AULA 7 - Agentes agressores do trato gastrointestinal Diagnóstico (2)

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Agentes agressores do trato 
gastrointestinal – Diagnóstico 
Prof. Dr. José Roberto Fogaça de Almeida 
Caso 2 
AULA 7 – Diagnóstico parasitológico e 
bioquímico de bactérias; 
Objetivos de Aprendizagem 
 
Compreender como são realizados as técnicas laboratoriais 
disponíveis para a concentração e visualização de diferentes 
parasitas. E um conjunto de provas bioquímicas necessárias 
para a identificação de bactérias. 
Quais Os Métodos De 
Cultivo? 
Inoculação: 
 
 Esgotamento por estrias – através de uma alça 
ou agulha realiza o esgotamento do material 
clinico no meio de cultura adequado 
 Semeadura da superfície – o inóculo é 
espalhado na superfície do ágar com uma alça 
de Drigalsky “formado de um L”. 
 “Pour Plate” (semeadura em profundidade) – o 
inóculo juntamente com meio de cultura fundido 
(45C) é vertido na placa de petri 
 Diluição- diluição seriada do inóculo, e semeado 
por esgotamento ou semeadura na superfície 
Quais Os Métodos De 
Cultivo? 
Técnica de esgotamento 
por estrias 
Técnica de esgotamento do 
inóculo 
Inoculação: 
 
 Esgotamento por estrias – através de uma alça 
ou agulha realiza o esgotamento do material 
clinico no meio de cultura adequado 
 Semeadura da superfície – o inóculo é 
espalhado na superfície do ágar com uma alça 
de Drigalsky “formado de um L”. 
 “Pour Plate” (semeadura em profundidade) – o 
inóculo juntamente com meio de cultura fundido 
(45C) é vertido na placa de petri 
 Diluição- diluição seriada do inóculo, e semeado 
por esgotamento ou semeadura na superfície 
Quais Os Métodos De 
Cultivo? 
Semeadura de superfície 
Métodos de cultivo em 
tubos 
COMO QUANTIFICAR 
OS 
MICRORGANISMOS? 
Contagem Indireta de Células: Contagem das 
colônias formadas em meios de cultura em 
placas (UFC/mL). 
Contagem Indireta 
Crescimento bacteriano 
•Algumas vezes é 
necessária a diluição da 
amostra 
•Geralmente são 
contadas de 30 a 300 
colônias por placa 
Crescimento bacteriano 
Contagem Indireta 
Morfologia das colônias; 
 
Morfologia microscópicas 
(Formas e arranjos); 
 
Composição da parede 
celular; 
 
Características/ Provas 
bioquímicas; 
 
Composição genética; 
QUAL BACTÉRIA É ESSA? 
Bactérias gram negativas 
Campylobacter jejuni 
Vibrio cholerae 
Espirilos Bacilos Cocobacilos Cocos 
Haemophylus spp. 
Pasteurella spp. 
Brucella spp. 
Bordetella 
pertussis 
Neisseria spp. 
OXIDASE - OXIDASE + 
Pseudomonas aeruginosa 
Acinetobacter spp. 
 
LACTOSE - LACTOSE + 
Shigella spp. 
Salmonella spp. 
Proteus spp. 
Yersinia spp. 
Klebsiella spp. 
E. coli 
Enterobacter spp. 
Citrobacter spp. 
Serratia spp. 
Bacilos gram negativas 
Oxidase negativa 
Motilidade + Motilidade - 
Citrato + Citrato - 
Klebsiella spp. Shigella spp. 
Yersina spp. 
Lactose + Lactose - 
Escherichia coli Dnase + Dnase - 
Voges-Proskauer- Voges-Proskauer+ 
Citrobacter spp. Enterobacter spp. 
Salmonella spp. 
Proteus spp. Urease + 
Citrato + Citrato - 
Urease - 
Oxidase; 
 
Fermentação de carboidratos; 
 
Produção de gás; 
 
Sulfeto de hidrogênio; 
 
Uréia; 
 
Indol; 
 
Motilidade; 
 
Lisina descarboxilase; 
 
TESTES BIOQUÍMICOS 
TESTE DA OXIDASE 
Cloridrato de p-
fenilenodiamina 
Cloridrato de p-
fenilenodiamina 
OXIDADA 
Citocromo C 
Oxidase 
Incolor Azul/ Roxo 
As bactérias que contêm o citocromo C como parte da sua cadeia respiratória são positivos 
para a oxidase e tornam o reagente púrpura. Os organismos que não contêm o citocromo C 
como parte da sua cadeia respiratória não oxidam o reagente, deixando-o incolor dentro dos 
limites de tempo do teste e, por isso, são negativos para a oxidase 
Fermentação Alguns meios de cultura tem o vermelho de fenol (Indicador de 
pH) – Em pH ácido fica Amarelo e em pH básico Vermelho; 
Quando um açúcar é metabolizado 
libera ácidos orgânicos, acidificando 
o meio de cultura; 
 
Glicose, lactose, sacarose, manose, 
sorbitol, manitol, xilose, adonitol, 
ranose e etc 
TESTES BIOQUÍMICOS 
TSI 
Meio TSI (Triple Sugar Iron) 
Na rampa do tubo – Glicose; 
No fundo do tubo – Lactose e Sacarose; 
No fundo do tubo – Tiossulfato de sódio – H2S; 
Ágar rasgado – Formação de gás; 
Tiossulfato de sódio  H2S 
 
 H2S + (NH4)2(SO4)2 FeS 
 
o sulfureto de hidrogénio (produzido a partir de tiossulfato de sódio) reage ao sal de 
amónio ferroso, resultando num sulfureto de ferro. 
TESTES BIOQUÍMICOS 
TSI 
TESTES BIOQUÍMICOS 
Motilidade 
Capacidade da bactéria se mover – Inocular a bactéria em meio 
de cultura com 0,5% de ágar 
Indol 
Capacidade da bactéria de degradar o triptofano – Bactérias que 
degradam triptofano produzem indol que quando reage com o 
reagente de Kovacs ganha a coloração vermelha; 
Motilidade Indol 
TESTES BIOQUÍMICOS 
Urease 
Capacidade da bactéria de degradar o uréia em amônia – Meio com 
vermelho de fenol; 
Urease 
Lisina descarboxilase 
No meio Lisina descarboxilase se ocorre a fermentação de glicose abaixa o pH 
e este fica amarelo. Se ocorrer atividade da enzima lisina descarboxilase o pH 
aumentará, devido a transformação da lisina em uma amina primária: a 
cadaverina , e o meio voltará a apresentar uma coloração roxa; 
TESTES BIOQUÍMICOS 
Produção de gás por fermentação da glicose/ produção de H2S/ Hidrólise 
da uréia/ Desaminação do triptofano. 
TESTES BIOQUÍMICOS 
EPM 
Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou 
deslocamento do meio do fundo do tubo; 
 
Produção de H2S: O meio fica negro em 
qualquer intensidade; 
 
Hidrólise da Uréia: Aparecimento de 
coloração azul ou verde azulada (reação fraca) 
que se estende para a base do meio; 
 
Desaminação do Triptofano: Aparecimento 
de coloração verde-garrafa na superfície do 
meio. Quando a reação é negativa a superfície 
do meio adquire cor azul ou raramente 
amarela; 
Motilidade/ Produção de indol/ Descarboxilação da lisina. 
TESTES BIOQUÍMICOS 
miLi 
Motilidade: A bactéria móvel cresce além da 
picada turvando parcial ou totalmente o meio. 
A bactéria imóvel cresce somente na picada; 
 
Descarboxilação da Lisina: Quando a lisina é 
descarboxilada, o meio adquire cor púrpura. 
Quando o aminoácido não é utilizado, o meio 
adquire cor amarela nítida nos seus 2/3 
inferiores; 
 
Produção do Indol: Após leitura dos testes 
de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas do 
Reativo de Kovacs a superfície do meio e 
agitar levemente. Quando a bactéria produz 
Indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. 
Quando não produz, o reativo mantém sua cor 
inalterada. 
Bactéria 
fermenta 
glicose 
Amarelo 
Bactéria 
fermenta 
glicose 
Amarelo 
E forma gás 
Bactéria 
forma H2S 
Preto 
Bactéria 
possui urease 
Azul 
Bactéria 
desamina o 
triptofano 
Verde 
Exame parasitológico de Fezes (EPF) 
 As amostras de fezes devem ser colhidas a fresco, recém-evacuadas ou obtidas 
diretamente do reto (grandes animais). As amostras devem ser mantidas sempre 
em refrigeração (2-8°C) e transportadas para o laboratório em recipientes 
térmicos, isopor com gelo de preferência reciclável; 
 Às vezes é necessário realizar a coleta de no mínimo três amostras de fezes 
para cada animal, sendo essas amostras colhidas em dias alternados, pois os 
estágios parasitários são eliminados de forma intermitente nas fezes dos 
animais. 
 
 Exame Macroscópicos: Avalia a consistência das fezes, odor e presença de 
elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou partes dele 
 Exame Microscópico: Visualização de ovos ou larvas de helmintos, cistos, 
trofozoítos ouoocistos de protozoários. 
 
Há diferentes técnicas laboratoriais disponíveis para a concentração e visualização 
desses estágios parasitários nas amostras fecais. Essas técnicas laboratoriais são 
preparadas de acordo com um princípio básico que envolve a flutuação ou a 
sedimentação. 
Flutuação espontânea (Willis-Mollay) 
Centífugo-flutuação (Faust) 
 
 
Sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janer) 
Sedimentação por centrifugação (Blagg ou Ritchie) 
 
Concentração de larvas por migração ativa (Rugai) 
Concentração de ovos (Kato) 
Exame parasitológico de Fezes (EPF) 
Método Processo de concentração 
das formas parasitárias 
Formas parasitárias que 
podem ser encontradas 
Direto Não utiliza processo de 
concentração 
Ovos e larvas de helmintos, 
cistos e trofozoítos de 
protozoários 
Hoffman, Pons e Janer Sedimentação espontânea Ovos e larvas de helmintos, 
cistos e trofozoítos de 
protozoários 
 
Ritchie Sedimentação por 
centrifugação 
Ovos e larvas de helmintos, 
cistos e trofozoítos de 
protozoários 
Faust Centrífugo flutuação Ovos leves e principalmente 
cistos de protozoários 
 
Willis Flutuação espontânea Ovos leves, não é indicado 
para a pesquisa de cistos 
 
Rugai Migração ativa das larvas Larvas de helmintos 
Kato Clarificação das fezes Ovos de parasitas 
Exame Direto 
 Colocar 2 a 3 gotas de salina (0,85%) em uma lâmina; 
 Tocar, com a ponta do palito, em vários pontos das fezes 
transferindo uma pequena porção para a lamina 
 Espalhar as fezes na lâmina (A espessura do esfregaço não deve 
impedir a passagem da luz); 
 Usar a coloração de Lugol; 
Método de Willis (Flutuação espontânea) 
 Diluir 10g de fezes em um frasco Borrel e diluir com uma solução 
saturada de NaCl; 
 
 Completar o volume até a borda do frasco; 
 
 Colocar na boca do frasco uma lâmina, que deverá estar em contato 
com o líquido. Deixar em repouso por 10 minutos; 
 
 Após esse período, retirar rapidamente a lâmina, voltando a parte 
molhada para cima e colocar uma lamínula; 
 
 
Método de Faust (centrífugo-flutuação) 
 Diluir 10g de fezes em 20 mL de água e homogeneizar bem; 
 
 Filtrar por meio de gaze dobrada em quatro, num copo plástico, e 
transferir para um tubo de Wasserman; 
 
 Centrifugar por um minuto a 2500 rpm, desprezar o líquido 
sobrenadante e ressuspender o sedimento em água. Repetir mais 4 
vezes até que o sobrenadante fique claro; 
 
 Ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 
33% (Densidade 1,18g/mL); 
 
 Centrifugar por um minuto a 2500 rpm. Os cistos e os ovos leves, 
presentes na amostra fecal, estarão na película superficial. Recolher 
a película com alça de platina, colocar numa lâmina, acrescentar uma 
gota de lugol e cobrir com lamínula; 
 
 
 
Método de Hoffman, Pons e Janer 
(Sedimentação espontânea) 
 Colocar 2 gramas de fezes em um copo de plástico (Ou frasco borel) 
com 5 mL de água e triturar bem com bastão de vidro, ou palito de 
picolé; 
 
 Acrescentar mais 20 mL de água; 
 
 Filtrar a suspensão para um cálice cônico de 200 mL de capacidade 
por intermédio de uma tela metálica ou gaze cirúrgica dobrada em 
quatro. Os detritos retidos são lavados com mais de 20 mL de água, 
agitando-se constantemente com o bastão de vidro, devendo o 
líquido da lavagem ser recolhido no mesmo cálice; 
 
 Completar o volume do cálice com água e deixar a suspensão em 
repouso durante 2 a 24 horas; 
 
 Colher o sedimento com uma pipeta; 
 
 Dissolver em um copo plástico aproximadamente 1 a 2 gramas de fezes com 
água destilada até obter uma mistura homogênea. Peneirar a mistura para 
outro copo plástico no intuito de remover as partículas grosseiras; 
 
 Preencher um tubo plástico ou de vidro apropriado para centrífuga com a 
mistura até atingir o volume de oito ml. Adicionar três ml de éter, tampar e 
agitar vigorosamente.; 
 
 Centrifugar a 1000 rpm durante três minutos; 
 
 Os ovos de elevada densidade irão acumular no sedimento no fundo do 
frasco. Desprezar o sobrenadante e recolher o sedimento com o auxílio de 
uma pipeta. Depositar uma a duas gotas do sedimento em uma lâmina de 
vidro. Adicionar uma lamínula sobre o material e observar no microscópio. 
Método de Blagg ou Ritchie (Sedimentação por 
centrifugação) 
Método de Rugai (Migração ativa das larvas) 
 Teste que só pode ser feita com fezes frescas; 
 Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-lo 
em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena “trouxa”; 
 Colocar o material assim preparado, com abertura voltada para 
baixo, num cálice de sedimentação, contendo água aquecida (45⁰C), 
em quantidade suficiente para entrar m contato com as fezes; 
 Deixar uma hora em repouso; 
 Colher o sedimento no fundo do cálice, com a ajuda de uma pipeta; 
 
 Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente; 
 
 Comprimir a tela de náilon sobre as fezes (pelos orifício passam os ovos de 
helmintos e os detritos menores); 
 
 Com a espátula do kit, raspar uma pequena quantidade das fezes passadas 
pela malha, e preencher o orifício central do cartão de plástico, o qual deve 
estar colocado sobre a lâmina de vidro, nivelando a superfície; 
 
 Com a lamínula de celofane embebida em Verde Malaquita a 3%, cobrir as 
fezes; 
 
 Deixar a preparação e m repouso por 1 ou 2 horas e realizar a leitura em 
microscópio ótico; 
Método de Kato Katz (Migração ativa das 
larvas) 
???????????? 
1) Quais são as características das enterobactérias? Cite 2 bactérias 
pertencentes dessa família? 
2) No teste de Indol avaliamos se a bactéria é capaz de degradar qual 
aminoácido? 
3) No meio TSI avaliamos quais funções bioquímicas? Se fica amarelo é positivo 
ou negativo? Porquê? 
4) Porque consideramos a bactéria H2S positivo se o TSI fica com a base preta? 
5) Por que no método de Willis e Faust avaliamos a superfície da solução? Qual a 
diferença entre esses métodos? 
SEXTOU 2 VEZES !!!!!!!!!!!!!!!