressos no trato gastrointestinal, no fígado, no pâncreas e nos rins, onde são transferidos para o plasma e posteriormente adsorvidos nos eritrócitos. Eles também são encontrados nas secreções, ainda de acordo com Cintra (2008), a fenotipagem eritrocitária do sistema Lewis por hemaglutinação não é confiável e que a prevalência dos fenótipos Lewis pode ser influenciada pelo tipo de reagente utilizado e por outros fatores como gestações, cânceres, hepatite crônica, cirrose hepática, pancreatite alcoólica e cistos hidáticos.
Nakashima (2010), diz que o Lea e Leb determinam os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis [Le(a+b-), Le(a+b+) e Le(a-b-)]. Segundo Rodrigues (2016) os indivíduos com o fenótipo Lewis (a+b-) são denominados não secretores negativos, já os indivíduos com o fenótipo Lewis(a-b+) são denominados secretores positivos. Os anticorpos Lewis são produzidos por pessoas com Lewis(a-b-).
Ferreira (2016), cita que os anticorpos do sistema Lewis costumam sernaturais, de classe IgM, pois as hemácias fetais não apresentam antígeno Lewis e normalmente não causam hemólise.
3.2 Sistema MNS
Segundo Vizzoni (2016), o sistema MN foi descoberto em 1927 por Landsteiner e Levine através de experimentos com coelhos. E apenas em 1947 utilizando a técnica da antiglobulina, Walsh e Montgomery descobriram o antígeno S, que, embora distinto, era geneticamente ligado ao MN. Seu alelo “s” foi descoberto em 1951, e o sistema MN passou a ser conhecido como MNSs, um sistema de dois loci.
De acordo com Oliveira (2013), em 1953, Wiener anunciou a existência de um anticorpo para um antígeno de alta frequência, que foi denominado U. Esse antígeno encontra-se em uma glicoproteína bem caracterizada chamada MN-sialogligoproteínas (MN-SGP) ou glicoforina A (GPA).
 Esse sistema é considerado um dos grupos sanguíneos mais importantes como cita Vizzoni (2016). Atualmente 48 antígenos já foram descritos nesse sistema, sendo que em termos de dimensões e complexidade, o antígeno é parecido com o do sistema Rh.
Rodrigues (2016) diz que os anticorpos anti-M e anti-N reagem a 4ºC, sendo considerados clinicamente significantes apenas se reagirem à 37ºC. São de ocorrência natural e da classe IgM. Já os anticorpos anti-S e anti-s são considerados clinicamente significantes, como reação hemolítica grave causada por transfusão e também causam DHRN. São da classe IgG (reativos a 37ºC) e imunes. 
Sobre o Anti-U, Oliveira (2013) afirma que ele é um anticorpo raro, encontrado na raça negra. Apenas 1% de negros americanos não apresentam o antígeno U, tornando difícil achar sangue compatível.
A transfusão incompatível para esses anticorpos causa reações transfusionais, algumas vezes graves. Os anti-S, anti-s e anti-U são os que mais se relacionam à Doença Hemolitica do Recém-Nascido (DHRN) quando comparados aos anti-M e anti-N.
3.3 Sistema Kell
	O sistema Kell foi descoberto em 1946 por meio da técnica de Coombs, um teste para antiglobulina humana, sendo descrita por Levine et al. (1949) e denominado k (cellano), sendo um antígeno de alta frequência e extremamente imunogênico. Esse sistema é codificado pelo gene KEL localizado no cromossomo 7q33 e expressada por um gene regulador XK, localizado no braço curto do cromossoma X (Oliveira, 2013). Os antígenos do sistema Kell são encontrados principalmente na membrana das hemácias, mas também podem ser encontrados no cérebro, coração, órgãos linfoides, músculo esquelético, testículos, pâncreas e células progenitoras mieloides (Rodrigues, 2016), não estando presentes em plaquetas, linfócitos, granulócitos ou monócitos. A principal função do sistema Kell é a ativação de peptídeos bioativos por clivagem enzimática. Já de XK ainda não é conhecida, mas parece estar ligada a mecanismos de transporte de membrana (Girello, 2016).
	Os antígenos do sistema Kell podem apresentar pares opostos ou serem independentes, os quais não possuem pares conhecidos. Os antígenos com pares conhecidos são K (K1) e k (K2); Kpa (K3), Kpb (K4) e Kpc (K21); Jsa (K6) e Jsb (K7); K11 e K17; K24 e K14. Já os antígenos cujos pares não são conhecidos são denominados para- Kell.
	Esse sistema tem significado clínicos significativos, podendo ocasionar reações transfusionais e DHPN. A DHRN secundária a anticorpos anti-kell maternos em geral caracteriza-se por reticulopenia, com pouca ou nenhuma bilirrubina. Atualmente, sabe-se que o anti-kell materno (anti-K EL1) suprime diretamente os progenitores eritroides, ocasionando uma anemia reticulopênica neonatal, decorrente da supressão de megacariócitos na medula óssea pelo anti-KEL1.
	Fenótipos raros: Ko/Kell null, provável gene silencioso no locus KEL; indivíduos não apresentam nenhum antígeno do sistema Kell nos eritrócitos.
3.4 Sistema Duffy
	O sistema Duffy foi identificado em 1950 por Cutbush e colaboradores, mas seus antígenos só foram descobertos em 1951 por Ikin et al. e codificado pelo gene Fy, composto por seis antígenos, sendo ele Fya, Fyb, Fy3, Fy4, Fy5 e Fy6, localizado perto do centrômero, no braço longo do cromossomo 1q22-23 (Oliveira, 2013), com polimorfismo entre os antígenos Fya e Fyb resultantes de uma substituição de nucleotídeos no principal éxon do gene Fy, e fenótipos variantes, de acordo com a população estudada (Girello, 2016).
	Os antígenos Fya e Fyb são alelos codominantes que ultrapassam a membrana 7 vezes de um ponto extracelular para intracelular e são expressos em eritrócitos fetais a partir da sexta semana gestacional, mas estando desenvolvido ao nascimento, sendo detectados no cérebro, endotélio, baço, tireoide, timo e rins (Cartron e Rouger, 1995).
	Segundo Oliveira e colaboradores, existe uma associação dos antígenos Duffy e a infecção pelo parasito causador da malária, estando resistentes à infecção por P. vivax os indivíduos negros americanos e africanos com fenótipo Fy(a-b-).
3.5 Sistema Kidd
O sistema Kidd foi descoberto em 1951, localizado no locus Kidd está no cromossomo 18q12- q21 e expressada pelo gene JK ou SLC14A1, sendo composto por três antígenos (Jka. Jkb, Jk), em decorrência de um anticorpo então denominado anti-Jka (Allen, Diamond e Niedziela, 1951). Posteriormente foi revelado o anti-Jkb, tendo a função de transporte de ureia, preservando a estabilidade osmótica e a deformabilidade do eritrócito, sendo detectadas nos eritrócitos e células endoteliais dos rins 
	No sistema Kidd, exxistem três alelos, sendo dois deles co-dominantes, responsáveis pela produção dos antígenos Jk• e Jkh, e outro aparentemente silencioso (jK), que leva à formação do fenótipo nulo Jk(a-b-). Os principais fenótipos Kidd são Jk(a+b-), Jk(a-b+) e Jk(a+b+).
	Os anticorpos do sistema Kidd são geralmente IgG, podendo ser misturas de IgG e IgM. E os anticorpos anti-Jka e anti-Jkb estão implicados em reações pós-transfusionais graves e alguns casos de DHPN. O anti-Jka é o mais perigoso dos anticorpos imunes, ocasionando muitas vezes reações fatais. as reações entre os antígenos Kidd e os anticorpos são fracas, com efeito de dose, e de difícil detecção, sendo o teste de antiglobulina poliespecífica a melhor prova de rotina.
TÉCNICAS/TIPAGEM
Classificação ABO
O ministério da saúde afirma que a tipagem ABO deve ser realizada obrigatoriamente por meio de duas provas:
Prova Direta (ou Beth-Vincent): pesquisa dos antígenos fixados nas hemácias do paciente. Deve ser feita com soro Anti-A, Anti-B e Anti-AB.
Prova Reversa (ou prova de Simonin): pesquisa do anticorpo no soro do paciente. Deve ser feita com hemácias tipadas A e B, com atenção para o fato de que o anticorpo B costuma ser mais fraco (título fraco) que os demais anticorpos. A prova reversa é uma contra-prova fundamental para a conclusão do exame.
Essas duas provas, direta e reversa, devem ser realizadas preferencialmente por dois técnicos diferentes, sendo que cada teste realizado confirma o outro.
Diante disso, existe um procedimento operacional padrão (POP) para a realização da tipagem:
Tipagem em tubo – prova direta
1. Rotular três tubos de ensaio: A, B, AB;
2. Nos tubos adequadamente rotulados, colocar uma gota dos soros anti‑A, anti‑B e anti‑AB, respectivamente;
3. A cada tubo acrescentar uma gota de suspensão de hemácias da amostra = 50 µL, sendo essa suspensão a 5% em soro fisiológico;
4. Agitar os tubos e centrifugar adequadamente (1.000 rpm durante um minuto ou 3.400 rpm durante 15 segundos);
5. Fazer a leitura da aglutinação contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão de aglutinação.
Tipagem em tubo – prova reversa
1. Rotular dois tubos de ensaio com a e b;
2. Colocar duas gotas do soro da amostra = 100 µL a testar em cada tubo;
3. Adicionar ao tubo a uma gota de hemácias A1 a 5% e, ao tubo b, uma gota de hemácias B a 5%;
4. Agitar os tubos e centrifugar adequadamente;
5. Fazer a leitura da aglutinação contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão.
É importante ressaltar que o estudo imunehematológico realizado em lâmina ainda é muito utilizado didaticamente e em testes de rotina, porémhoje já existem técnicas mais elaboras e com maior precisão, tais como técnicas em tubo, gel centrifugação e PCR (ainda pouco utilizado no Brasil) e que a lâmina, por não reproduzir o mesmo nível de confiabilidade que os demais, não deve ser usada como método conclusivo para liberação de resultados de grupos sanguíneos.
Classificação Rh
A classificação rotineira do RhD refere‑se somente a presença ou ausência do antígeno RhD. Contrariamente ao sistema ABO, não há prova reversa, pois os indivíduos não apresentam naturalmente anticorpos séricos contra o antígeno RhD.
Alguns laboratórios, além do Ministério da Saúde, disponibilizam um POP ou roteiro para a tipagem Rh:
TÉCNICA EM PLACA
Preparar uma suspensão de glóbulos vermelhos a 40- 50% em plasma/soro autólogos, PBS pH 7,0 ± 0,2 ou solução fisiológica. Também pode-se utilizar sangue total. 
1) Colocar uma gota de Anti-D (Rho) sobre a placa de vidro limpa e rotulada. 
2) Adicionar uma gota da suspensão de glóbulos vermelhos a provar. Manter a relação antisoro:células em todos os ensaios. 
3) Misturar o anti-soro e os glóbulos vermelhos com um palito descartável em uma área de 2 cm de diâmetro e mexendo a placa durante 2 minutos. Observar macroscopicamente a presença ou ausência de aglutinação. Caso o período de observação seja maior que 2 minutos, efeitos da evaporação do reagente podem originar resultados errôneos (debilmente positivos). Algumas amostras D débil (fraco) ou D parcial podem não aglutinar quando utilizar a técnica em placa. Resultados indeterminados ou negativos devem-se confirmar utilizando a técnica em tubo. Não são recomendáveis as técnicas em placa para a detecção de amostras D débeis ou D parcial. 
II- TÉCNICA EM TUBO
1. Identificar dois tubos de ensaio, como RhD e CTL;
2. No tubo identificado como RhD, colocar uma gota do reagente anti‑D e, no tubo identificado como CTL, uma gota do reagente Controle de RhD;
3. Aos dois tubos adicionar uma gota de suspensão de glóbulos vermelhos 4a 3%– 5% em solução salina;
4. Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a 3400 rpm por 15 segundos;
5. Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos, e ler macroscopicamente a aglutinação;
6. Se o teste for negativo (aglutinação ausente), proceder conforme indicado no teste para pesquisa
de RhD fraco.
PESQUISA DA VARIANTE FRACA DO ANTÍGENO D
1. Incubar ambos os tubos (D e CTL) por 15 minutos em banho‑maria a 37 oC;
2. Lavar os glóbulos vermelhos (GV) de cada tubo três vezes, em solução salina fisiológica;
3. Decantar completamente por inversão rápida dos tubos, após a última lavagem;
4. A cada tubo, acrescentar duas gotas de soro antiglobulina humana de amplo espectro ou soro de Coombs;
5. Centrifugar a 3.400 rpm por 15 segundos;
6. Ressuspender o “botão” de GV, por agitação delicada, e examinar para aglutinação macroscópica;
7. Anotar os resultados.
4.3 Classificação dos outros sistemas
De acordo com o Ministério da Saúde (2014), a classificação dos outros sistemas (Lewis, MNS, Kell, Kidd e Duffy) é realizada através do teste de antiglobulina indireto - TAI (coombs indireto, pesquisa de anticorpos irregulares). O TAI tem como objetivo determinar a sensibilização de hemácias “in vitro”. Este teste detecta imunoglobulinas IgG -anticorpos incompletos (não aglutinantes) de importância clínica no soro. O soro do paciente deve ser pesquisado com hemácias de fenótipos conhecidos para os principais sistemas eritrocitários (tipadas). 
 O importante é que as hemácias usadas contenham os principais antígenos que caracterizam os anticorpos dos principais sistemas eritrocitários (Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). Com isto, já se obtém um resultado satisfatório. Porém, vale mencionar que essa técnica apenas detecta os anticorpos incompletos, ela não caracteriza especificamente o sistema em questão.
Para uma identificação mais precisa, é necessário a utilização de ferramentas moleculares. Dentre elas, indica-se a realização da reação em cadeia da polimerase (pcr) – multiplex, ae, rflp, rt, array e ngs. 
CONCLUSÃO
É notável a importância dos estudos acerca dos grupos sanguíneos, visto que boa parte da conduta médica em diversas situações depende diretamente da compatibilidade sanguínea. Além disso, os diversos sistemas são importantes na medicina transfusional, mas os sistemas ABO e o Rh merecem destaque. A hematologia, bem como a hemoterapia progrediram bastante nos últimos anos, com destaque aos aspectos relacionados à transfusão sanguínea. Com o avançar do conhecimento acerca das bases moleculares e genéticas a respeito dos grupos sanguíneos, os testes pré-transfusionais ficam cada vez mais rigorosos e isso é extremamente importante para a segurança dos procedimentos. 
Vale ressaltar também a necessidade de conscientizar a população acerca da importância da doação de sangue, que deve ser voluntária, e também sobre os cuidados gerais com a saúde	. Diversos postos de saúde realizam testes rápidos nos quais é possível descobrir o tipo sanguíneo e até mesmo a existência de infecções sexualmente transmissíveis (IST). O hábito de ir aos hemocentros com o interesse apenas de realizar tais testes deve ser desencorajado, visto que existem outros meios para isso. 
REFERÊNCIAS
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