Aula 3 Sequenciamento de genoma

Prévia do material em texto

Biotecnologia
AULA 2: 
Sequenciamento de 
Genoma
Profª Natália Faria Romão
Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Esp. Microbiologia de alimentos e Avançada
Doutoranda: Biotecnologia - BIONORTE
• 1977 – Técnica de sequenciamento de DNA –
Método de Sanger
• 1991 – Projeto Genoma Humano
• 1995 – Primeiro genoma sequenciado (Haemophylus
influenzae)
• 2001 – Primeiro rascunho do Genoma Humano
• 2003 – Conclusão do sequenciamento do Genoma
Humano
• 2009 – Mais de 1000 genomas sequenciados
Introdução
Histórico
Introdução
• Sequenciamento de DNA: 
determina a sequência de 
nucleotídeos (A, T, C e G) 
em um pedaço de DNA.
Métodos
1ª Geração: Método Enzimático ou Sanger (Frederik Sanger 
– 1977)
2ª Geração: Método Pirosequenciamento (Mostafa 
Ronaghi – 1996)
3ª Geração: Single Molecule Real Time (SMRT) - DNA 
Sequencing
Introdução
Gene MC1R:
codifica a proteína 
receptora do 
hormônio 
estimulador de 
melanócito (MSH)
Localização: Cromossomo 16q 24.3, com 3.099 nucleotídeos
h
tt
p
s:
//
w
w
w
.n
cb
i.
n
lm
.n
ih
.g
o
v
Métodos para Sequenciamento
• Reação de sequenciamento 
– amplificação linear
• Eletroforese em gel de acrilamida
– em placa
– capilar
• Leitura da sequencia
– manual
– automática
Método Enzimático ou Sanger
Métodos para Sequenciamento
• fragmento de DNA (fita simples)
• 1 primer 
• DNA polimerase
• dNTPs
• ddNTPs
OH
H
Métodos para Sequenciamento
Método Enzimático ou Sanger
H
H
H
H
H
Métodos para Sequenciamento
Método Enzimático ou Sanger
Métodos para Sequenciamento
GCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC
5’
5’
3’
3’
DNA
fita dupla
CGTATACAGTCAGGTC3’ 5’
DNA
fita simples
GCAT5’ 3’Iniciador + DNA polimerase
+ excesso de dATP, dTTP, dGTP, 
dCTP
GCAT A
ATGTCA
ATGTCAGTCCA ATGTCAGT
ATGT
AT
ATGTCAGTCC
ATGTCAGTC
ATGTC
ATGTCAGTCCAG
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
GCAT
ATGTCAG
ATG
+ddATP +ddTTP +ddCTP +ddGTP
Métodos para Sequenciamento
Método Enzimático ou Sanger
Anelamento do primer
Extensão do primer
Terminação da síntese: 
adição dos ddNTPs
Eletroforese em gel de 
poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
Métodos para Sequenciamento
Método Sanger
Métodos para Sequenciamento
Eletroforese em gel de
poliacrilamida separando
fragmentos de DNA com 1 base
de diferença
Métodos para Sequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Método Sanger
5’ TGGACCGATCGTAAGTCG 3’
PRIMER
Precisão de 
99,99%
Métodos para Sequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Auto-radiogramas de um gel de 
sequenciamento de DNA
Métodos para Sequenciamento
Leitura da sequência de DNA
G A T C
Métodos para Sequenciamento
Auto-radiogramas de um gel de 
sequenciamento de DNA
Método Sanger
Métodos para Sequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Problemas com Método Sanger
• Erros ou não detecção dos primeiros 15-40 pb 
• Dependente de enzima 
• Preparação das amostras 
• PCR kit, primers, passos de purificação, clonagem 
• Única reação pode sequenciar 300-800 pb 
• Pouco eficiente para sequenciar genomas
Anos 80 – sequenciador semi-automático
• Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo
uso de marcadores fluorescentes
•Radioisótopos – danosos à saúde, dificuldade de automação
•Fluorófos – sistema de detecção que permite a leitura 
automática das sequências
• Preparação do gel e aplicação das amostras
• Utilização ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente
durante a eletroforese
• Corantes fluorescentes – reações no mesmo poço no gel
Sequenciamento 
Manual X Automático
• Permite a análise simultânea de diversos
segmentos de DNA
• Utilizado para sequenciamento de larga escala
• Nucleotídeos marcados com fluorocromo
(quatro corantes diferentes)
• Emitem luz em diferentes comprimentos de
ondas quando excitados por um laser
Sequenciamento Automático
Método de Sanger 
automatizado
SEQUENCIADOR
• Seqüenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos,
completamente automatizados
• Associação de capilares preenchidos com gel a um
sistema de detecção através de fluorescência confocal
excitada por laser
• Eliminação da montagem da placa e preparação do gel
• Aplicação das amostras por eletroinjeção
• Alta velocidade e resolução na separação das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO
Região de qualidade alta
• Picos bem definidos e grandes.
• Linha de base boa.
• Distância entre picos anterior e posterior constante.
ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Região de qualidade média – poucas ambigüidades
• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.
• Linha de base boa a razoável.
• Distância entre picos anterior e posterior razoável.
ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade
• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.
• Linha de base confusa.
• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.
ANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
Alternativa ao método 
Sanger
Baseado no princípio de 
detecção dos raios luminosos 
emitidos e liberados a partir 
da síntese do DNA.
Enzimas:
DNA polimerase
ATP sulforilase
Luciferase
Apirase (APS)
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
reage
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
• Polimorfismo de nucleotídeo único 
(SNP);
• Identificação de bactérias; 
• Tipagem fúngica e viral; 
• Detectar mutações; 
• Análises de metilação do DNA; 
• Sequências múltiplas; 
• Verificações de clones; 
• Sequenciamento do genoma humano.
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
1. Automatizada
2. Expediente (1 dia) 
3. Alto Rendimento 
4. Comprimento das sequências podem ser tão longo quanto 
> 200pb 
5. Ilimitado número de amostras 
6. Incorporação simples em protocolos PCR
7. Rápido método com real tempo de leitura altamente 
adequado para sequenciamento de pequenas faixas de DNA 
Prós:
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
1. Alto Custo 
2. Rápidas leituras para inferência filogenética 
3. Pesada bioinformática 4
4. Relativamente alta taxa de erro (0,0098)
5. Longo dNTP único não confiável (linearidade 8 pb)
Contras:
Métodos para Sequenciamento
Método Pirosequenciamento
• Trouxe automação
• Alto rendimento
• Pode ser utilizado um número ilimitado de 
amostras
• Incorporação aos protocolos de PCR
• Método em tempo real
Lançada em 2004.
Métodos para Sequenciamento
Método SMRT
• Desenvolvido pela 
Pacific Bioscience
(PacBio);
• Tempo real
Métodos para Sequenciamento
Método SMRT
• Método de síntese em tempo real;
• Single-Molecule, Real Time Technology 
Sequencing (SMRT®);
• Permite a observação em tempo real 
da síntese de DNA - , precisão superior 
a 99,999%;
• Faixa de leitura superior a qualquer 
outra tecnologia – leitura de 8000pb 
de forma rápida e simples.
Métodos para Sequenciamento
Método SMRT
Métodos para Sequenciamento
Método SMRT
• Automação
• Alto rendimento e alta qualidade
• Análises rápidas (2h) um genoma completo (bactéria)
• Precisão de 99,999%
• Alto custo (equipamento)Métodos para Sequenciamento
os sequenciadores de nova geração podem ler até 
bilhões de fragmentos simultaneamente.
Sequenciadores da Terceira geração
Sequenciamento completo de 
Genomas
Ano Ser
1982 Fago Lambda – 49 mil pb
1995 Haemophilus influenzae – 1,8 milhão de ph
1996 Saccharomyces cerevisiae – 12 milhões de pb
1997 Escherichia coli – 5.5 milhões de pb
1998 Caenorhabdis elegans – 100 milhões de pb
2000 Drosophila melanogaster – 122 milhões de pb
2001 Homo sapiens – 3,3 bilhões de pb
2008 Mammuthus primigenius - > 4 bilhões de pb
2010 Homo neanderthalensis – 4 bilhões de pb 
2011 Genômica Pessoal 
O que fazer com a informação 
após o sequenciamento?
Montar o 
genoma
Efetuar a 
varredura
sequências de nucleotídeos 
correspondentes a cada um 
de seus genes ou de outras 
regiões de interesse
Bioinformática
O que fazer com a informação 
após o sequenciamento?
• Identificar:
– regiões promotoras,
– junção dos éxons com os íntrons,
– os códons de início e parada da tradução.
• São capazes de predizer a sequencia do
gene, identificando o conjunto gênico de
um organismo após seu sequenciamento.
Sítios gênicos conservados. A sequencia de nucleotídeos é numerada começando pela
primeira base do códon de iniciação ATG (em roxo). Os éxons estão indicados em
vermelho (7 no total) e as regiões entre os éxons são os íntrons (6 no total). Sítios 5’ e 3’
conservados, flanqueando os exóns estão sublinhados em todos os íntrons. Domínios
conservados envolvidos na transcrição de eucariotos (ex: TATAA, CAAT e motivos CT)
estão em negrito na região 5’ não codificante. Os códons de início e final da tradução
estão em roxo.
Mapa de bandeamento do cromossomo 6 humano e mapa físico 
evidenciando posição, identificação e função de alguns genes.
Este tipo de mapa nos permite identificar 
regiões do genoma com maior 
probabilidade de ocorrer recombinação, 
construção de linhagens genéticas e 
descoberta de funções de genes.
Variação genética e sua relação com 
doenças humanas
~99,9% idênticos
Deixando ainda com
diferenças entre os
3,2 bilhões de pb de
nucleotídeos que
compõem o
genoma.
SNPs (Single
Nucleotide
Polymorphisms)
90% de todas as
variações são
SNPs, e mais de
1,42 milhões de
SNPs já foram
identificados
durante o PGH.
SNPs mais frequentes
(frequência alélica mínima
de 40%) aparecem a
cada 3.280 nucleotídeos
do nosso genoma. Alelos
raros são mais comuns.
Aproximadamente 11
milhões de bases de
nosso genoma
apresentam um
pequeno índice de
variação
Ocorrem uma vez a 
cada 290 nt em nosso 
genoma. A combinação desses SNPs 
forma os genótipos. 
Aplicações atuais
Identificação de microrganismos
Estudo de genes e proteínas codificantes
Relação entre seres vivos
Detecção de doenças genéticas 
e epigenéticas
Detecção de mutações Verificações de clones
Aplicações atuais
• Sequenciamento completo do genoma ou 
WGS (Whole Genomic Sequencing):
– um mapa detalhado de mutações pontuais (em regiões
codificantes ou não), inserções e deleções, além de
informações minuciosas sobre alterações estruturais ou
numéricas.
• Perfis de genótipos a determinadas patologias.
• Viabiliza o diagnóstico precoce de patologias, permite
um melhor aconselhamento genético de casais
portadores de alelos mutantes.
Um caso de sucesso
Múltiplas fístulas 
apareceram no órgão, 
fazendo com que Nic não 
conseguisse comer 
normalmente.
Nic Volker (USA), aos 6 
anos (2010) -
inflamação intestinal 
desconhecida.
+ de 100 cirurgias, os médicos 
não haviam chegado a um 
diagnóstico.
Sequenciamento de regiões 
onde as proteínas eram 
codificadas em cada gene do 
organismo do menino.
identificaram uma 
mutação jamais associada 
a problemas intestinais.
a variante havia sido ligada a 
distúrbios sanguíneos - curados 
por meio do transplante de 
medula óssea. “A equipe 
médica levantou a possibilidade 
de um transplante, o que não 
seria considerado sem um 
diagnóstico firme”
Nic Volker (USA), aos 6 
anos - inflamação 
intestinal desconhecida.
Os médicos usaram células-
tronco do cordão umbilical de 
um doador saudável – 2010.
O caso, foi o primeiro no mundo 
no qual o sequenciamento do 
DNA de um paciente levou ao 
diagnóstico e ao tratamento.
Um caso de sucesso
Aplicações atuais
Detecção de mutações:
• Causadores de grande parte de
doenças humanas.
• identificar os genes responsáveis
por uma doença é o primeiro
passo para entender sua
fisiopatologia e elaboração de
futura intervenção terapêutica.
Ex.: Tipos de câncer, microcefalia, diagnóstico de transtornos do
neurodesenvolvimento altamente heterogêneos e deficiência
intelectual
Aplicações atuais
Detecção de mutações:
Aplicações atuais
Diagnóstico pré-natal de aneuploidias:
• É realizado apenas em situações
específicas.
• Apenas em gestações consideradas
de risco para tal anormalidade -
gestantes de idade avançada.
• Aneuploidias dos cromossomos X
ou Y e trissomias dos cromossomos
21, 13 e 18 - resultam em síndromes
que causam um grande impacto na
saúde ou, ocasionam a morte do
indivíduo .
Permite identificar a origem cromossômica 
específica. Como fetos portadores de 
trissomias tem maior quantidade de DNA 
circulante no plasma materno proveniente do 
cromossomo adicional, a análise da 
proporção destes segmentos permite concluir 
se o feto é normal ou portador de alguma 
anomalia cromossômica. 
Aplicações atuais
Estudos epigenéticos:
• Estudo das mudanças na função dos genes sem que tenham
ocorrido mudanças na estrutura do DNA.
• Pode detectar pontos onde o DNA se encontra inativo
devido à metilação.
• Mapear pontos de ligação dos fatores de transcrição e
esclarecer sobre mecanismos de regulação epigenética.
Estes dados orientam o
prognóstico de algumas
doenças – como câncer.
Aplicações atuais
Microrganismos causadores de doenças:
• Conhecer a sequencia de DNA dos microrganismos
patogênicos:
• facilita o diagnóstico
• entendimento da patogenia
• desenvolvimento de tecnologias preventivas
• Evolução dos microrganismos
• Biodiversidade de espécies (vírus)
Aplicações atuais
Neoplasias:
• Extensamente utilizado para o diagnóstico de câncer,
• Em casos onde o diagnóstico convencional tenha
falhado ou para elaborar um diagnóstico molecular de
subtipos.
• Análises em células tumorais.
Foram encontradas uma série
de mutações associadas ao
desenvolvimento e progressão
da neoplasia.
Prevenção, com base no
conhecimento individual
de genótipos de risco
Perspectivas
Medicina personalizada:
• Doenças humanas de causa molecular, é possível o
desenvolvimento de testes moleculares ou genéticos que
melhor predigam respostas às terapias.
Farmacogenômica e Farmacogenética
Entender como os fatores genéticos
influenciam na resposta a medicamentos.
Assim, torna-se possível desenvolver
novas terapias e otimizar a utilização das
já existentes.
Perspectivas
sequenciaram todo o 
genoma de células 
cancerígenas extraídas 
de dois pacientes e de 
tecidos saudáveis 
extraídos das mesmas 
pessoas.
mutações encontradas 
apenas nos tecidos 
tumorais.
Foi possível reconstruir a 
“história biológica” celular e 
descobrir como, ao longo do 
tempo, as estruturas vão se 
modificando até se tornar 
maléficas.
Perspectivas
Medicina a distância:
• Universidade de Yale (2009):
• conseguiram diagnosticar e tratar um bebê a milhares de
quilômetros – a criança estava na Turquia.
Bebe de 5 meses –
Síndrome de Bartter(provoca perda de sal, 
potássio e água nos rins.
sequenciamento total do 
exoma - parte do genoma que 
contém os códigos proteicos.
Mutação nas duas cópias de um gene 
conhecido por causar diarreia 
clórida-congênita (trato 
gastrointestinal falha ao tentar 
absorver água e cloretos).
Perspectivas
Determinar, de um modo mais preciso, riscos
como os da exposição a vários tipos de radiações,
reagentes mutagênicos e toxinas em geral.
Identificação forense 
Paternidade
Melhoramento molecular 
de plantas - identificar 
regiões do genoma que 
contém genes de interesse 
econômico
Novas Fontes de energia
Monitores de poluição A limpeza de resíduos tóxicos 
– sem danos ao ambiente.
E se eu quiser sequenciar o meu 
genoma?
• Existem empresas que realizam testes genéticos 
e os vendem diretamente ao consumidor via 
internet:
Hoje nos EUA, já é possível mapear 42 genes 
por US$400 ou R$ 1.880,00
Risco de desenvolver doenças do coração, 
câncer, diabetes, Alzheimer, Parkinson, 
osteoporose...
Quanto custa um sequenciamento 
no Brasil?
http://laboratorio.genoma.ib.usp.br/search
Referências
• KINGSMORE, S. F.; LANTOS, J. D.; DINWIDDIE, D. L.; MILLER, N. A.; 
SODEN, S. E.; FARROW, E. G.; SAUNDERS, C. J. Next-generation 
community genetics for low- and middle-income countries. Genome 
Medicine. v.4(3), 25–32, 2012.
• GLISSEN, C.; HOISCHEN, A.; BRUNNER, H. G.; VELTMAN, J. A. Disease 
gene identification strategies for exome sequencing. European Journal of 
Human Genetics. v.20, 490–497, 2012.
• MELDRUM, C.; DOYLE, M. A.; TOTHILL,R. W. Next-generation 
sequencing for cancer diagnosis – a pratical perspective. Clin Biochem. 
V.32, 177-195, 2011.
• KUMAR, S.; NEI, M.; DUDLEY, J. et al. MEGA: a biologist-centric 
software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief 
Bioinform, v. 9, p. 299-306, 2008.
• SCHALLING, M.; HUDSON, T.J.; BUETOW, K.H.; HOUSMAN, D.E. -
Direct detection of novel expanded trinucleotide repeats in the human 
genome. Nature Genet. V.4, p. 135-9, 1993.
• VENTER, J.C.; ADAMS, M.D.; MYERS, E.W. ET AL - The sequence of the 
human genome. Science. V. 291, p. 1304-51, 2001.