CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS POR MÉTODOS QUÍMICOS E FÍSICOS

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CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS
	O bem estar da humanidade depende em grande parte da capacidade do homem em controlar a população dos microrganismos, visando:
- Prevenir a transmissão de doenças. 
- Evitar a decomposição de alimentos. 
- Evitar a contaminação da água e do ambiente. 
    Esse controle de microrganismos é possível pela ação de agentes físicos e químicos, que possuem propriedades de matar a célula microbiana, ou de impedir a sua reprodução (crescimento).
	O controle dos microrganismos pode ser realizado com agentes físicos e químicos, que por ventura podem ser aplicados na pele humana (impedindo contaminações e infecções), em superfícies inanimadas, objetos (material cirúrgico, por exemplo), alimentos e meio ambiente – como em uma estação de tratamento de água e esgoto.
Termos importantes:
Microbiocida: mata as bactérias (fungicida, viricida)
Microbiostático: inibem o crescimento (fungistático, virustático, etc).
CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Agentes bacteriostáticos = A contagem e viabilidade celular continuam as mesmas, porém não ocorre um aumento do número de células, ocorre interrupção no processo de multiplicação celular. Muitos agentes antimicrobianos possuem essa característica, principalmente antifúngicos. Onde a eliminação do micro-organismo se dá por ação do sistema imune do hospedeiro.
Agentes bactericidas = Contagem celular não diminui, porém a viabilidade sim. Ou seja, as células estão mortas.
Agentes bacteriolíticos = Contagem e viabilidade celular diminuem, pois as células sofrem lise, ou seja, as células dos micro-organismos são de fato destruídas.
	Fonte: Trabulsi e Atherton, 2015.
Relembrando:
Os endósporos são estruturas formadas por algumas espécies de bactérias Gram-positivas, sobretudo dos gêneros Clostridium e Bacillus, quando as mesmas são expostas a condições desfavoráveis a sobrevivência. Ocorre o isolamento de uma pequena porção do citoplasma, com crescimento de membranas, camadas de peptideoglicano e capa protetora protéica. Então o esporo formado sofre desidratação, paralisando quase a totalidade das reações metabólicas. O esporo contém apenas DNA, RNA, alguns ribossomos e moléculas pequenas e importantes. Pode sobreviver durante anos em condições extremas, voltando a se desenvolver quando o ambiente se torna favorável. 
Fatores que influenciam na efetividade dos tratamentos antimicrobiano:
-Contagem de micro-organismos;
-Influências ambientais;
-Tempo de exposição;
-Caracterísicas microbianas.
DENTRE OS MÉTODOS DE CONTROLE DE MICRO-ORGANISMOS, TEMOS OS AGENTES FÍSICOS E OS AGENTES QUÍMICOS
Físicos: Calor, Frio, radiação, filtração, dessecação e pressão osmótica;
Químicos: Produtos químicos.
Eficiência depende do tipo e número de micro-organismos, estado fisiológico das células e tempo de exposição.
MÉTODOS FÍSICO:
CALOR
método mais empregado para matar micro-organismos é o calor, por ser eficaz, barato e prático. Os micro-organismos morrem pela desnaturação de proteínas e fluidificação dos lipídeos na presença de calor úmido e por oxidação, quando se trata de calor seco, e há variações de resistência de organismo para organismo.
Calor úmido: 
Fervura - mata todas as formas vegetativas dos patógenos, muitos vírus, fungos e seus esporos em até 15 minutos. Alguns endósporos bacterianos e alguns vírus, entretanto, não são destruídos tão rapidamente. Um dos tipos de vírus da hepatite, por exemplo, sobrevive até 30 minutos de fervura e alguns endósporos bacterianos resistem até 20 horas. A fervura não é um método de esterilização, mas, sendo submetida a uma fervura de 15 minutos, a maioria dos patógenos será morta e isto faz com que este processo seja empregado de forma eficiente para tornar alimentos e água seguros para serem ingeridos.
Autoclavação – Esterilização requer temperaturas acima de 100°C, tais temperaturas são atingidas na autoclave, que emprega pressão, o que acarreta no alcance de maiores temperaturas. O calor úmido (121°C), a pressão de 15 libras/polegada quadrada, matará todos os organismos, incluindo os endósporos, em cerca de 15 minutos. Quanto maior a pressão, maior será a temperatura alcançada. A autoclavação é empregada para esterilizar meios de cultura, instrumentos cirúrgicos, seringas de vidro, soluções e numerosos outros materiais que suportam altas temperaturas e pressão. Os materiais devem ser previamente lavados, secos e embalados em embalagens próprias para autoclavação ou em papel craft.
Pasteurização – Criado por Pasteur em 1864, para aumentar a durabilidade do vinho. Consiste em aquecer o produto a uma dada temperatura, num dado tempo, e a seguir resfriar bruscamente. Até alguns anos atrás, para o leite, a temperatura empregada era 63º C e o tempo, 30 minutos. Atualmente, a pasteurização do leite emprega temperaturas mais elevadas (72º C) e menor tempo (15 segundos). É importante salientar que a pasteurização, por qualquer que seja o tempo e a temperatura empregados, reduz o número de micro-organismos presentes, mas não assegura uma esterilização, daí a necessidade de manter o leite em baixas temperaturas. O leite pode ser esterilizado e, para isso, são empregados processos que elevam a temperatura para 74º C. A seguir, o leite é aquecido de forma super-rápida a 140º C durante alguns segundos e imediatamente resfriado. 
CALOR SECO
Flambagem - Amplamente utilizada em laboratórios de microbiologia. Forma mais simples e empregada de esterilização por calor seco, consiste em submeter um determinado objeto (como alças bacteriológicas ou bastões de vidro) diretamente na chama, até que a coloração do mesmo se torne avermelhada. Causa a combustão de todos os micro-organismos presentes.
Incineração – Empregada principalmente em ambientes hospitalares e laboratoriais. É a combustão completa de materiais descartáveis ou carcaças de animais contaminados.
Estufas e fornos – Consistem em submeter os materiais a altas temperaturas. Indicado para materiais que não podem ser submetidos a calor úmido, como por ex. materiais metálicos que sofrem oxidação. As temperaturas são normalmente de 170° a 205°C por 120 minutos
Micro-ondas: Os fornos de micro-ondas têm sido cada vez mais utilizados em laboratórios e as radiações emitidas não afetam diretamente os micro-organismos, mas geram calor. É possível até esterilizar materiais, meios de cultura, mas são escassos os trabalhos mostrando tempo e potência do forno necessários. Há que deixar claro que o calor gerado é o responsável pela morte dos micro-organismos.
FRIO
Método de controle de crescimento empregado principalmente para conservação de alimentos, células ou micro-organismos de experimentação laboratorial. Geralmente não causa morte, mas a parada das atividades metabólicas das células, impedindo o crescimento microbiano. Contudo quando o material é submetido a choque térmico em baxissimas temperaturas, a pressão osmótica formada pelos cristais de gelo causa lise na membrana e morte dos micro-organismos. Por isso, para a conservação de micro-organismos em laboratórios, é utilizado glicerol ou DMSO, que impedem a formação de cristais de gelo no interior das células. 
FILTRAÇÃO
A filtração pode ser usada para esterilizar gases e líquidos que são sensíveis ao calor. Os filtros são compostos por grande variedade de matérias sintéticos podendo ser filtros de celulose, acetado, amianto, policarbonato, teflon ou outro material sintético com poros de 0,2-0,25m. Impedem a passagem de bactérias menos Mycoplasma sp. Entretanto, existem diferentes tamanhos de poros de acordo com o tipo de filtragem que se deseja. O uso da filtração é recomendado para materiais termolábeis em solução e na descontaminação do ar, em fluxos laminares e sistemas de ventilação nos quais o controle microrganismo é especialmente importante como salas de cirurgias e enfermarias de tubérculos e unidades de queimados. Ex. filtros HEPA, filtros de membrana.
RADIAÇÃO
As radiações têm seus efeitos dependentes do comprimento de onda, da intensidade,da duração e da distância da fonte. Há pelo menos dois tipos de radiações empregados no controle dos micro-organismos: ionizantes e não-ionizantes. As ionizantes, como, por exemplo, as radiações gama, têm comprimento de onda mais curto que as não-ionizantes e carregam mais energia. Isótopos radioativos como o cobalto90 podem emitir as radiações gama e estas podem ser canalizadas para os processos de esterilização. O principal efeito da radiação ionizante é a ionização da água, formando radicais super-reativos (superóxidos) e estes reagem com componentes celulares orgânicos, dentre eles o DNA, matando ou inativando os micro-organismos. Inúmeros produtos hospitalares de uso descartável, como seringas plásticas, luvas, cateteres, fios, suturas, são esterilizados por este método. Baseado em tempo (baseado na distância da fonte, atividade da fonte e densidade do artigo), concentração de radiação, temperatura, umidade e presença de oxigênio. As não-ionizantes têm comprimento de onda mais longo que as anteriores e a mais empregada é a luz ultravioleta (UV). A UV provoca a formação de ligações químicas entre as timinas adjacentes e estes dímeros alteram a replicação do DNA no momento da reprodução. O comprimento de onda de 260 nm é o mais eficaz, pois esta radiação é mais absorvida pelo DNA. As lâmpadas germicidas são usadas para o controle dos micro-organismos do ar e frequentemente são encontradas em centros cirúrgicos, enfermarias, berçários, capelas de fluxo laminar etc. As desvantagens do uso de UV são: baixo poder de penetração, ou seja, esta radiação só é eficaz se os micro-organismos estiverem nas superfícies dos materiais a serem esterilizados, e os efeitos deletérios sobre a pele e os olhos, causando queimaduras graves. 
PRESSÃO OSMÓTICA
A alta concentração de sais ou açúcares cria um ambiente hipertônico que provoca a saída de água do interior da célula microbiana, condensando o citoplasma e retraindo a membrana. Nestas condições, os micro-organismos deixam de crescer e isto tem permitido a preservação de alimentos, principalmente peixes, carnes (salga) e frutas (conservas), evitando a deterioração causada por bactérias e bolores.
DESSECAÇÃO
Na falta total de água, os micro-organismos não são capazes de crescer, multiplicar, embora possam permanecer viáveis por vários anos. Quando a água é novamente reposta, os micro-organismos readquirem a capacidade de crescimento. Esta peculiaridade tem sido muito explorada pelos microbiologistas para preservar micro-organismos e o método mais empregado é o da liofilização. Neste processo, a água é sublimada do interior das células e os micro-organismos são armazenados em ampolas, fechadas a vácuo, podendo ser preservados viáveis por dezenas de anos.
MÉTODOS QUÍMICOS
Os agentes químicos empregados no controle dos micro-organismos podem ser esterilizantes ou desinfetantes. As características ideais de um desinfetante ou antisséptico são: a) possuir alta eficácia germicida, entendendo-se, por isto, ser de efeito rápido e ter amplo espectro antimicrobiano e ação prolongada; b) apresentar estabilidade química, devendo ser solúvel em água e nos líquidos orgânicos; c) ser inodoro ou ter odor agradável; d) ser incolor; e) não produzir manchas. 
ÁLCOOIS - Os álcoois possuem muitas qualidades desejáveis dos desinfetantes: baratos, facilmente obtidos e bactericidas diante das formas vegetativas. A desnaturação de proteínas e a solubilização de lipídeos são as explicações mais aceitas para a ação antimicrobiana. 
O álcool etílico 70% é o mais empregado. O álcool isopropílico puro apresenta ação germicida superior à do álcool etílico, além de ser menos corrosivo para os instrumentos.
Alguns glicóis podem ser usados, dependendo das circunstâncias, como desinfetantes do ar. O propilenoglicol e o etilenoglicol são os mais empregados nas desinfecções de câmaras, quartos e salas. 
ALDEÍDOS - O mecanismo de ação dos aldeídos é a alquilação direta dos grupos funcionais das proteínas, tais como aminas, carboxilas e hidroxilas, formando hidroximetilderivados inativos. Deste grupo, o mais empregado ainda é o aldeído fórmico. Por ser facilmente solúvel em água, é empregado sob a forma de solução aquosa em concentrações que variam de 3% a 8%. É bastante utilizado associado a outros potencializando a ação desinfetante. Com bons resultados, o aldeído fórmico tem sido substituído pelo aldeído glutárico em soluções aquosas alcalinas a 2%. A metenamina é um antisséptico urinário que deve sua atividade à liberação do aldeído fórmico. Em algumas preparações, a metenamina é misturada ao ácido mandélico, o que aumenta seu poder bactericida.
FENÓIS E DERIVADOS - O fenol (ácido carbólico) é um desinfetante fraco, tendo interesse apenas histórico, pois foi o primeiro agente a ser utilizado como tal na prática médica e cirúrgica. Os fenóis atuam sobre qualquer proteína, mesmo aquelas que não fazem parte da estrutura ou protoplasma do micro-organismo, significando que, em meio orgânico protéico, os fenóis perdem sua eficiência por redução da concentração atuante. Para exercerem uma atividade bactericida in vivo, é necessário concentração de 0,2% a 1%, dependendo da espécie microbiana.
Os cresóis possuem a mesma toxicidade, porém são cerca de 3 vezes mais ativos que os fenóis. O mais ativo é metacresol. A creolina é uma mistura de cresóis utilizada na desinfecção de pisos, vasos sanitários, excretas etc. O timol é cerca de 30 vezes mais ativo que o fenol e possui menor toxicidade. As soluções a 5% em álcool (uma vez que é muito pouco solúvel em água) são utilizadas como antissépticos, particularmente em infecções causadas por fungos. A introdução dos halogênios nas moléculas de fenóis torna estes compostos mais ativos. Assim, os derivados halogenados, 4-clorocresol e 4-cloroxilenol são bons desinfetantes ou antissépticos em concentrações que variam de 5% a 0,5%, fazendo parte da composição dos sabões. Comparativamente ao timol, o 4-clorotimol é duas vezes e meia mais potente. O triclosan (bisfenol) tem ampla atividade bacteriostática bem como fungistática. Não é tóxico e são raros os casos de sensibilização quando aplicado na pele. Por isso, entra na composição de muitos sabões medicinais, desodorantes, antiperspirantes e pastas de dentes. 
	Os compostos fenólicos e seus derivados, dado seu poder biocida, têm uma ampla aplicação nas indústrias de alimentos e rações, na preservação de madeiras, nas indústrias de cosméticos e perfumarias, além de usos nas áreas médicas humanas, veterinária e odontológica.
HALOGÊNIOS E DERIVADOS - Entre os halogênios, o iodo é um dos antissépticos mais utilizados na prática cirúrgica. Bactericida, fungicida e esporocida, as soluções alcoólicas a 2% de iodo exercem ação imediata. O mecanismo de ação é combinação irreversível com proteínas, provavelmente através da interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina. O cloro gasoso tem potente ação germicida e pode ser utilizado na desinfecção de água, desde que não haja excesso de matéria orgânica. 
Uma vez que o cloro é rapidamente perdido sob forma de gás, as soluções são úteis somente quando preparadas no momento de usar. Entre os compostos que liberam vagarosamente cloro, a tosilcloramida sódica e a dicloramina T são largamente utilizadas, além do próprio hipoclorito de sódio ou cálcio (líquido de Dakin). Como liberadores de cloro e mais estáveis do que as cloraminas citadas, usam-se os derivados do ácido cloroisocianúrico e halozone empregados como sanitizantes. O cloro ataca os grupos alfa-aminados das proteínas, formando cloroaminoácidos instáveis.
ÁCIDOS INORGÂNICOS E ORGÂNICOS 
Um dos ácidos mais populares como antisséptico é o ácido bórico, mas o uso não é aconselhado devido alta toxicidade.
Ácido acético e lático são empregados na conservação de alimentos, bem como ácido benzoico, sórbico e cítrico, devido suas propriedades bacteriostáticas e fungistáticas.
Ácido mandélico e nalixídico são empregados como antissépeticos das vias urinárias.
AGENTES DE SUPERFÍCIE 
Detergentescatiônicos, têm grande utilidade nas desinfecções e antissepsias. Os compostos mais empregados são: cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridíneo e cetrimida. As concentrações variam de 0,005% a 1%, conforme sejam empregados como antissépticos ou desinfetantes. O modo preciso de ação dos catiônicos não está totalmente esclarecido, sabendo-se, porém, que alteram a permeabilidade da membrana, inibem a respiração e a glicólise de formas vegetativas de bactérias, tendo também ação sobre fungos, vírus e esporos bacterianos.
BIGUANIDAS 
A clorohexidina tem sido usada com excelentes resultados na antissepsia de pele, na lavagem de mãos de cirurgiões e de pessoal médico e paramédico em geral, na preparação de pacientes antes das cirurgias, em urologia, em obstetrícia e ginecologia, em queimados e na prevenção e tratamentos de doenças orais. Usado na concentração de 0,5% é bacteriostático, e bactericida em concentrações elevadas de até 4%. Adsorve-se a parte externa dos micro-organismos, ligando-se aos grupos fosfatos da parede e depois da membrana provocando danos e liberando o conteúdo citoplasmático.
METAIS PESADOS E DERIVADOS
sais de mercúrio foram de grande importância como desinfetantes e antissépticos. Entretanto, o baixo índice terapêutico dos mercuriais e o perigo de intoxicação por absorção fizeram com que aos poucos deixassem de ser usados, o efeito predominante é bacteriostático. Dos sais de prata, o mais importante é o nitrato, utilizado largamente em soluções oftálmicas a 1%, a fim de prevenir a oftalmia neonatorum. Sais de cobre como o sulfato têm sido usados no tratamento de águas (piscinas, reservatórios e águas de refrigeração de ar-condicionado), atuando sobre algas, fungos e muitos vírus. 
AGENTES OXIDANTES
A propriedade comum destes agentes é a liberação de oxigênio nascente, que é extremamente reativo e oxida, entre outras substâncias, os sistemas enzimáticos indispensáveis para a sobrevivência dos micro-organismos. O mais empregado é a água oxigenada em solução a 3% . A água oxigenada é particularmente adequada para lavagem de feridas e mucosas onde haja tecido morto, pois a produção de gás, em virtude da ação da catalase, facilita a limpeza da área ou da cavidade afetada. Muito usado antigamente, o permanganato de potássio é outro agente oxidante empregado em diluições de 1:5.000- 1:2.000 para lavagens de feridas e mucosas. Concentrações superiores provocam irritações tissulares. O ozônio tem sido utilizado, em larga escala, no tratamento de água de consumo. Embora mais instável quimicamente, o ácido peracético associado a água oxigenada e ácido acético revelou-se um bom desinfetante e sanitizante.
ESTERILIZANTES GASOSOS
o óxido de etileno tem sido empregado com sucesso na esterilização de instrumentos cirúrgicos, fios de agulhas para suturas e plásticos. Deve ser empregado com cautela e em mistura com outros gases (nitrogênio e dióxido de carbono), pois, em combinação com o ar, forma mistura explosiva. Cerca de quatro mil vezes mais eficaz que o óxido de etileno, a beta- -propiolactona tem as desvantagens de apresentar baixo poder de penetração e ser tóxica. Ambos possuem mecanismo de ação análogo aos aldeídos, qual seja, a alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas. Plasma de peróxido de hidrogênio já é utilizado em escala hospitalar no Brasil desde o final da década de 90, os componentes celulares reagem com as moléculas ativadas (íons, elétrons, radicais livres) levando a perda irreversível do crescimento dos micro-organismos. Tem como vantagens o uso de baixas temperaturas, não deixar resíduos e ciclos curtos de esterilização e como desvantagens o custo ainda elevado, a incompatibilidade com algumas substancias e requerer embalagens especiais.
CONTROLE DE QUALIDADE DE MÉTODOS DE DESINFECÇÃO/ESTERILIZAÇÃO
Para se garantir a eficiência dos processos de esterilização deve-se elaborar um programa de monitoramento para controle de qualidade de esterilização. Este programa deve avaliar e controlar todas as fases da esterilização, a fim de se detectar possíveis falhas e onde elas ocorreram.
Testes físicos:
Avaliar os parâmetros dos equipamentos durante a execução, como temperatura e pressão;
Qualificação térmica no interior do equipamento, por meio de termopares;
Doseamento de radiação (avaliar se a dose de radiação absorvida pelo material tratado foi compatível com o processo de esterilização).
Testes químicos:
Indicadores químicos: Tiras de papel impregnadas com tintas termocrômicas, que mudam de cor quando expostas a temperaturas. Devem ser utilizadas externamente e também em locais de difícil penetração do vapor/temperatura. Não devem ser utilizadas como critérios únicos no controle de qualidade de esteriliadade, as ajudam a identificar imediatamente falhas nos processos de distribuição do calor, além de ajudar na identificação do material que foi esterilizado.
Existem diferentes indicadores internos, de acordo com o processo de esterilização:
Classe 1: fitas zebradas, devem ser usados em todos os materiais a serem autoclavados;
Classe 2: Indicadores para testes específicos, como Bowie & Dick, que servem para testar eficácia de sistemas de vácuo em autoclaves de pré-vacuo;
Classe 3: Indicadores de parâmetro, projetados para indicar um parâmetro crítico do sistema de autoclavagem, como temperatura, vapor saturado e pressão;
Classe 4: Indicadores multi-parâmetros, medem dois ou mais parâmetros do equipamento;
Classe 5: Indicadores integrados, projetados para medir todos os parâmetros do processo, dentro de um intervalo específico de ciclos de esterilização;
Classe 6: Simuladores, reagem com todos os parâmetros críticos do processo e indicam em qual parâmetro está a falha.
Testes biológicos:
Indicadores utilizados para o controle de esterilização, que consistem em amostras de micro-organismos vivos e resistentes. É recomendado realizar testes biológicos pelo menos semanalmente. Os indicadores devem ser colocados em local de difícil penetração de calor e após o ciclo devem ser incubados de 3 a 48h, de acordo com as indicações do fabricante. Crescimento microbiano indica falha no processo de esterilização. Os micro-organismos mais utilizados são:
Bacillus stearothermophilus – autoclaves a vapor;
Bacillus subtilis variedade niger - Calor seco, óxido etileno, plasma de peróxido de hidrogênio;
Bacillus pumilus – radiação gama.
O controle de qualidade de agentes químicos pode ser realizado por disco-difusão em ágar, e os MO indicados são Bacillus subtilis e Clostridium sporogenes.
O material esterilizado deve ser estocado em local fechado, longe de umidade, com temperatura controlada. Os lotes devem ser identificados e deve ser determinado prazo de validade de esterilidade, que depende da natureza e finalidade de cada material.
Os procedimentos para correta descontaminação ou esterilização de materiais, devem estar descritos em procedimentos operacionais padrão (POPs).
BIBLIOGRAFIA
Trabulsi e Atherton – Microbiologia 6ª ed. 2015.
Ministério da Saúde – Orientações gerais para central de esterilização. Série A, normas e manuais técnicos, n. 108, 2001.
Rutala, WA; Weber DJ. Disinfection, sterilization, and antisepsis: An overview. American Journal of Infection Control. v.44, e1-e6, 2016.
Sistema de Informação em Biossegurança – FIOCRUZ (http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/StartBIS.htm)